Gewebeentnahme und RNA-Extraktion aus dem humanen osteoarthritischen Kniegelenk

Zusammenfassung

Primärgewebe, die von Patienten nach einer totalen Knieendoprothetik gewonnen werden, bieten ein experimentelles Modell für die Arthroseforschung mit maximaler klinischer Translatierbarkeit. Dieses Protokoll beschreibt, wie RNA aus sieben einzigartigen Kniegeweben identifiziert, verarbeitet und isoliert werden kann, um die mechanistische Untersuchung bei menschlicher Osteoarthritis zu unterstützen.

Zusammenfassung

Osteoarthritis (OA) ist eine chronische und degenerative Gelenkerkrankung, die am häufigsten das Knie betrifft. Da es derzeit keine Heilung gibt, ist die totale Knieendoprothetik (TKA) ein häufiger chirurgischer Eingriff. Experimente mit primären menschlichen OA-Geweben, die aus TKA gewonnen wurden, bieten die Möglichkeit, Krankheitsmechanismen ex vivozu untersuchen. Während früher angenommen wurde, dass OA hauptsächlich den Knorpel beeinflusst, ist heute bekannt, dass es mehrere Gewebe im Gelenk beeinflusst. Dieses Protokoll beschreibt die Patientenauswahl, Probenverarbeitung, Gewebehomogenisierung, RNA-Extraktion und Qualitätskontrolle (basierend auf RNA-Reinheit, Integrität und Ausbeute) aus jedem der sieben einzigartigen Gewebe, um die Untersuchung des Krankheitsmechanismus im Kniegelenk zu unterstützen. Mit Einverständniserklärung wurden Proben von Patienten entnommen, die sich einer TKA für OA unterzogen. Gewebe wurden innerhalb von 4 Stunden nach der Operation durch Schockgefrieren zur RNA- oder Formalinfixierung für die Histologie seziert, gewaschen und gelagert. Zu den gesammelten Geweben gehörten Gelenkknorpel, subchondraler Knochen, Meniskus, infrapatellares Fettpolster, vorderes Kreuzband, Synovium und Vastus medialis schräger Muskel. RNA-Extraktionsprotokolle wurden für jeden Gewebetyp getestet. Die bedeutendste Modifikation betraf die Methode des Zerfalls, die für niedrigzellige, hochmatrixreiche Hartgewebe (als Knorpel, Knochen und Meniskus betrachtet) im Vergleich zu relativ hochzelligen, niedrigmatrixigen Weichteilen (als Fettpolster, Band, Synovium und Muskel betrachtet) verwendet wurde. Es wurde festgestellt, dass die Pulverisierung für Hartgewebe und die Homogenisierung für Weichteile geeignet war. Es wurde eine Neigung für einige Probanden beobachtet, höhere RNA-Integritätszahlwerte (RIN) als andere Probanden konsistent über mehrere Gewebe hinweg zu liefern, was darauf hindeutet, dass zugrunde liegende Faktoren wie der Schweregrad der Erkrankung die RNA-Qualität beeinflussen können. Die Fähigkeit, hochwertige RNA aus primären menschlichen OA-Geweben zu isolieren, bietet ein physiologisch relevantes Modell für anspruchsvolle Genexpressionsexperimente, einschließlich Sequenzierung, die zu klinischen Erkenntnissen führen können, die leichter auf Patienten übertragen werden können.

Einleitung

Das Knie ist das größte Synovialgelenk im menschlichen Körper, bestehend aus dem tibiofemoralen Gelenk zwischen Tibia und Femur und dem Patellofemoralgelenk zwischen Patella und Femur¹. Die Knochen im Knie sind mit Gelenkknorpel ausgekleidet und werden von verschiedenen Bindegeweben unterstützt, einschließlich Menisken, Fett, Bändern und Muskeln, und eine Synovialmembran umschließt das gesamte Gelenk, um eine mit Synovialflüssigkeit gefüllte Höhle zu bilden^1,2,3 ( Abbildung1). Ein gesundes Knie fungiert als bewegliches Sch....

Protokoll

Dieses Studienprotokoll wurde genehmigt und folgte den institutionellen Richtlinien des Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB # 13995).

1. Patientenauswahl

1. Identifizieren Sie die Patienten unter denen, die sich einer TKA mit einem orthopädischen Chirurgen unterziehen sollen.
2. Wählen Sie die Patienten basierend auf den im Studienprotokoll definierten Zulassungskriterien aus. Beispiele für Einschlusskriterien sind das Alter von 18 Jahren oder älter und eine bestätigte Diagnose von Kniearthrose. Beispiele für Ausschlusskriterien sind ein partieller Knieersatz oder eine bestätigte Diagnose einer rheumatoide....

Ergebnisse

Sieben einzigartige menschliche Kniegelenkgewebe stehen zur Entnahme von Patienten zur Verfügung, die sich einer TKA für OA unterziehen (Abbildung 1). In diesem Protokoll wurde jedes dieser Gewebe innerhalb von 4 Stunden nach der chirurgischen Entfernung identifiziert und verarbeitet (Abbildung 2). Nach den in Abbildung 3beschriebenen Schritten wurden Teile jedes Gewebes für die histologische Beurteilung formalinfixiert (

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll hat sich bei der Gewinnung von sieben primären menschlichen OA-Geweben für die RNA-Extraktion (Tabelle 1) und die histologische Verarbeitung (Abbildung 4) als erfolgreich erwiesen. Vor der Entnahme von Patientenproben ist es notwendig, ein vom IRB zugelassenes Protokoll zu erstellen, idealerweise in Zusammenarbeit mit einem Chirurgen oder einem chirurgischen Team. Die Anwendung eines standardisierten Protokolls für die Probenentnahme (z. B. Resekti.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf	05 402	Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert.
10% Formalin	Cardinal Health	C4320-101	Bei Nichtgebrauch im Chemikalienschrank lagern.
100 % Chloroform (Molekularbiologie)	Fisher Scientific	ICN19400290	Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert, bei Nichtgebrauch im Chemikalienschrank lagern.
100% Ethanol (Molekularbiologie)	Fisher Scientific	BP2818500	Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert, bei der Verdünnung DEPC/Nuklease-freies Wasser verwenden.
100% Isopropanol (Molekularbiologie)	Fisher Scientific	AC327272500	Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert, bei Nichtgebrauch im Chemikalienschrank lagern.
100% Reagenz Alkohol	Cardinal Health	C4305	Verdünnt auf 70% mit dH2O zu Reinigungszwecken.
15 cm sterile Kulturschalen	Thermo Scientific	12-556-003	Steril, nukleasefrei.
15 mL Röhrchen aus Polypropylen (Falcon)	Fisher Scientific	14 959 53A	Steril, nukleasefrei.
2 mL Kryoröhrchen (mit Außengewinde)	Fisher Scientific	10 500 26	Steril, nukleasefrei.
5 mL Röhrchen mit rundem Boden	Corning	352052	Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert.
50 mL Röhrchen aus Polypropylen (Falcon)	Fisher Scientific	12 565 271	Steril, nukleasefrei.
Bioanalysator	Agilent	G2939BA	Für die Messung der RNA-Integrität.
Biosicherheitswerkbank	Allgemeine Laborausrüstung
Knochenschneider	Fisher Scientific	08 990	Sterilisiert mit 70% EtOH.
Chemischer Abzug Allgemeine	Laborausrüstung
Einwegskalpelle (Nr. 10)	Thermo Scientific	3120032	Steril, nukleasefrei.
EDTA	Life Technologies	15-576-028	10%ige Lösung mit dH2O.
Pinzetten	Jeder Hersteller		Sterilisiert mit 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant	Fisher Scientific	AM9516	Nur für RNA-Arbeiten reserviert, bei -20 °C lagern.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Flüssiger Stickstoff	Jeder Anbieter
Flüssiger Stickstoff Dewar	Allgemeine Laborausrüstung
Mörser und Stößel	Jeder Anbieter		Nur für RNA-Arbeiten reserviert, sterilisiert gemäß Protokoll.
Nanotropfen-Spektralphotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Für Messungen der RNA-Reinheit und -Ausbeute.
Nukleasefreies/DEPC-behandeltes Wasser	Fisher Scientific		Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert.
PBS (steril)	Gibco	20 012 050	Steril, nukleasefrei.
Pipetten (2 & Mikro; L, 20 & Mikro; L, 200 & Mikro; L, 1000 &Mikro; L) & Tipps	Jeder Anbieter		Steril, nukleasefrei.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit	Qiagen	217204
Kühlzentrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	Thermo Scientific	50 197 8158	Steril, nukleasefrei.
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
Spatel (Semimikrogröße)	Jeder Anbieter		Nur für RNA-Arbeiten reserviert.
Gewebehomogenisator	Pro Scientific	01-01200	Nur für RNA-Arbeiten reserviert, gemäß Protokoll sterilisiert.
TRIzol Reagenz	Fisher Scientific	15 596 026	Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert.