Methodenartikel

Schnelle, enzymatische Methoden zur Amplifikation minimaler, linearer Templates für das Protein-Prototyping mit zellfreien Systemen

DOI:

10.3791/62728

⸱

14. Juni 2021

 , 
1Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Studie beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung großer (μg-mg) Mengen an DNA für Protein-Screening-Kampagnen aus synthetischen Genfragmenten ohne Klonen oder Verwendung lebender Zellen. Die minimale Schablone wird enzymatisch verdaut und zirkuliert und dann mit isothermer Rollkreisamplifikation amplifiziert. Zellfreie Expressionsreaktionen könnten mit dem ungemeinigten Produkt durchgeführt werden.

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt das Design einer minimalen DNA-Schablone und die Schritte zur enzymatischen Amplifikation, die ein schnelles Prototyping von assaybaren Proteinen in weniger als 24 h unter verwendung zellfreier Expression ermöglicht. Nach Erhalt der DNA von einem Anbieter wird das Genfragment PCR-amplifiziert, geschnitten, zirkuliert und kryo-bankiert. Eine kleine Menge der bankierten DNA wird dann verdünnt und signifikant (bis zu 106x) mittels isothermer Rollkreisamplifikation (RCA) amplifiziert. RCA kann Mikrogrammmengen der minimalen Expressionsvorlage aus Pikogrammwerten des Ausgangsmaterials liefern (mg-Werte, wenn alle synthetischen Ausgangsfragmente verwendet werden). Bei dieser Arbeit ergab eine Ausgangsmenge von 20 pg 4 μg des Endprodukts. Das resultierende Cinch-Produkt (Konatemer der minimalen Schablone) kann ohne Reinigungsschritte direkt zu einer zellfreien Reaktion hinzugefügt werden. Da diese Methode vollständig PCR-basiert ist, kann sie in Verbindung mit automatisierten Liquid-Handling-Systemen zukünftige Hochdurchsatz-Screening-Bemühungen ermöglichen.

Einleitung

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Die zellfreie Genexpression (CFE) hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug mit vielen Anwendungen entwickelt. Solche Anwendungen umfassen krankheitsnachweis1,2,3,4,5,6, Mikronährstoff- und niedermolekulare Detektion7,8,9,10,11,12 , Bioproduktion13

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Protokoll

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1. Gestaltung des Genfragments

HINWEIS: Das Genfragment sollte alle notwendigen genetischen Elemente für die Transkription/Translation enthalten, einschließlich Promotor, Ribosomenbindungsstelle (RBS), Startcodon, das interessierende Gen und Terminator. Während der Terminator für eine lineare Ausdrucksvorlage (LET) nicht erforderlich ist, ist es wichtig, wenn der Benutzer beschließt, die Sequenz in ein Plasmid einzufügen. Diese Sequenzen wurden aus dem pJL1-sfGFP-Plasmid55 (Geschenk aus dem Labor von Michael Jewett) entnommen, das einen T7-Promotor verwendet. Zusätzlich zu diesen notwendigen genetischen Elementen wird ....

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Ergebnisse

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Die Expression von sfGFP aus RCA-Vorlagen war vergleichbar mit der des pJL1-Plasmids, wenn nur 0,30 μL ungereinigte RCA-DNA in einer 15-μL-Reaktion verwendet wurden (Abbildung 2A). Tatsächlich scheint die Verdoppelung und Verdreifachung der Menge der Vorlage keinen Nutzen im BL21 DE3 Star-Extrakt zu bieten, was auf bereits gesättigte Konzentrationen der Vorlage bei 0,30 μL pro Reaktion hindeutet. Umgekehrt scheint es von Vorteil zu sein, die Menge an RCA-Vorlage zu erhöhen, wenn sie zu Zelle.......

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Diskussion

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Das Gen von Interesse kann jedes gewünschte Protein sein, aber es ist am besten, mit einem fluoreszierenden Protein als bequemer Reporter für echtzeit- oder endpunkte Auslesung auf einem Well Plate Reader für neue Anwender dieser Methode zu beginnen. Für neue Proteinsequenzen kopieren Sie die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins und fügen Sie sie in das gewünschte Codon-Optimierungswerkzeug61,62ein. Es gibt normalerweise viele verfügbare Organismen und Stäm.......

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Offenlegungen

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Nigel Reuel ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von BigHat Biosciences Inc., einem Unternehmen, das zellfreie Systeme für das Design von Antikörpern einsetzt.

Danksagungen

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Die Autoren erkennen NIH 1R35GM138265-01 und NSF 2029532 für die teilweise Unterstützung dieses Projekts an.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AlalineFormediumDOC0102
AmmoniumglutamatMP BiomedicalsMP21805951
ArgininFormediumDOC0106
AsparaginFormediumDOC0114
AsparaginsäureFormediumDOC0118
ATPSigmaA2383
Axygen SiegelfolieCorningPCR-SP
CMPSigmaC1006
Coenzym ASigmaC3144
CutSmart PufferNEBB7204SAusgestattet mit HindIII
CysteinFormediumDOC0122
DNA Clean and Concentrator KitZymo ResearchD4004Wird zur Reinigung von DNA
dNTPsNEBN0447
E. coli tRNASigma (Roche)10109541001
FolinsäureSigma47612
GenfragmentIDT
GlutaminsäureFormediumDOC0134
GlutaminFormediumDOC0130
GlycinFormedium
GMPSigmaG8377
HEPESSigmaH3375
HindIII-HFNEBR3104L
HistidinFormediumDOC0142
IsoleucinFormediumDOC0150
LeucinFormediumDOC0154
LysinFormediumDOC0158
MagnesiumglutamatSigma49605
MethioninFormediumDOC0166
Mikrotiterplatte (384 Well)Greiner781906
Mikrotiterplatte (96 Well)Greiner655809
Multimode Plate ReaderBioTekSynergy Neo2
NADSigmaN8535
NanoPhotometerImplenNP80
OneTaq DNA-PolymeraseNEBM0480
PCR-RöhrchenVWR20170-012
PhenylalaninFormediumDOC0170
PhosphoenolpyruvatSigma (Roche)10108294
KaliumglutamatSigmaG1501
KaliumoxalatFisher ScientificP273
ProlinFormediumDOC0174
PutrescinSigmaP5780
SerinFormediumDOC0178
SpermidinSigmaS0266
T4 DNA-LigaseNEBM0202S
T4 DNA-Ligase-ReaktionspufferNEBB0202SGeliefert mit T4-DNA-Ligase
TempliPhi AmplifikationskitCytiva25640010Verwendet für RCA-Thermocycler
BioradC1000 Touch
ThermoblockEppendorfThermoMixer FP
ThreoninFormediumDOC0182
TryptophanFormedium
TyrosinFormediumDOC0190
UMPSigmaU6375
ValinFormediumDOC0194
verwendetDOC0138DOC0186

Referenzen

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  1. Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978(2021).
  2. Pardee, K., et al. Low-Cost Det....

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Schlagwörter

Zellfreie ExpressionRolling Circle Amplifikationminimales DNA TemplatePCR AmplifikationDNA ZirkularisierungHigh Throughput Screeningsynthetische GenfragmenteProteinexpressions Workflowenzymatische DNA Amplifikation

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