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Methodenartikel

Gewebeentnahme und RNA-Extraktion aus dem humanen osteoarthritischen Kniegelenk

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DOI:

10.3791/62718

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22. Juli 2021

 ,  ,  , 
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Primärgewebe, die von Patienten nach einer totalen Knieendoprothetik gewonnen werden, bieten ein experimentelles Modell für die Arthroseforschung mit maximaler klinischer Translatierbarkeit. Dieses Protokoll beschreibt, wie RNA aus sieben einzigartigen Kniegeweben identifiziert, verarbeitet und isoliert werden kann, um die mechanistische Untersuchung bei menschlicher Osteoarthritis zu unterstützen.

Zusammenfassung

Osteoarthritis (OA) ist eine chronische und degenerative Gelenkerkrankung, die am häufigsten das Knie betrifft. Da es derzeit keine Heilung gibt, ist die totale Knieendoprothetik (TKA) ein häufiger chirurgischer Eingriff. Experimente mit primären menschlichen OA-Geweben, die aus TKA gewonnen wurden, bieten die Möglichkeit, Krankheitsmechanismen ex vivozu untersuchen. Während früher angenommen wurde, dass OA hauptsächlich den Knorpel beeinflusst, ist heute bekannt, dass es mehrere Gewebe im Gelenk beeinflusst. Dieses Protokoll beschreibt die Patientenauswahl, Probenverarbeitung, Gewebehomogenisierung, RNA-Extraktion und Qualitätskontrolle (basierend auf RNA-Reinheit, Integrität und Ausbeute) aus jedem der sieben einzigartigen Gewebe, um die Untersuchung des Krankheitsmechanismus im Kniegelenk zu unterstützen. Mit Einverständniserklärung wurden Proben von Patienten entnommen, die sich einer TKA für OA unterzogen. Gewebe wurden innerhalb von 4 Stunden nach der Operation durch Schockgefrieren zur RNA- oder Formalinfixierung für die Histologie seziert, gewaschen und gelagert. Zu den gesammelten Geweben gehörten Gelenkknorpel, subchondraler Knochen, Meniskus, infrapatellares Fettpolster, vorderes Kreuzband, Synovium und Vastus medialis schräger Muskel. RNA-Extraktionsprotokolle wurden für jeden Gewebetyp getestet. Die bedeutendste Modifikation betraf die Methode des Zerfalls, die für niedrigzellige, hochmatrixreiche Hartgewebe (als Knorpel, Knochen und Meniskus betrachtet) im Vergleich zu relativ hochzelligen, niedrigmatrixigen Weichteilen (als Fettpolster, Band, Synovium und Muskel betrachtet) verwendet wurde. Es wurde festgestellt, dass die Pulverisierung für Hartgewebe und die Homogenisierung für Weichteile geeignet war. Es wurde eine Neigung für einige Probanden beobachtet, höhere RNA-Integritätszahlwerte (RIN) als andere Probanden konsistent über mehrere Gewebe hinweg zu liefern, was darauf hindeutet, dass zugrunde liegende Faktoren wie der Schweregrad der Erkrankung die RNA-Qualität beeinflussen können. Die Fähigkeit, hochwertige RNA aus primären menschlichen OA-Geweben zu isolieren, bietet ein physiologisch relevantes Modell für anspruchsvolle Genexpressionsexperimente, einschließlich Sequenzierung, die zu klinischen Erkenntnissen führen können, die leichter auf Patienten übertragen werden können.

Einleitung

Das Knie ist das größte Synovialgelenk im menschlichen Körper, bestehend aus dem tibiofemoralen Gelenk zwischen Tibia und Femur und dem Patellofemoralgelenk zwischen Patella und Femur1. Die Knochen im Knie sind mit Gelenkknorpel ausgekleidet und werden von verschiedenen Bindegeweben unterstützt, einschließlich Menisken, Fett, Bändern und Muskeln, und eine Synovialmembran umschließt das gesamte Gelenk, um eine mit Synovialflüssigkeit gefüllte Höhle zu bilden1,2,3 ( Abbildung1). Ein gesundes Knie fungiert als bewegliches Scharniergelenk, das eine reibungsfreie Bewegung in der Frontalebeneermöglicht 1,3. Unter pathologischen Bedingungen kann die Bewegung eingeschränkt und schmerzhaft werden. Die häufigste degenerative Erkrankung des Kniegelenks ist die Arthrose (OA)4. Es ist bekannt, dass eine Vielzahl von Risikofaktoren für die Entwicklung von OA prädisponieren, darunter höheres Alter, Fettleibigkeit, weibliches Geschlecht, Gelenktraumata und Genetik, unter anderem5,6. Derzeit gibt es in den USA schätzungsweise 14 Millionen Menschen mit symptomatischer Knie-OA, wobei die Prävalenz aufgrund des steigenden Bevölkerungsalters und der Fettleibigkeitsraten zunimmt7,8. Anfangs als Knorpelerkrankung betrachtet, wird OA heute als Erkrankung des gesamten Gelenks verstanden9. Häufig beobachtete pathologische Veränderungen bei OA umfassen Gelenkknorpelerosion, Osteophytenbildung, subchondrale Knochenverdickung und Entzündung der Synovia9,10. Da es keine bekannte Heilung für OA gibt, konzentrieren sich die Behandlungen in erster Linie auf die Symptombehandlung (z. B. Schmerz)11,12, und sobald OA in das Endstadium fortgeschritten ist, ist eine Gelenkersatzoperation oft indiziert13.

Gelenkersatzoperationen können entweder teilweise oder totaler Knieersatz sein, wobei die totale Knieendoprothetik (TKA) den Ersatz der gesamten tibiofemoralen Artikulation und des patellofemoralen Gelenks umfasst. Ab 2020 werden in den USA jedes Jahr ca. 1 Million TKAs durchgeführt14. Während der TKA reseziert ein orthopädischer Chirurg den oberen Teil des Tibiaplateaus und die unteren Femurkondylen (Abbildung 2A, 2B), um mit prothetischen Implantaten ausgestattet zu werden. Manchmal von Patienten falsch interpretiert, werden in einem TKA nur 8-10 mm vom Ende jedes Knochens reseziert, der anschließend mit Metall verschlossen oder wieder aufgetaucht wird. Ein dazwischenliegender Polyethylen-Liner bildet die Auflagefläche (d.h. Polsterung) zwischen den beiden Metallimplantaten. Darüber hinaus werden mehrere Weichteilkomponenten des Gelenks ganz oder teilweise ausgeschnitten, um ein angemessenes Gelenkgleichgewicht zu erreichen. Zu diesen Geweben gehören die mediale und laterale Menisken (Abbildung 2C), das infrapatellare Fettpolster (Abbildung 2D), das vordere Kreuzband (ACL; Abbildung 2E), Synovium (Abbildung 2F) und Vastus medialis schräger Muskel (VMO; Abbildung 2G) 15.Obwohl TKAs im Allgemeinen erfolgreich für die OA-Behandlung sind, berichten etwa 20% der Patienten von einem Wiederauftreten von Schmerzen nach der Operation16. Zusammen mit den hohen Kosten und der relativen Invasivität des Verfahrens weisen diese Einschränkungen auf die Notwendigkeit weiterer Forschung hin, um alternative Behandlungen zu identifizieren, um das Fortschreiten von OA zu mildern.

Um Krankheitsmechanismen bei OA zu erforschen, die neue Wege für therapeutische Interventionen eröffnen können, können experimentelle Systeme, einschließlich Zellen, Gewebeexplantaten und Tiermodelle, verwendet werden. Zellen werden typischerweise in Monoschicht kultiviert und stammen aus primären menschlichen oder tierischen Geweben (z. B. aus Knorpel isolierte Chondrozyten) oder immortalisierten Zellen (z. B. ATDC517 und CHON-00118). Während Zellen für die Manipulation experimenteller Variablen in einer kontrollierten Kulturumgebung nützlich sein können, erfassen sie keine Bedingungen des natürlichen Gelenks, von denen bekannt ist, dass sie die Zellphänotypenbeeinflussen 19. Um die komplexe Kaskade der chemischen, mechanischen und Zell-zu-Zell-Kommunikation, die OA zugrunde liegt, besser zu rekapitulieren, wird eine Alternative in primären menschlichen oder tierischen Gewebeproben gefunden, unabhängig davon, ob sie frisch oder ex vivo als Explantaten kultiviert werden, um die Gewebestruktur und die Zellmikroumgebung zu erhalten20. Um das Gelenk in vivozu untersuchen, sind auch kleine (z. B. Maus21)und große (z. B. Pferd22)Tiermodelle für OA (z. B. durch chirurgische Induktion, genetische Veränderung oder Alterung) nützlich. Die Translation von diesen Modellen auf menschliche Krankheiten kann jedoch durch anatomische, physiologische und metabolische Unterschiede begrenzt werden, unter anderem23. In Anbetracht der Vor- und Nachteile experimenteller Systeme maximieren die Hauptstärken der Spezies-Spezifischen und der Aufrechterhaltung der extrazellulären Nische, die das primäre menschliche OA-Gewebe bietet, das translationale Potenzial der Forschungsergebnisse.

Primäre humane OA-Gewebe können nach TKA leicht gewonnen werden, was die hohe Häufigkeit von TKAs zu einer wertvollen Ressource für die Forschung macht. Zu den möglichen experimentellen Anwendungen gehören Genexpression und histologische Analysen. Um das Potenzial von primären menschlichen OA-Geweben für diese und andere Forschungsansätze zu realisieren, werden die folgenden Schlüsselüberlegungen skizziert. Erstens unterliegt die Verwendung von Patientenproben einer ethischen Regulierung, und die Protokolle müssen die Genehmigungen des Institutional Review Board (IRB) erfüllen24. Zweitens machen die inhärente Heterogenität des primären erkrankten Gewebes des Menschen und der Einfluss von Variablen wie Alter und Geschlecht unter anderem die Notwendigkeit einer sorgfältigen Patientenauswahl (d.h. Anwendung von Zulassungskriterien) und Dateninterpretation erforderlich. Drittens können die einzigartigen biologischen Eigenschaften verschiedener Gewebe im Gelenk (z. B. geringe Zellularität von Knorpel und Meniskus25)während der Experimente Herausforderungen darstellen (z. B. Isolierung der hohen Qualität und Quantität der RNA). Dieser Bericht befasst sich mit diesen Überlegungen und stellt ein Protokoll für die Patientenauswahl, Probenverarbeitung, Gewebehomogenisierung, RNA-Extraktion und Qualitätskontrolle (d. H. Bewertung der RNA-Reinheit und -Integrität; Abbildung 3) Förderung der Verwendung von primärem humanem OA-Gewebe in der Forschungsgemeinschaft.

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Protokoll

Dieses Studienprotokoll wurde genehmigt und folgte den institutionellen Richtlinien des Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB # 13995).

1. Patientenauswahl

  1. Identifizieren Sie die Patienten unter denen, die sich einer TKA mit einem orthopädischen Chirurgen unterziehen sollen.
  2. Wählen Sie die Patienten basierend auf den im Studienprotokoll definierten Zulassungskriterien aus. Beispiele für Einschlusskriterien sind das Alter von 18 Jahren oder älter und eine bestätigte Diagnose von Kniearthrose. Beispiele für Ausschlusskriterien sind ein partieller Knieersatz oder eine bestätigte Diagnose einer rheumatoiden Arthritis.
  3. Kontaktieren Sie die Patienten, um vor der Operation eine Einverständniserklärung einzuholen.

2. Probenverarbeitung (für RNA)

HINWEIS: Führen Sie alle Gewebeverarbeitungen in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II durch und befolgen Sie sterile Techniken. Tragen Sie bei der Verarbeitung menschlicher Proben immer eine geeignete PSA (Nitrilhandschuhe, Laborkittel, Schutzbrille). Während der TKA werden mehrere Knochenfragmente produziert, eine große Menge an Knochen / Knorpel steht möglicherweise für die Dissektion zur Verfügung. Aufgrund des Fortschreitens der Erkrankung kann die Gelenkknorpeldegeneration bei einigen Knochenabschnitten schwerwiegender sein, was in das experimentelle Design einbezogen werden kann. Nur Gewebe, die eine Elektrokauterisation zur Resektion vorschreiben, haben thermische Kantenschäden, und es wird eine konzertierte chirurgische Anstrengung unternommen, um die meisten Gewebe mit einem Skalpell zu beschaffen, um Schäden zu minimieren. Resezierte Gewebe müssen jederzeit mit sterilem PBS hydratisiert werden.

  1. Desinfizieren Sie alle Arbeitsflächen und Geräte mit 70% Ethanol, RNase-Dekontaminationsmittel, DEPC-behandeltem Wasser und erneut mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Restflüssigkeit mit sauberen, fusselfreien Taschentüchern ab. Pinzette, Knochenschneider und Skalpelle werden vor Gebrauch mindestens 10 Minuten lang entweder autoklaviert oder in 70% Ethanol getränkt. Bewahren Sie die Ausrüstung in 70% Ethanol auf, wenn sie nicht sofort verwendet werden.
  2. Für jedes Gewebe (z. B. TKA-1 Knorpel 1) mindestens drei Kryovale mit anonymisiertem Probennamen und aliquoter Nummer voretikettieren.
    1. Identifizieren Sie jeden Gewebetyp aus der Probe basierend auf den Unterschieden in Größe, Form, Farbe und Textur, wie in Abbildung 2gezeigt und beschrieben. Identifizieren Sie den Knorpel(Pfeil Abbildung 2A), den Knochen(Pfeil Abbildung 2B), den Meniskus(Abbildung 2C),das infrapatellare Fettpolster(Abbildung 2D),das vordere Kreuzband(Abbildung 2E),die Synovia(Abbildung 2F)und den Musculus vastus medialis schräg (Abbildung 2G).
  3. Isolieren Sie den Gelenkknorpel.
    1. Wählen Sie einen Knochenanteil mit minimalem Knorpelabbau.
    2. Schneiden Sie mit einem Skalpell Nr. 10 so weit wie möglich durch die Knorpeltiefe, um die volle Dicke der Knorpelschicht zu sezieren.
      HINWEIS: Ein Skalpell Nr. 10 dringt nur in Knorpel ein, nicht in Knochen.
    3. Mit der vollen Dicke des Knorpels, sezieren Sie drei 5 mm Würfel.
  4. Isolieren Sie den subchondralen Knochen.
    1. Verwenden Sie den gleichen Knochenabschnitt, aus dem Knorpel entnommen wurde.
    2. Kratzen Sie mit einem Skalpell Nr. 10 den verbleibenden Knorpel und restierende Gewebe von der Knochenoberfläche ab.
    3. Halten Sie den zu schneidenden Knochenanteil mit einer Pinzette fest und schneiden Sie mit den Knochenschneidern drei 5-mm-Würfel.
  5. Isolieren Sie den Meniskus.
    1. Identifizieren Sie einen relativ unbeschädigten Teil des medialen oder lateralen Meniskus.
    2. Sezieren Sie mit einem Skalpell Nr. 10 und einer Pinzette drei 5-mm-Würfel.
  6. Isolieren Sie das infrapatellare Fettpolster.
    1. Schneiden Sie mit einem Skalpell Nr. 10 und einer Pinzette den gelben Teil des Gewebes in drei gleich große und homogene Portionen (jeweils ~ 500 mg).
  7. Isolieren Sie das vordere Kreuzband (ACL).
    1. Sezieren Sie mit einem Skalpell Nr. 10 und einer Pinzette drei 5-mm-Würfel.
  8. Isolieren Sie die Synovia.
    1. Isolieren Sie mit einem Skalpell Nr. 10 und einer Pinzette den rosa Zellteil der Membran so weit wie möglich, indem Sie Fettgewebe abkratzen.
    2. Sezieren Sie drei gleich große und homogene Portionen (jeweils ~ 200 mg).
  9. Isolieren Sie den Musculus vastus medialis schräg (VMO).
    1. Entfernen Sie mit einem Skalpell Nr. 10 und einer Pinzette fettes Gewebe aus der Probe und lassen Sie nur das rote Muskelgewebe zurück.
    2. Sezieren Sie drei 5-mm-Würfel.
      HINWEIS: Die Anfangsgröße des Gewebes begrenzt die Größe der Portionen.
  10. Spülen Sie die Gewebeteile mit sterilem PBS ab, um Rückstände oder Ablagerungen zu entfernen.
  11. Um eine Histologie durchzuführen, fixieren Sie jeden Gewebeabschnitt wie in Teil 3beschrieben.
  12. Um eine RNA-Extraktion durchzuführen, schneiden Sie jeden der drei Gewebeteile in kleinere Stücke (~ 1-2 mm   Würfel).
    1. Die kleineren Stücke auf ein 2 mL Kryovial übertragen, die Kappen fest sichern, 30 s lang einfrieren, durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff schockgefrieren und dann zur Langzeitlagerung in einen -80 °C Gefrierschrank überführen (bis zu 4 Monate im aktuellen Protokoll getestet). Wiederholen Sie dies für alle Aliquots aller Gewebe.
    2. Weiter zu Gewebehomogenisierung wie in Teil 4beschrieben .

3. Probenaufbereitung (für die Histologie)

VORSICHT: Formalin ist eine gefährliche Chemikalie, die nur in einem chemischen Abzug verwendet wird.

  1. Füllen Sie voretikettierte 15 ml konische Röhrchen mit 10% iger Formalinlösung.
  2. Übertragen Sie den Gewebeschnitt mit einer Pinzette in die mit Formalin gefüllten Röhrchen.
  3. Fixieren Sie das Gewebe in Formalin für 1 Woche bei Raumtemperatur, während Sie, wenn möglich, schütteln / rühren.
  4. Nach 1 Woche das Formalin in die ordnungsgemäße chemische Abfallentsorgung entsorgen, die Gewebe mit PBS abspülen und dann in ein frisches konisches 15-ml-Röhrchen mit 70% Ethanol zur Langzeitlagerung bei 4 ° C überführen, bis die Proben zum Schneiden eingebettet sind.
    HINWEIS: Nur für Knochen /Knorpel, führen Sie die Entkalkung wie folgt durch.
  5. Nach 1 Woche verwerfen Sie das Formalin in die ordnungsgemäße chemische Abfallentsorgung und spülen Sie das Gewebe mit PBS ab.
  6. Übertragen Sie das Gewebe in ein 50 ml konisches Röhrchen mit 45 ml 10% iger EDTA-Lösung (pH 7,4).
  7. Wenn ein Schütteln /Rühren nicht möglich ist, kehren Sie die Röhrchen 10-15 Mal täglich um.
  8. Verwerfen und ersetzen Sie die EDTA-Lösung einmal wöchentlich.
    1. Testen Sie zweimal wöchentlich die Textur mit einem Instrument (z. B. Spatel) oder einem behandschuhten Finger, um die Entkalkung zu bestätigen, indem Sie die Verformung beobachten, wenn Druck ausgeübt wird. Die Zeit, die benötigt wird, um Knochengewebe zu entkalken, variiert zwischen den Proben von 4-6 Wochen.
  9. Nach der Entkalkung spülen Sie das Gewebe mit PBS aus und übertragen Sie es in ein frisches 15 ml konisches Röhrchen mit 70% Ethanol zur Langzeitlagerung bei 4 ° C, bis die Proben zum Schneiden eingebettet sind.

4. Gewebehomogenisierung

VORSICHT: Das Protokoll verwendet die gefährliche Chemikalie Phenol. Die Arbeit mit Phenol muss in einem chemischen Abzug durchgeführt werden.

HINWEIS: Reinigen Sie alle Geräte und Oberflächen gründlich, die mit 70% Ethanol verwendet werden sollen (mindestens 10 Minuten einweichen), gefolgt von RNase-Dekontaminationsmittel (mindestens 10 Minuten einweichen), spülen Sie es mit DEPC-behandeltem Wasser ab, wischen Sie es mit einem sauberen, fusselfreien Papiertuch ab und besprühen oder tränken Sie es dann mit 70% Ethanol.

  1. Hartgewebshomogenisierung (Gelenkknorpel, subchondraler Knochen, Meniskus)
    1. Kühlen Sie vor der Homogenisierung den Mörtel, den Stößel und den Spatel mit flüssigem Stickstoff ab. Diese müssen so kalt wie möglich gehalten werden, um ein Auftauen der Probe zu verhindern.
    2. Verarbeiten Sie die Proben einzeln und halten Sie die anderen Proben bis zur Verwendung bei -80 °C.
    3. Übertragen Sie die Gewebeprobe mit einem gekühlten Spatel auf Mörtel; Gießen Sie zusätzlichen flüssigen Stickstoff auf das Gewebe und lassen Sie es verdunsten. Zerquetschen Sie das Gewebe mit dem Stößel. Fügen Sie der Gewebeprobe wiederholt mehr flüssigen Stickstoff hinzu, lassen Sie ihn verdampfen und mahlen Sie dann mit dem Stößel weiter, um ein feines Pulver herzustellen.
    4. Nachdem Sie das Gewebe so weit wie möglich pulverisiert haben, in ein vorgekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben.
      1. Vorkühlen von Röhrchen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff für 30 s vor dem Gewebetransfer.
    5. 1 ml der Säure-Guanidinium-Phenol-Lösung in jedes Röhrchen geben und auf Eis aufbewahren.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.3-4.1.5 für jede Hartgewebeprobe.
    7. Reinigen Sie nach jedem Gewebe den Mörtel, den Stößel und den Spatel mit 70% Ethanol, RNase-Dekontaminationsmittel, DEPC-behandeltem Wasser und einem zusätzlichen Einweichen in 70% Ethanol. Wischen Sie die restliche Flüssigkeit mit einem sauberen, fusselfreien Tuch ab.
    8. Inkubieren Sie die Proben für weitere 20 Minuten auf Eis.
  2. Weichteilshomogenisierung (infrapatellares Fettpolster, ACL, Synovium, VMO)
    1. Desinfizieren Sie den Homogenisator, indem Sie Röhrchen mit 70% Ethanol, RNase-Dekontaminationsmittel, DEPC-behandeltem Wasser und einer zusätzlichen 70% igen Ethanolwäsche für jeweils 30 s laufen lassen. Wischen Sie die restliche Flüssigkeit mit einem sauberen, fusselfreien Tuch ab. Wiederholen Sie dies zwischen den einzelnen Stichproben.
    2. 5 ml runde Bodenröhrchen für jede Probe voretikettieren. Zu jedem Röhrchen 1 ml der Säure-Guanidinium-Phenol-Lösung geben.
      1. Bearbeiten Sie jeweils eine Probe und bewahren Sie andere Proben bis zur Verwendung bei -80 °C auf.
    3. Übertragen Sie das Gewebe in ein vormarkiertes 5-ml-Röhrchen mit Säure-Guanidinium-Phenol.
    4. Homogenisieren Sie das Gewebe in 30-s-Pulsen und halten Sie es während und zwischen den Pulsen auf Eis. Wiederholen Sie dies, bis sich das Gewebe visuell aufgelöst hat oder für maximal fünf 30 s-Impulse.
      HINWEIS: Einige fibröse Gewebe (z. B. Muskeln) homogenisieren möglicherweise nicht vollständig.
    5. Inkubieren Sie das gelöste Gewebe auf Eis und gehen Sie zur nächsten Probe.
      1. Reinigen Sie den Homogenisator wie in Schritt 4.2.1 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass Gewebebrocken nicht in den Zähnen der Sonde verbleiben. bei Bedarf mit einer sterilen Pinzette entfernen.
    6. Nach der Homogenisierung aller Proben auf Eis in saurem Guanidinium-Phenol für weitere 20 min inkubieren.
    7. Übertragen Sie die Proben von runden Bodenröhrchen in voretikettierte und vorgekühlte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.

5. RNA-Extraktion aus Geweben

VORSICHT: Dieses Protokoll verwendet gefährliche Chemikalien wie Phenol, Chloroform und Isopropanol. Führen Sie alle Arbeiten in einem chemischen Abzug aus.

HINWEIS: Geräte und Reagenzien sind nur für die RNA-Arbeit reserviert und müssen für molekulare Anwendungen von geeigneter chemischer Qualität sein (d. h. steril, nukleasefrei). Dieses Protokoll folgt sowohl den Komponenten 4.1 als auch 4.2 gewebehomogenisierungsprotokollen. Reinigen Sie alle Geräte und Oberflächen gründlich, die mit 70% Ethanol verwendet werden sollen (mindestens 10 Minuten einweichen), gefolgt von RNase-Dekontaminationsmittel (mindestens 10 Minuten einweichen). Mit DEPC-behandeltem Wasser abspülen, die Restflüssigkeit mit einem sauberen, fusselfreien Papiertuch abwischen und dann erneut besprühen oder mit 70% Ethanol einweichen.

  1. Zentrifugieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen bei 10000 x g für 10 min bei 4 °C, um den Schmutz zu pelletieren.
  2. Den Überstand in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben.
    HINWEIS: Für Fettgewebe ist manchmal eine Lipidschicht auf der Oberseite vorhanden. Vermeiden Sie es, dies zu übertragen, indem Sie die Schicht an der Seite des Röhrchens mit einer Pipettenspitze durchbohren.
  3. Zu jeder Probe werden 200 μL Chloroform pro 1 ml der Säure-Guanidinium-Phenol-Lösung gegeben. Schütteln Sie die Röhrchen kräftig von Hand für 30 s zum Mischen. Dann 2 Minuten auf Eis inkubieren.
  4. Zentrifugenproben bei 10000 x g für 12 min bei 4 °C.
    HINWEIS: Nach der Zentrifugation haben sich drei Schichten gebildet: eine wässrige Phase, die RNA enthält, eine weiße DNA-Interphase und eine rosa Proteinphase am Boden.
  5. Übertragen Sie ~500 μL der oberen, wässrigen Phase auf ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Stören Sie nicht die Interphase und die Proteinfraktionen. Lagern Sie diese Phasen bei -80 °C für die zukünftige DNA- oder Proteinisolierung.
  6. Fügen Sie der übertragenen wässrigen Phase ein gleiches Volumen Säure-Guanidinium-Phenol-Lösung hinzu und mischen Sie es, indem Sie das Röhrchen 8-10 Mal umkehren. Die Tube 20 min auf Eis inkubieren.
  7. Zu jeder Probe werden 200 μL Chloroform pro 1 ml der Säure-Guanidinium-Phenol-Lösung gegeben. 30 s kräftig von Hand schütteln, mischen und dann 2 minuten auf Eis inkubieren.
  8. Zentrifugenproben bei 10000 x g für 12 min bei 4 °C.
  9. Transfer <500 μL der wässrigen Phase in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen, wobei darauf zu achten ist, dass die Probe nicht mit den anderen Phasen kontaminiert wird.
    ACHTUNG: Entsorgen Sie die verbleibenden Phasen mit geeigneten Gefahrstoffentsorgungsmethoden.
  10. Zu jeder Probe wird ein gleiches Volumen (als wässrige Phase) aus 100% Isopropanol gegeben. Mischen Sie, indem Sie die Röhre 8-10 Mal umkehren. 5 Min. auf Eis inkubieren.
    1. Fügen Sie 1 μL Glykogen-Kopräzipitant zu jeder Probe hinzu, um die Lokalisierung des RNA-Pellets nach der Zentrifugation zu unterstützen.
  11. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12000 x g für 25 min bei 4 °C.
  12. Suchen Sie das Pellet in der Tube (wenn Sie Coprecipitant verwenden, erscheint es blau). Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab.
  13. Waschen Sie das Pellet, indem Sie 1 ml eiskaltes 75% iges Ethanol zu jeder Probe geben, Wirbel, um das Pellet vom Boden des Röhrchens zu entfernen.
    HINWEIS: Bereiten Sie 75% Ethanol mit reinem Ethanol in molekularer Qualität und nukleasefreiem Wasser vor.
  14. Zentrifuge bei 7000 x g für 5 min bei 4 °C. Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab.
  15. Wiederholen Sie die Schritte 5.13 und 5.14 noch zwei weitere Male.
  16. Schneller Spin (<2000 x g für 5 s), um Restflüssigkeit auf den Boden des Rohres zu bringen. Verwenden Sie eine P20-Pipette, um Restethanol vom Boden der Röhrchen zu entfernen.
    1. Vermeiden Sie es, das RNA-Pellet mit einer Pipettenspitze zu berühren. Ändern Sie die Spitzen zwischen den Beispielen.
  17. Bei geöffneten Röhrchenkappen die Proben 10 min bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
    HINWEIS: Pellet kann beim Trocknen durchscheinend werden. Sicherzustellen, dass das gesamte Restethanol verdampft ist, verbessert die RNA-Reinheit.
  18. Geben Sie 25 μL nukleasefreies Wasser in jedes Röhrchen, um das Pellet aufzulösen.
  19. Bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
  20. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die RNA zu mischen.
  21. Aliquot 5 μL der Probe in ein frisches Röhrchen zur Qualitätskontrollanalyse (Teil 6). Die restlichen 20 μL werden bei -80 °C für Genexpressionsassays gelagert.

6. Qualitätskontrolle

  1. Bestimmen Sie die Konzentration und Reinheit der RNA mit einem Spektralphotometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  2. Bestimmen Sie die RNA-Integrität mit einem Elektrophoresegerät gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: Verdünnen Sie die RNA so, dass sie innerhalb des Bereichs der Chip-Nachweisgrenzen liegt.

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Ergebnisse

Sieben einzigartige menschliche Kniegelenkgewebe stehen zur Entnahme von Patienten zur Verfügung, die sich einer TKA für OA unterziehen (Abbildung 1). In diesem Protokoll wurde jedes dieser Gewebe innerhalb von 4 Stunden nach der chirurgischen Entfernung identifiziert und verarbeitet (Abbildung 2). Nach den in Abbildung 3beschriebenen Schritten wurden Teile jedes Gewebes für die histologische Beurteilung formalinfixiert (

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Diskussion

Das vorgestellte Protokoll hat sich bei der Gewinnung von sieben primären menschlichen OA-Geweben für die RNA-Extraktion (Tabelle 1) und die histologische Verarbeitung (Abbildung 4) als erfolgreich erwiesen. Vor der Entnahme von Patientenproben ist es notwendig, ein vom IRB zugelassenes Protokoll zu erstellen, idealerweise in Zusammenarbeit mit einem Chirurgen oder einem chirurgischen Team. Die Anwendung eines standardisierten Protokolls für die Probenentnahme (z. B. Resekti...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren danken den Studienteilnehmern, die diese Forschung ermöglicht haben, und widmen diesen Bericht neuen Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Osteoarthritis.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenEppendorf05 402Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert.
10% FormalinCardinal HealthC4320-101Bei Nichtgebrauch im Chemikalienschrank lagern.
100 % Chloroform (Molekularbiologie)Fisher ScientificICN19400290Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert, bei Nichtgebrauch im Chemikalienschrank lagern.
100% Ethanol (Molekularbiologie)Fisher ScientificBP2818500Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert, bei der Verdünnung DEPC/Nuklease-freies Wasser verwenden.
100% Isopropanol (Molekularbiologie)Fisher ScientificAC327272500Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert, bei Nichtgebrauch im Chemikalienschrank lagern.
100% Reagenz AlkoholCardinal HealthC4305Verdünnt auf 70% mit dH2O zu Reinigungszwecken.
15 cm sterile KulturschalenThermo Scientific12-556-003Steril, nukleasefrei.
15 mL Röhrchen aus Polypropylen (Falcon)Fisher Scientific14 959 53ASteril, nukleasefrei.
2 mL Kryoröhrchen (mit Außengewinde)Fisher Scientific10 500 26Steril, nukleasefrei.
5 mL Röhrchen mit rundem BodenCorning352052Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert.
50 mL Röhrchen aus Polypropylen (Falcon)Fisher Scientific12 565 271Steril, nukleasefrei.
BioanalysatorAgilentG2939BAFür die Messung der RNA-Integrität.
BiosicherheitswerkbankAllgemeine Laborausrüstung
KnochenschneiderFisher Scientific08 990Sterilisiert mit 70% EtOH.
Chemischer Abzug AllgemeineLaborausrüstung
Einwegskalpelle (Nr. 10)Thermo Scientific3120032Steril, nukleasefrei.
EDTALife Technologies15-576-02810%ige Lösung mit dH2O.
PinzettenJeder HerstellerSterilisiert mit 70% EtOH.
Glycoblue CoprecipitantFisher ScientificAM9516Nur für RNA-Arbeiten reserviert, bei -20 °C lagern.
KimwipesFisher Scientific06-666
Flüssiger StickstoffJeder Anbieter
Flüssiger Stickstoff DewarAllgemeine Laborausrüstung
Mörser und StößelJeder AnbieterNur für RNA-Arbeiten reserviert, sterilisiert gemäß Protokoll.
Nanotropfen-SpektralphotometerThermo ScientificND-2000Für Messungen der RNA-Reinheit und -Ausbeute.
Nukleasefreies/DEPC-behandeltes WasserFisher ScientificSteril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert.
PBS (steril)Gibco20 012 050Steril, nukleasefrei.
Pipetten (2 & Mikro; L, 20 & Mikro; L, 200 & Mikro; L, 1000 &Mikro; L) & TippsJeder AnbieterSteril, nukleasefrei.
Plasma/Serum Advanced miRNA kitQiagen217204
Kühlzentrifuge 5810REppendorf22625101
RNAlaterThermo Scientific50 197 8158Steril, nukleasefrei.
RNAse Away/RNAseZapFisher Scientific
7002
Spatel (Semimikrogröße)Jeder AnbieterNur für RNA-Arbeiten reserviert.
GewebehomogenisatorPro Scientific01-01200Nur für RNA-Arbeiten reserviert, gemäß Protokoll sterilisiert.
TRIzol ReagenzFisher Scientific15 596 026Steril, nukleasefrei. Nur für RNA-Arbeiten reserviert.

Referenzen

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