Ein optimiertes O9-1/Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in Neuralleistenzellen

Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine Gruppe von Stammzellen während der Embryogenese von Wirbeltieren mit einer bemerkenswerten Fähigkeit zu wandern und zur Entwicklung verschiedener Organe und Gewebe beizutragen. NCCs können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren, einschließlich sensorischer Neuronen, Knorpel, Knochen, Melanozyten und glatter Muskelzellen, abhängig von der Lage des axialen Ursprungs und der lokalen Umweltführung des NCC^1,2. Mit der Fähigkeit, sich in eine Vielzahl von Zelltypen zu differenzieren, können genetische Anomalien, die in jedem Stadium der Neuralleistenentwicklung (NC) eine Dysregulation verursachen, zu zahlreichen angeborenen Erkrankungen führen². Zum Beispiel führen Störungen während der Bildung, Migration und Entwicklung von NCCs zu Entwicklungsstörungen, die zusammen als Neurokristopathien^1,3bekannt sind. Diese Krankheiten reichen von kraniofazialen Defekten aufgrund eines Versagens der NCC-Bildung, wie dem Treacher-Collins-Syndrom, bis hin zur Entwicklung verschiedener Krebsarten aufgrund der metastasierenden Migrationsfähigkeit des NCC, wie sie beim Melanom^3,4,5,6beobachtet wird . In den letzten Jahrzehnten haben Forscher bemerkenswerte Entdeckungen über die Rollen und Mechanismen von NCCs in der Entwicklung und bei Krankheiten gemacht, wobei sich die Mehrheit der Ergebnisse auf chemische Signale konzentriert^7,8. In jüngerer Zeit wurde darauf hingewiesen, dass mechanische Signale eine kritische, aber wenig verstandene Rolle in der NCC-Entwicklung^{spielen 9,10}.

Die Umwelthinweise von NCCs spielen während ihrer Entwicklung eine entscheidende Rolle, einschließlich der Regulierung der NCC-Differenzierung in verschiedene Zelltypen. Umwelteinflüsse, z. B. physikalische Hinweise, beeinflussen das entscheidende Verhalten und die zellulären Reaktionen, wie z. B. die funktionelle Diversifizierung. Die Mechanotransduktion ermöglicht es den Zellen, diese Hinweise zu spüren und darauf zu reagieren, um verschiedene biologische Prozesse aufrechtzuerhalten². NCCs sind von benachbarten Zellen und verschiedenen Substraten wie der extrazellulären Matrix (ECM) umgeben, die mechanische Reize hervorrufen können, um die Homöostase aufrechtzuerhalten und sich durch Schicksalsbestimmung, Proliferation und Apoptose an die Veränderungen anzupassen¹¹. Die Mechanotransduktion beginnt an der Plasmamembran, wo die sensorische Komponente mechanischer extrazellulärer Reize auftritt, was zur intrazellulären Regulation der Zelle^{führt 12}. Integrine, fokale Adhäsionen und Verbindungen der Plasmamembran leiten mechanische Signale wie Scherkräfte, Spannung und Steifigkeit der umgebenden Substrate in chemische Signale um, um zelluläre Reaktionen zu erzeugen¹². Die Weiterleitung chemischer Signale von der Plasmamembran zur endgültigen zellulären Regulation erfolgt über verschiedene Signalwege, um lebenswichtige Prozesse für den Organismus, wie z.B. die Differenzierung, abzuschließen.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass die mechanische Signalübertragung aus der Substratsteifigkeit eine Rolle bei der Zelldifferenzierung spielt^13,14. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs), die auf weichen Substraten mit einer Steifigkeit ähnlich der von Hirngewebe (im Bereich von 0,1-1,0 kPa) gezüchtet wurden, zu einer neuronalen Zelldifferenzierung führten^15,16. Allerdings differenzieren sich mehr MSCs in myozytenähnliche Zellen, wenn sie auf 8-17 kPa-Substraten gezüchtet werden, die die Steifigkeit des Muskels nachahmen, während osteoblastenartige Differenzierung beobachtet wurde, wenn MSCs auf steifen Substraten kultiviert wurden (25-40 kPa)^15,16. Die Bedeutung der Mechanotransduktion wird durch die Unregelmäßigkeiten und Anomalien im mechanischen Signalweg hervorgehoben, die möglicherweise zu schweren Entwicklungsdefekten und -krankheiten führen, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Osteoporose^17,18,19. Bei Krebserkrankungen ist normales Brustgewebe weich, und das Brustkrebsrisiko steigt in steifem und dichtem Brustgewebe, einer Umgebung, die eher Brusttumoren^{ähnelt 15}. Mit diesem Wissen können die Auswirkungen der mechanischen Signalgebung auf die NCC-Entwicklung durch einfache Manipulation der Substratsteifigkeit durch ein In-vitro-System untersucht werden, was weitere Vorteile und Möglichkeiten zum Verständnis der Grundlagen des NC-bedingten Krankheitsverlaufs und der Ätiologie bietet.

Um den Einfluss mechanischer Signale in NCCs zu untersuchen, haben wir ein effizientes In-vitro-System für NCCs etabliert, das auf der Optimierung zuvor veröffentlichter Methoden und der Bewertung der Reaktionen von NCCs auf verschiedene mechanische Signale basiert^20,21. Es wurde ein detailliertes Protokoll für die unterschiedliche Vorbereitung der Hydrogelsteifigkeit und die Bewertung der Auswirkungen der mechanischen Signalgebung in NCCs bereitgestellt. Um dies zu erreichen, werden O9-1 NCCs als NC-Modell verwendet, um die Auswirkungen und Veränderungen als Reaktion auf steife gegenüber weichen Hydrogelen zu untersuchen. O9-1 NCCs sind eine stabile NC-Zelllinie, die am Tag 8.5 aus dem Mausembryo (E) isoliert wurde. O9-1 NCCs ahmen NCCs in vivo nach, weil sie sich in definierten Differenzierungsmedien in verschiedene NC-abgeleitete Zelltypen differenzieren können²². Um die mechanische Signalisierung von NCCs zu untersuchen, wurde ein Matrixsubstrat mit abstimmbarer Elastizität aus unterschiedlichen Konzentrationen von Acrylamid- und Bisacrylamidlösungen hergestellt, um die gewünschte Steifigkeit zu erreichen, die der biologischen Substratsteifigkeit^20,21,23entspricht. Um die Bedingungen des Matrixsubstrats für NCCs, insbesondere O9-1-Zellen, zu optimieren, wurden Modifikationen aus dem zuvor veröffentlichten Protokoll²⁰vorgenommen. Eine Änderung in diesem Protokoll bestand darin, Hydrogele in Kollagen I, verdünnt in 0,2% Essigsäure anstelle von 50 mM HEPES, bei 37 ° C über Nacht zu inkubieren. Der niedrige pH-Wert der Essigsäure führt zu einer homogenen Verteilung und einem höheren Kollagen-I-Einbau, wodurch eine gleichmäßigere Bindung des ECM-Proteins²⁴ermöglicht wird. Darüber hinaus wurde eine Kombination aus Pferdeserum und fetalem Rinderserum (FBS) in Konzentrationen von 10% bzw. 5% in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) verwendet, bevor die Hydrogele im Inkubator gelagert wurden. Pferdeserum wurde als zusätzliche Ergänzung zu FBS aufgrund seiner Fähigkeit verwendet, die Zellproliferation und -differenzierung bei einer Konzentration von 10% zu fördern²⁵.

Mit dieser Methode wurde eine biologische Umgebung durch die ECM-Proteinbeschichtung (z. B. Kollagen I) nachgeahmt, um eine genaue In-vitro-Umgebung für NCCs zu schaffen, um zu wachsen und zu überleben^20,21. Die Steifigkeit der präparierten Hydrogele wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM), einer bekannten Technik zur Darstellung des Elastizitätsmoduls^26,quantitativ analysiert. Um die Wirkung unterschiedlicher Steifigkeitsniveaus auf NCCs zu untersuchen, wurden Wildtyp-O9-1-Zellen kultiviert und auf Hydrogelen für die Immunfluoreszenz (IF) -Färbung gegen filamentöses Aktin (F-Aktin) vorbereitet, um die Unterschiede in der Zelladhäsion und Morphologie als Reaktion auf Veränderungen der Substratsteifigkeit zu zeigen. Mit diesem In-vitro-System werden die Forscher in der Lage sein, die Rolle der mechanischen Signalgebung in NCCs und ihre Wechselwirkung mit anderen chemischen Signalen zu untersuchen, um ein tieferes Verständnis der Beziehung zwischen NCCs und mechanischer Signalgebung zu erlangen.

1. Hydrogel-Zubereitung

HINWEIS: Alle Schritte müssen in einer Zellkulturhaube durchgeführt werden, die vor Gebrauch mit Ethanol desinfiziert und ultraviolett (UV)-sterilisiert wurde, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Werkzeuge wie Pinzetten und Pipetten müssen mit Ethanol besprüht werden. Pufferlösungen müssen ebenfalls sterilfiltriert werden.

1. Herstellung von Aminosilan-beschichteten Glas-Deckgläsern
   1. Legen Sie die gewünschte Anzahl von Glasdeckgläsern auf ein Stück Labortuch.
      HINWEIS: Bereiten Sie zusätzliche 3-4 Deckgläser vor, um ausreichende Backup-Vorräte zu gewährleisten, da sie leicht brechen. Verschiedene Materialien von Glasdeckgläsern führen zu einer unterschiedlichen Kompatibilität der Zellaussaat und -befestigung. Es ist besser zu bestimmen, welcher Typ am besten zum Experiment passt, bevor Sie mit den Experimenten beginnen (siehe Materialtabelle).
   2. Verwenden Sie einen Alkoholbrenner oder Bunsenbrenner, um jeden Deckglas zu sterilisieren, indem Sie ihn durch die Flamme hin und her führen (30 s für Protein-Assay-Experimente). Legen Sie jedes Glasdeckglas auf ein Labortuch, um sich abzukühlen.
   3. Sobald die Glasdeckgläser abgekühlt sind, übertragen Sie sie auf eine mit Parafilm ausgekleidete Petrischale, um ein Verrutschen zu verhindern.
      HINWEIS: Wenn die Deckgläser nicht kühl genug sind, schmilzt die Restwärme den Parafilm auf die Zettel und macht sie unbrauchbar.
   4. Decken Sie die Deckgläser mit ca. 200 μL und 800 μL 0,1 M NaOH für einen 12 mm bzw. einen 25 mm Deckglas ab und lassen Sie sie 5 min ruhen. Dann saugen Sie die 0,1 M NaOH ab und lassen Sie die Deckgläser für weitere 5 minuten an der Luft trocknen, um einen gleichmäßigen Film zu bilden.
   5. Sobald die Deckgläser getrocknet sind, werden etwa 80 μL und 150 μL 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTS) für 12 mm bzw. 25 mm Deckgläser pipettiert. Achten Sie darauf, dass die Lösung nicht auf den Parafilm verschüttet wird. Lassen Sie die Lösung 5 Minuten einwirken.
   6. Aspirieren Sie so viel überschüssiges APTS wie möglich und lassen Sie das verbleibende APTS 5 min trocknen. Spülen Sie die Deckgläser gut ab, indem Sie sie dreimal für jeweils 5 min in steriles, deionisiertes (DI)_H2Otauchen.
      HINWEIS: Wenn die Glasdeckgläser nicht gut gespült werden, verursacht das verbleibende APTS unerwünschte Reaktionen mit Glutaraldehyd, wodurch sich ein weißer Niederschlag bildet und unbrauchbare Deckgläser entstehen.
   7. Bewegen Sie die Deckgläser mit der reaktiven Seite nach oben in eine neue Petrischale. Geben Sie genügend 0,5% Glutaraldehyd in die Petrischale, um die Deckgläser vollständig abzudecken, und lassen Sie die Deckgläser 30 Minuten einwirken.
   8. Das 0,5%ige Glutaraldehyd absaugen und die Deckgläser erneut in DI_H2Oeinmalig für 3 min abspülen. Stellen Sie die Deckgläser mit der reaktiven Seite nach oben auf ein Labortuch oder eine saubere Petrischale, um sie vor dem Gebrauch vollständig an der Luft zu trocknen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Deckgläser müssen bis zur Verwendung in steriles DI_H2Oeingelegt werden.
2. Herstellung von silikonisierten Deckgläsern
   1. Die gleiche Anzahl von Deckgläsern wie die mit Aminosilan beschichteten Deckgläser (Schritt 1.1.1) in eine mit Parafilm ausgekleidete Petrischale geben.
   2. 40 μL oder 150 μL für 12 mm bzw. 25 mm Deckgläser aus Dichlormethylsilan (DCMS) auf eine Seite des Deckglases pipettieren und die Lösung 5 min ruhen lassen.
   3. Die verbleibende Lösung aus dem Deckglas absaugen, 1 min lang in sterilem DI_H2Owaschen und die reaktiven Deckgläser mit der Vorderseite nach oben auf ein Labortuch legen, um sie vollständig an der Luft zu trocknen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
3. Hydrogele zubereiten
   1. Mischen Sie Acrylamid, Bisacrylamid und DI_H2Oin einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, um 500 μL Lösungen mit unterschiedlichen Steifigkeiten herzustellen (siehe Tabelle 1). Vortex die Lösung für 30 s, um es gründlich zu mischen.
   2. Schnell arbeiten, die 10% ige Ammoniumpersulfatlösung (APS) und das Tetramethylethylendiamin (TEMED) in das Röhrchen geben und die Lösungen erneut verwirbeln, um die Lösungen zu mischen.
      HINWEIS: Bereiten Sie frisches 10% APS zu und lassen Sie es auf Eis oder gefrieren Sie es aufgrund seines empfindlichen Gefrier- / Auftauzyklus zu Einweg-Aliquots.
   3. Etwa 33 μL oder 100 μL der Lösung werden auf die getrockneten 12 mm bzw. 25 mm aminosilanbeschichteten Deckgläser pipettiert (Abschnitt 1.1).
   4. Legen Sie mit einer gekrümmten Pinzette sofort den DCMS-behandelten Deckglas auf die Gellösung, wobei die behandelte Seite die Gellösung berührt, wodurch die Gellösung zwischen dem DCMS-behandelten Deckglas und dem aminosilanbeschichteten Deckglas eingeklemmt wird.
   5. Lassen Sie die Gellösung für 5-15 min polymerisieren, während Sie aktiv auf die Gelpolymerisation der übrig gebliebenen Lösung im Röhrchen achten.
   6. Sobald das Gel polymerisiert ist, trennen Sie den DCMS-behandelten Deckglas mit einer gekrümmten Pinzette oder einer Rasierklinge, wobei das Gel an dem ursprünglichen aminosilanbeschichteten Deckglas befestigt bleibt.
   7. Legen Sie den Deckglas mit dem angebrachten Hydrogel sofort in eine vorgegebene 4-Well/24-Well- und 6-Well-Platte, die mit 500 μL und 2 mL sterilem PBS oder DI H_2Ofür 12 mm bzw. 25 mm Deckgläser bedeckt ist, um ein Austrocknen des Gels zu verhindern.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.4-1.3.7 für alle Deckgläser.
   9. Die Hydrogele werden 30 min lang in steriles PBS oder DI_H2Ogetaucht, um überschüssige Acrylamidlösung zu entfernen. Lagern Sie die Hydrogele in sterilem PBS oder DI_H2Obei 4 °C für einen Verfahrensstopp hier.
   10. In einem dunklen Raum wird das Sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)-hexanoat(sulfo-SANPAH)-Gemisch hergestellt, indem 2,5 mL 50 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure(HEPES) (pH=8,5) mit 25 μL der 50 μg/ml Sulfo-SANPAH in einem konischen Röhrchen gemischt werden, das zum Schutz vor Licht in Aluminiumfolie eingewickelt ist. Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung vor der Verwendung gut zu mischen.
       HINWEIS: Ein Volumen von 2,5 ml Sulfo-SANPAH-Lösung reicht für etwa fünfundzwanzig 12-mm-Hydrogele oder fünf 25-mm-Hydrogele aus.
   11. Saugen Sie PBS oder DI_H2Oaus der Vertiefungsplatte ab. Fügen Sie etwa 100 μL oder 500 μL für 12 mm bzw. 25 mm Deckgläser sulfo-SANPAH-Lösung (Schritt 1.3.10) hinzu, um das Gel zu bedecken. Stellen Sie sicher, dass die Lösung das Gel vollständig bedeckt.
       HINWEIS: Stellen Sie die Vakuumsaugstärke ein, um zu verhindern, dass die starke Kraft die Hydrogele zerreißt oder stört.
   12. Legen Sie die Gele mit der Lösung unter ein 15 W, 365 nm UV-Licht für 10 min, unbedeckt, um jede Interferenz des UV-Lichts, das mit dem Sulfo-SANPAH reagiert, zu minimieren.
   13. Aspirieren Sie das überschüssige Sulfo-SANPAH, indem Sie die Platte kippen, um so viel wie möglich von der Lösung zu sammeln. Waschen Sie das Gel mit 50 mM HEPES zwei- bis dreimal.
   14. 500 μL und 2 ml für 12 mm bzw. 25 mm Gele mit 50 mg/ml Kollagen I, verdünnt in 0,2 % Essigsäure, in jede Vertiefung geben, die das Hydrogel enthält. Lassen Sie die Gele über Nacht in einem 37 °C, 5% CO 2-Inkubator inkubieren.
       HINWEIS: Verdünnen Sie Kollagen I in 0,2% Essigsäure anstelle von 50 mM HEPES, um eine homogene Verteilung und Bindung von Kollagen I zu fördern.
   15. Aspirieren Sie das Kollagen I und waschen Sie die Gele dreimal mit sterilem PBS, um überschüssiges Kollagen I für 5 Minuten pro Wäsche zu entfernen. Inkubieren Sie die Hydrogele in PBS mit 10% Pferdeserum, 5% FBS für 2 h im 37 °C, 5%_CO2 Inkubator.
       HINWEIS: Die Zugabe von 10% Pferdeserum fördert eine höhere Proliferation im Vergleich zur ausschließlichen Verwendung von FBS, wie in der vorherigen Veröffentlichung.
   16. Aspirieren Sie das Medium. Geben Sie 500 ml sterilfiltriertes Modifiziertes Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S) zu jeder Vertiefung hinzu. Lagern Sie die Gele im 37 °C, 5% CO2-Inkubator, bis sie für die Zellkultur bereit sind.
   17. Fertig, etwa 1,5 × 10^{4 O9-1} Zellen/cm2 in Basalmedium in die Kulturschalen geben. Inkubieren Sie die Zellen für 2 Tage in einem Inkubator bei 37 ° C, 5%_CO2. Überprüfen Sie die Zellen auf Konfluenz, um sicherzustellen, dass die Zellen ausreichend an Gele gebunden sind und dass die Anzahl der Zellen ausreicht, bevor Sie sie zur Analyse sammeln.
       HINWEIS: Siehe das zuvor veröffentlichte Protokoll für die Schritte der Wiederherstellung, Passage und Sammlung von O9-1-Zellen²⁰.
   18. Fahren Sie mit den Abschnitten 2, 3 oder 4 fort, um die Hydrogele weiter zu analysieren.

2. Quantitative Analyse der Steifigkeit mittels AFM

1. Starten Sie den AFM-Systemcomputer, gefolgt vom AFM-Controller (siehe Tabelle der Materialien).
2. Montieren Sie den AFM-Freischwinger am AFM-Sondenhalter. Verwenden Sie einen sphärischen Cantilever mit einer 0,5 μm Silica-Perle, die am Ende des Cantilevers montiert ist (Cantilever mit kugelförmiger Perle).
   HINWEIS: Für steifere Hydrogele wie 10 kPa, 20 kPa und 40 kPa wurde eine steifere Sonde mit der Federkonstante von 0,24 N/m verwendet. Für weichere Hydrogele wie 0,5 kPa und 1 kPa wurde eine weichere Sonde mit einer Federkonstante von 0,059 N/m verwendet.
3. Stellen Sie die AFM-Software in den Kontaktmodusein.
4. Montieren Sie den Siliziumwafer auf dem AFM-Probentisch, um Kraftkurven zu sammeln, indem Sie auf Engage klicken, damit der Cantilever das Siliziumsubstrat berührt und so die Kraftkurven erzeugt.
5. Verwenden Sie die oben genannten Kraftkurven (2.4) für die Kalibrierung, klicken Sie in der Steuerungssoftware auf Kalibrieren, um eine durchschnittliche Federkonstante des Cantilevers unter thermischen Tune-Bedingungen zu erhalten, und speichern Sie die kalibrierten Werte in der Steuerungssoftware.
6. Montieren Sie die Proben, indem Sie den Deckglas mit dem angebrachten Hydrogel in einer 60-mm-Petrischale auf die AFM-Scanstufe legen. Geben Sie 3 ml PBS in die Schale, bevor Sie Messungen durchführen, um zu verhindern, dass das Gel austrocknet.
7. Stellen Sie den AFM so ein, dass er im Kontaktmodus (Flüssigkeit) arbeitet, um die Messung zu starten. Aktivieren Sie die kugelförmige Perle, um die Gelprobe kontinuierlich zu berühren und zu heben.
8. Stellen Sie den Ausleger so ein, dass seine Auslenkungsschwelle bei 10 nm bleibt. Halten Sie die Rampengröße der Sonde bei 10 μm. Notieren Sie dann die Kraftkurven wie in Schritt 2.4.
9. Erfassen Sie mindestens 20 Kraftkurven von mindestens 3 bis 10 verschiedenen Stellen auf der Oberfläche des Hydrogels.
10. Berechnen Sie den durchschnittlichen Elastizitätsmodul von ~ 20 Kraftkurven für jeden Punkt mit AFM-Bildgebungs- und Analysesoftware. Verwenden Sie verlängerte Rampenkraftkurven und ein linearisiertes Modell (sphärisch). Berechnen Sie den Durchschnitt aller Stellen für jede Probe, um die endgültige Steifigkeit zu erhalten.
    HINWEIS: Der Elastizitätsmodul und zugehörige Daten(d. h. Standardabweichungen) werden automatisch als Tabellenkalkulation gespeichert.
11. Wiederholen Sie die Schritte 2.6-2.10 für alle Samples.

3. Molekulare Analyse der Steifigkeit durch Immunfluoreszenzfärbung

1. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Deckglas auf eine neue Platte zu transportieren, um falsche Signale von Zellen zu minimieren, die direkt auf die Platte gezüchtet werden. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL sterilem PBS, um abgestorbene Zellen und verbleibendes Kulturmedium zu entfernen.
2. Fixieren Sie die Zellen mit 500 μL 4% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min bei Raumtemperatur, ungestört. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL PBS / Well für jeweils 2 min.
   HINWEIS: Für einen Verfahrensstopp bei 4 °C aufbewahren.
3. Behandeln Sie die Zellen mit 500 μL 0,1% Triton X-100 für 15 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL PBS / Well.
4. Blockieren Sie die Zellen mit 250 μL 10% Eselserum (verdünnt in PBS und 0,1% Tween 20) pro Vertiefung für 30 min bei Raumtemperatur.
5. Inkubieren Sie die Zellen mit 250 μL primären Antikörpern für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL PBS / Well für jeweils 5 min.
   HINWEIS: Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) und Anti-AP2 alpha (1:250) wurden in diesem Experiment verwendet und in 10% Eselserum verdünnt.
6. Inkubieren Sie die Zellen mit entsprechenden sekundären Antikörpern und/oder Phalloidin, die für die F-Aktin-Färbung verwendet werden, bei einer Verdünnung von 1:400 in 250 μL 10% Eselserum für 30 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
   HINWEIS: 568 nm Phalloidin kann mit 488 nm oder 647 nm sekundären Antikörpern oder allein co-inkubiert werden.
7. Inkubieren Sie die Zellen mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:1000 Verdünnung) in 250 μL PBS für 10 min, gefolgt von einer letzten Wäsche PBS für 2 min.
8. Fügen Sie jedem Bohrloch 3-4 Tropfen Montagemedium hinzu. Lagern Sie die Proben bei 4 °C, um sie vor der Bildgebung für mindestens 2 h einzustellen, um sicherzustellen, dass das Montagemedium richtig eingestellt ist.
9. Erfassen Sie Bilder von mindestens 3 zufälligen Bildern pro Hydrogelprobe mit einem Fluoreszenzmikroskop und erzeugen Sie einzelne und verschmolzene Kanäle.

4. Quantitative real-time PCR (RT-qPCR)

1. Übertragen Sie die Hydrogele mit den adhärenten Zellen für die RNA-Sammlung auf eine neue Platte, um unerwünschte RNA von Zellen, die an die Zellplatte gebunden sind, zu minimieren. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, um abgestorbene Zellen und Kulturmedium zu entfernen.
2. Extrahieren Sie die gesamte mRNA mit einem RNA-Extraktionskit. Führen Sie die umgekehrte Transkription von RNA in cDNA mit einem Reverse-Transkriptions-Supermix gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
3. Führen Sie RT-qPCR mit Primern für Vcl als Steifigkeitsmarker der Wahl durch und analysieren Sie mit der 2^{-ΔΔCT-Methode.}
   HINWEIS: Primer-Sequenz von Vcl: Forward 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; reverse 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Hydrogelvorbereitung und Steifigkeitsbewertung durch AFM und das Hertz-Modell
Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit bereitgestellt, indem das Verhältnis von Acrylamid und Bisacrylamid reguliert wird. Die Polyacrylamid-Hydrogele sind jedoch aufgrund des Mangels an ECM-Proteinen nicht bereit für die Adhäsion von Zellen. So bindet Sulfo-SANPAH, das als Linker fungiert, kovalent an die Hydrogele und reagiert mit den primären Aminen von ECM-Proteinen, um die Adhäsion von ECM-Proteinen an den Oberflächen der Hydrogele über den N-Hydroxysuccinimidester in Sulfo-SANPAH nach UV-Aktivierung zu ermöglichen. Kollagen Typ I wurde als ECM-Protein der Wahl verwendet, um die O9-1-Zellbindung effektiv zu fördern. Um genaue Steifigkeitswerte verschiedener Hydrogele zu gewährleisten, wurde eine Steifigkeitsbeurteilung mit AFM durchgeführt, einer bekannten Technik zur Darstellung des Elastizitätsmoduls.

Nach erfolgreicher Bildung und Befestigung des Polyacrylamid-Hydrogels am Glasdeckglas blieb das Gel mit einer gleichmäßigen Oberfläche und minimalem Reißen am Deckglas haften. Die Steifigkeit wurde mittels AFM nach dem Prinzip der Eindringtechnik gemessen, wobei ein steifer Eindringkörper mit der erforderlichen Kraft auf die Probe aufgebracht wurde, um eine Eindringtiefe zu erreichen26. Mit dieser Messung wurde der Elastizitätsmodul der Young basierend auf der Einrückung von Tiefe und Kraft in Hertz' Modell, einer elastischen Theorie26,berechnet. Aufgrund der großen Variation der Ergebnisse durch AFM wurde jedoch eine zusätzliche statistische Methode angewendet, um ein quantitatives Ergebnis mit minimalem Einfluss von unebenen Oberflächen und unvollkommener Homogenität der Gellösungen zu erhalten26. Um eine quantitative Messung mit AFM durchzuführen, wurde eine Zusammenstellung von mindestens 50 Kraft- und Abstandskurven von jeder Stelle auf der Gelprobe für eine durchschnittliche Probensteifigkeit genommen. Die kraft, die auf das gel mit hoher Steifigkeit ausgeübt wurde, war höher als die auf das weichere Gel, was darauf hindeutet, dass ein steiferes Substrat eine steilere Neigung im Force vs. Z-Diagramm ergab, in dem die Kraft in nN gemessen wird und Z die Eindringtiefe zwischen dem Eindringkörper und der Probe angibt.

Bei weichen Hydrogelen war die Neigung der erzeugten Kraftkurve gering, da die erforderliche Kraft von der AFM-Sonde geringer war (Abbildung 1A). Bei steifen Hydrogelen, wie solchen mit dem Modul von 40 kPa, war die erzeugte Steigung jedoch viel steiler, da die aufgebrachte Kraft höher war als bei weicheren Gelen (Abbildung 1B). Wenn der Abstand zwischen der Sonde und der Hydrogelprobe abnimmt, nimmt die Kurve signifikant zu, wenn die Spitze der Sonde den Glasdeckglas berührt. Wenn jedoch der Trennabstand zunimmt, nähert sich die Kurve lediglich 0, da keine Kraft angewendet wird.

Wie in Abbildung 1Agezeigt, näherte sich der Cantilever auf der AFM-Sonde dem Gel, angezeigt durch die blaue Linie, und die Sonde maß die aufgebrachte Kraft, die erforderlich ist, um in die Gelprobe einzudringen und schließlich den Glasdeckglas zu erreichen, was zu einer plötzlichen Zunahme der Kraft führte. Aufgrund möglicher verfahrenstechnischer und instrumenteller Fehler, wie z.B. der Qualität der benötigten Lösungen, variiert die wahre Steifigkeit von Hydrogelproben stark und weit von der gewünschten Steifigkeit entfernt. Daher ist AFM ein nützliches Werkzeug, um die Methodik zu validieren und zu bestätigen und gleichzeitig eine falsche Datenpräsentation in weiteren Experimenten zu verhindern.

In dieser AFM-Bewertung wurden die fünf vorbereiteten Hydrogelproben nach dem quantitativen Ansatz gemessen. Das Protokoll konzentrierte sich auf Hydrogelsteifigkeitswerte von 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa und 40 kPa, die die Breite der biologischen Substratsteifigkeitswerte nachahmen, die für die Differenzierung verschiedener Zelltypen gemeldet wurden. Die aus AFM-Messungen erhaltenen Kraftkurven wurden verwendet, um den Elastizitätsmodul der Jugend in Kilopascal mit einer AFM-Analysealgorithmus-Software zu erzeugen (Abbildung 2).

Vergleich von Polyacrylamid-Hydrogel-Systemen und Zelltypen
Diese Anpassung des ursprünglichen Protokolls durch Tse und Kollegen bietet einen effizienten und effektiven Ansatz zur Untersuchung der mechanosensitiven Aspekte von NCC unter Verwendung von O9-1-Zellen20. Zu den Änderungen des vorherigen Protokolls gehören die Modifikation der ECM-Proteininkubation: Ersetzen von 50 mM HEPES durch 0,2% Essigsäure und Die Zugabe von 10% Pferdeserum und FBS für die Zellkultur (Schritt 1.3.14-1.3.15). Diese Modifikationen wurden validiert, indem das Wachstum und die Aufrechterhaltung von O9-1 NCCs auf diesem modifizierten Gelsystem mit denen im ursprünglichen (Kontroll-) Protokoll verglichen wurden. Hier kultivierten wir Wildtyp-O9-1-Zellen auf beiden Hydrogelsystemen mit dem Elastizitätsmodul von 1 kPa und 40 kPa für jedes System im Basalmedium. Der allgemeine Zellwachstumsstatus und die Entwicklung wurden mit einem Hellfeldlichtmikroskop auf apoptotische Eigenschaften, gestresste Morphologie und Zellbindung an die Hydrogele visualisiert. O9-1-Zellen, die auf dem ursprünglichen Gelsystem gezüchtet wurden, führten zu einer höheren Anzahl toter Zellen, die durch einen Überschuss an runden Zellen angezeigt wurden (Abbildung 3E,F) für 1 kPa und 40 kPa Hydrogele.

Im Gegensatz dazu zeigten die O9-1-Zellen, die auf dem modifizierten Gelsystem gezüchtet wurden, ein gesundes Zellwachstum und eine ausreichende Bindung an das Hydrogelsubstrat (Abbildung 3G,H). Darüber hinaus wurde die Kompatibilität von NCCs mit dem modifizierten Hydrogelsystem durch IF-Färbung des NCC-Markers Tcfap2α (AP-2) bewertet. AP-2 ist ein Transkriptionsfaktor, der in den NC-Linien exprimiert wird, um die Entwicklung in Mausembryonen zu regulieren, wodurch er geeignet ist, die Kompatibilität zu beurteilen27. Obwohl O9-1-Zellen, die auf Kontroll- und modifizierten Hydrogelsystemen gezüchtet wurden, beide AP-2 exprimierten, gab es einen signifikanten Anstieg der AP-2-Expression in O9-1-Zellen, die auf dem modifizierten Hydrogelsystem plattiert waren, wie durch das stärkere Fluoreszenzsignal und die entsprechende Quantifizierung angezeigt wird (Abbildung 4A,B).

Darüber hinaus wurden P19-Zellen verwendet, um die Vorteile des modifizierten Hydrogelsystems für das Wachstum von Zellen weiter zu validieren. P19 ist eine embryonale Karzinom-Zelllinie, die aus dem embryonalen Teratokarzinom der Maus28gewonnen wurde. Unter Verwendung des entsprechenden Kulturprotokolls wurden P19-Zellen sowohl auf Kontroll- als auch auf modifizierten Hydrogelsystemen gezüchtet, um das Überleben und die Wachstumseigenschaften zu überwachen. Die Hellfeldbildgebung zeigte, dass P19-Zellen, die auf beiden Hydrogelsystemen plattiert waren, einen Überschuss an runden schwimmenden Zellen und einen Mangel an Zell-Substrat-Ansätzen aufwiesen (Abbildung 3A-D). Diese Beobachtung deutete darauf hin, dass das modifizierte Protokoll für O9-1-NCCs besser geeignet war, um die mechanische Signalisierung in NCCs zu untersuchen.

Visualisierung der hochbeanspruchten Faserexpression auf steifen Substraten
Das modifizierte Hydrogel ermöglichte eine quantitative und qualitative Analyse der Unterschiede in der Morphologie von Zellen, die auf Gelen unterschiedlicher Steifigkeit und anderen Effektoren kultiviert wurden. Sobald die Hydrogele für die Zellaussaat bereit waren, wurden Wildtyp-O9-1-Zellen an Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit weitergegeben. Die Zellen wurden auf ihre Gesundheit und ihr Wachstum überwacht, indem ihre Form, räumliche Ausbreitung und sogar Befestigung am Hydrogel mit minimalen toten Zellen beobachtet wurden. Einige Studien haben eine Zunahme der Spannungsfasern und der Zelladhäsion für MSCs auf Substraten mit hoher Steifigkeit gezeigt, was darauf hindeutet, dass NCCs, die auf einem steiferen Substrat gezüchtet wurden, ebenfalls ähnliche Ergebnisse aufweisen würden wie NCCs, die auf weicheren Substraten gezüchtet wurden29,30.

F-Aktin zusammen mit Myosin II, α-Actinin und anderen Zytoskelettproteinen sind zusammen als Stressfasernbekannt 31. Frühere Studien beobachteten eine Zunahme der Spannungsfasermontage als Reaktion auf eine erhöhte mechanische Kraft31. An einem oder beiden Enden der Spannungsfasern ermöglichen Anhaftungen an den fokalen Adhäsionskomplex den Zellen, zu migrieren und an der ECM31zu haften. Phalloidin-Färbung zur Visualisierung der F-Aktin-Expression und -Organisation in den NCCs zeigte ein gesundes Zellwachstum als Reaktion auf mechanische Signale (Abbildung 5). Darüber hinaus zeigten die O9-1-Zellen, die auf Hydrogelen mit niedriger oder hoher Steifigkeit gezüchtet wurden, unterschiedliche Morphologien durch unterschiedliche Mengen an Stressfasern (Abbildung 5). Ähnlich wie Beobachtungen aus berichteten Studien, die mit MSCs durchgeführt wurden, wurde beobachtet, dass O9-1-Zellen, die auf einem steiferen Substrat, 40 kPa, gezüchtet wurden, mehr Stressfasern aufwiesen und im Vergleich zu Zellen, die auf einem weicheren Hydrogel gezüchtet wurden, gut verteilt waren, was durch eine Steifigkeit von 1 kPa angezeigt wird29,30.

Beurteilung von Zelladhäsionen
Um die Hypothese weiter zu bestätigen, dass die Änderung der Substratsteifigkeit die NCC-Adhäsion beeinflusst, wurden Änderungen der Vcl-Expression quantitativ über RT-qPCR in NCCs gemessen, die auf unterschiedliche Hydrogelsteifigkeitswerte reagieren. Vcl ist eines der zahlreichen Zytoskelettproteine, die im fokalen Adhäsionskomplex während des Prozesses der Zellherstellung mit dem Substrat und der Erfassung der ECM-Eigenschaften vorhanden sind32. Fokale Adhäsionen sind die Kontaktpunkte der Zellen zum ECM über Integrinrezeptoren, die am zytoplasmatischen Aktinzytoskelett F-Aktin33 verankert sind Die Vcl-Genexpressionsebene deutet auf die Veränderungen der fokalen Adhäsionen und Zelladhäsionen der O9-1-Zellen als Reaktion auf die Substratsteifigkeit hin.

Frühere Studien zeigten die Wirkung von Vcl auf die Zelladhäsion in embryonalen Stamm- und Fibroblastenzellen durch Unterschiede in ihrer Expression. Als Reaktion auf die hohe Expression von Vclnahmen auch die Anzahl und Größe der fokalen Adhäsionen zu, nahmen aber ab, wenn Vcl niedergeschlagen wurde34. Konsistent zeigten Vcl-defiziente Zellen auch eine signifikante Abnahme der Zelladhäsion und -ausbreitung35. Darüber hinaus spielt Vcl eine Rolle bei der Regulierung der Zelladhäsion durch Stabilisierung fokaler Adhäsionen36. Die Größe der fokalen Adhäsionen, der Reifegrad und die Zusammensetzung variieren je nach Substratsteifigkeit, so dass Signale intrazellulär übertragen werden können und die Zellen auf ihre Umwelteinflüsse reagierenkönnen 37. Somit wird Vcl in hohem Maße für die fokalen Adhäsionskomplexe in Zellen rekrutiert, die auf steifen Substraten gezüchtet werden, was sich in höheren mRNA-Spiegeln widerspiegelt, die durch RT-qPCR nachgewiesen wurden (Abbildung 6C).

Zellen, die auf weicheren Substraten gezüchtet werden, bilden minimale fokale Adhäsionskomplexe, die sich in niedrigeren mRNA-Spiegeln von Vcl in den Zellenwiderspiegeln 15. In Abbildung 6Czeigten O9-1-Zellen eine höhere Expression von Vcl auf dem steifen Substrat als auf dem weichen Substrat. Diese Ergebnisse deuten auf ein höheres Maß an Zell-Substrat-Adhäsionen von O9-1-Zellen auf steifen Substraten hin als O9-1-Zellen auf weicheren Substraten. Darüber hinaus wurde die Vcl-Expression durch IF-Färbung mit einem Anti-Vcl-Antikörper qualitativ visualisiert, um den RT-qPCR-Befund weiter zu ergänzen und zu unterstützen. Konsistent war die Vcl-Expression in O9-1-Zellen, die auf dem steiferen Substrat gezüchtet wurden, höher als die auf dem weicheren Substrat (Abbildung 6A,B), was den anfänglichen Nachweis einer hohen Zelladhäsion und -Ausbreitung auf dem 40 kPa-Hydrogel im Vergleich zu dem 1 kPa-Hydrogel, das mit F-Aktin-Phalloidin-Färbung und Vcl-Expressionsniveaus über RT-qPCR beobachtet wurde, weiter unterstützte.

Abbildung 1: Kraftkurven, die aus dem Einzug der AFM-Sonde erzeugt werden. Kraft (y-Achse) gibt die erforderliche Kraft an, die in nN angewendet wird, und Z (x-Achse) gibt den Bruker AFM-Sondenabstand von der Probe in μm an. Für das 1 kPa Hydrogel (A) ist die erzeugte Steigung sanft gegenüber der steileren Steigung, die für das 40 kPa Hydrogel (B) beobachtet wurde. Die farbigen Kurven stellen die Bewegung des Auslegers auf der AFM-Sonde dar, wenn er sich der Hydrogelprobe nähert (blau) und sich zurückzieht (rot). Der höchste Startpunkt der Kurve zeigt den starren Kontakt des Glasdeckglases an. (B) Der große Einbruch in der zurückgezogenen Kurve des 40 kPa Hydrogels zeigt die Haftung zwischen der Perle und der Probe an. Abkürzung: AFM = Rasterkraftmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Die durchschnittliche Steifigkeit von Hydrogelen (in kPa), berechnet aus dem Elastizitätsmodul der Elastizität. Der Elastizitätsmodul wurde aus den Kraftkurven aus Abbildung 1erzeugt. Die referenzierten Elastizitätsmodule der Hydrogele waren 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa und 40 kPa. Fehlerindikatoren zeigen die Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Hellfeldbilder von P19- und O9-1-Zellen, plattiert auf 1 kPa- und 40 kPa-Hydrogelen von Kontroll- und modifizierten Gelsystemen zum Nachweis von Zellwachstumsmerkmalen. (A-D) P19 und (E-H) O9-1 Zellen; tote Zellen sind durch rote Pfeile gekennzeichnet. Maßstabsbalken = 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Immunfluoreszenzfärbung des NCC-Markers AP-2 in O9-1 NCCs zur Visualisierung der NCC-Kompatibilität. (A) Ein 40 kPa modifiziertes Hydrogelsystem im Vergleich zu (B) einer 40 kPa Kontrolle. AP-2 (grün); Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsbalken = 25 μm. (C) Das Balkendiagramm liefert eine Quantifizierung des AP-2-Expressionsniveaus mit Signifikanz (p-Wert= 0,003) (n = 3). Die Daten zeigen den relativen Ausdruck mit den angegebenen Standardabweichungsfehlerbalken. Abkürzungen: NCC = Neuralleistenzelle; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Fluoreszierende Phalloidin-Färbung von F-Aktin zeigt Stressfasern, die in O9-1-Zellen auf dem 40 kPa-Hydrogel gut verteilt sind. O9-1 Zellen wurden auf 1 kPa(A)und 40 kPa Hydrogelen ( B )kultiviert. O9-1-Zellen wurden mit Alexa Fluor 488 Phalloidin (grün) und die Kerne mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsbalken = 25 μm. Abkürzung: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Immunfluoreszenzbilder von Vinculin in O9-1-Zellen. O9-1 Zellen wurden auf 1 kPa (A) und 40 kPa (B) Hydrogelen plattiert. Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Skalenbalken = 25 μm. (C) Quantitative PCR-Analyse des gesamten mRNA-Spiegels von Vcl in O9-1-Zellen, die auf 1 kPa- und 40 kPa-Hydrogelen kultiviert wurden. Der Vcl-Expressionspegel des 1 kPa-Hydrogels ist signifikant niedriger als der des 40 kPa-Hydrogels (p-Wert= 0,02). Die Daten zeigen den Durchschnitt mit bereitgestellten Standardabweichungsfehlerbalken. Abkürzung: DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Entsprechende Lösungsvolumina zur Erzielung der gewünschten Steifigkeitsstufen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.