Summary
Här tillhandahåller vi ett protokoll för screening potentiella transkription faktorer inblandade i utvecklingen av dendritiska cell (DC) med hjälp av lentiviral transduktion av shRNA för att erhålla stabil knockdown cellinjer för in vitro DC differentiering.
Abstract
Dendritiska celler (DCs) är viktiga antigen-presenterar celler som förbinder medfödda och adaptiva immunsvar. DCs är heterogena och kan delas in i konventionella DCs (cDC) och plasmacytoid DCs (PDC). cDC är specialiserat på att presentera antigener för och aktivera naiva T-celler. Å andra sidan kan PDCs producera stora mängder av typ I interferoner (IFN-I) under virusinfektion. Specifikationen av DCs sker i ett tidigt skede av DC-stamceller i benmärgen (BM) och definieras av ett nätverk av transkriptionsfaktorer (TFs). CDCs uttrycker till exempel mycket ID2, medan PDC:er uttrycker E2-2. Eftersom fler och fler delmängder av DC identifieras finns det ett växande intresse för att förstå specifika TFs som styr utvecklingen av domänkontrollanten. Här etablerar vi en metod för att screena TFs kritiska för DCs differentiering in vitro genom att leverera lentivirus som bär kort hårnål RNA (shRNA) till en odödliggjord hematopoetisk stam och stamceller (iHSPCs) linje. Efter urval och in vitro differentiering analyseras cDC och pDC potential av de stabila knockdown cellinjerna av flöde cytometri. Detta tillvägagångssätt ger en plattform för att identifiera gener som potentiellt styr DC-öden från förfäder in vitro.
Introduction
DCs är viktiga tillsynsmyndigheter för medfödd och adaptiv immunitet1. DCs klassificeras huvudsakligen i två funktionellt distinkta populationer, nämligen PDC och CDC. CDC omfattar dessutom två delmängder, nämligen cDC av typ I och typ II, cDC1 respektive cDC2s. pDC, som uttrycker BST2, Siglec-H och mellanliggande nivåer av CD11c hos möss3,4, är de celler som kan utsöndra stora mängder IFN-I under inflammation och virusinfektion5. På grund av deras robusta IFN-I-producerande förmåga misstänks de också spela en nyckelroll i utvecklingen av autoimmuna sjukdomar, inklusive systemisk lupus erythematosus (SLE)6. cDC1s, som definieras av ytuttrycket av XCR1, CD8a, CLEC9A och CD103 hos möss7, är specialiserade på aktivering och polarisering av cytotoxiska CD8 + T-celler (CTLs) genom antigen korspresentation, vilket initierar typ I immunitet som svar på intracellulära patogener och cancer8,9. Å andra sidan kan cDC2s, som uttrycker CD11b och CD172α (även känd som Sirpα) hos både människor och möss, aktivera CD4 + T-celler och främja typ II immunsvar mot allergen och parasiter10, samt modulera typ III immunitet efter extracellulära bakterier och mikrobiota erkännande11,12.
Diversifiering av DC bestäms av en grupp TFs från hematopoetiska stamceller och stamceller (HSPCs) i BM. E2-2 (kodad av Tcf4) är en master regulator för differentiering och funktion av PDC13,14. Däremot driver hämmaren av DNA-bindning 2 (ID2) cDC-specifikation och hämmar pDC-utveckling genom att blockera E-proteinaktivitet15. Dessutom kräver utvecklingen av cDC1s IRF8 och BATF3, medan differentiering av cDC2s i hög grad beror på IRF416. De senaste verken har undersökt heterogeniteten hos PDC17 och CDC och deras transkriptionsreglering18. På grund av komplexiteten i DC-nätverket finns det ett ouppfyllt behov av att upprätta en plattform för att identifiera andra TFs som styr utvecklingen och funktionaliteten hos DCs.
Här använde vi en iHSPC som genererades genom att uttrycka östrogenreglerad nukleär flyttning av Hoxb8 i BM-celler (även kallad Hoxb8-FL-celler)19. iHSPCs kan sprida sig och förbli i ett odifferentierat stadium i närvaro av β-estradiol och Flt3 ligand (FL), medan de börjar differentiera sig till olika DC-typer i närvaro av FL vid tillbakadragande av β-estradiol19. Baserat på denna funktion kan vi slå ner gener av intresse i stamföreläggandestadiet, följt av att undersöka effekten på in vitro-differentiering av pDC och CDC. Därför är denna metod ett kraftfullt verktyg för att upptäcka de gener som reglerar utvecklingen och funktionen hos DCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hantering av lentivirus utförs enligt regleringen av Institutionen för miljöhälsa och säkerhet vid National Taiwan University College of Medicine.
1. Beredning av odödliggjord hematopoetisk stam och stamceller (iHSPCs)
- Håll iHSPC-cellinjen i komplett RPMI 1640-medium som innehåller 100 ng/mL FL och 1 μM β-estradiol.
- Passage cellerna i ett förhållande av 1:10 var tredje dag.
OBS: Gör komplett RPMI 1640 medium genom att komplettera med 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 5 x 10-5 M β-mercaptoethanol och 10 μg/mL gentamicin. Rekombinant murine FL är också kommersiellt tillgänglig.
2. Lentiviral transduktion
- Platta iHSPCs med en densitet av 1 x 105 celler/brunn i 12-brunnsplattor i 1 ml komplett medium innehållande 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol och 8 μg/mL polybrene.
OBS: Koncentrationen av polybrene beror på celltyperna och ligger vanligtvis i intervallet 4-8 μg/ml. - Tillsätt shRNA-bärande lentivirus i varje brunn vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 100.
OBS: Den lentivirala vektorn är pLKO.1-Puro med en puromycinmarkeringsmarkör (figur 1). Målsekvenserna av shRNAs mot LacZ, Tcf4 respektive Id2 listas i tabellen över material. MOI definieras av antalet virions som tillsätts per cell under infektion.
- Snurra plattorna vid 1 100 x g i 90 min vid 37 °C.
OBS: Spinninfektion utförs med hjälp av en svängskopa rotor. - Inkubera plattan som innehåller infekterade celler över natten vid 37 °C i en inkubator.
OBS: Om cellerna är känsliga för polybrene, uppdatera sedan cellerna med hela mediet utan polybrene efter spinninfektionen. - Uppdatera celler med komplett medium som innehåller 100 ng/mL FL och 1 μM β-estradiol 24 h efter infektionen.
- Tillsätt 6 μg/ml puromycin till mediet för att markera de infekterade cellerna efter ytterligare 24 timmar.
OBS: Transduced lentiviral vektor tar vanligtvis 48 h för att uttrycka gener, inklusive puromycinresistent gen. Se till att koncentrationen av puromycin optimeras för varje cellinje. - Uppdatera urvalsmediet som innehåller 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol och 6 μg/mL puromycin var tredje dag och behåll cellerna i minst en vecka för att expandera de stabilt transduced iHSPC-cellerna.
Obs: Puromycin-markeringen träder vanligtvis i kraft 48 timmar senare, och urvalsperioden beror på celltyper.
3. Mätning av knockdown-effektivitet genom omvänd transkription och PCR i realtid (RT-PCR)
- Extrahera totalt RNA från 1 x 107 shLacZ, shTcf4 och shId2 stabila knockdown iHSPC-celler med kommersiell RNA-extraktion reagens och fäll ut RNA från vattenskiktet med isopropanol, följt av att tvätta RNA-fällningen med 75% etanol.
- Lös upp RNA (~ 5 μg) med 5 μL DEPC-behandlat H2O och justera koncentrationen till 1 μg/μL.
- Ta 1-3 μg RNA, blanda med DEPC-behandlad H2O till en slutlig volym på 17,4 μL, tillsätt 1 μL 1 enhet/μL RNase-fri DNase I och inkubera i 20 min vid 37 °C.
OBS: Detta steg är att smälta det genomiska DNA i RNA-proverna. - Tillsätt 1 μL 20 mM EDTA till RNA-proverna, inkubera vid 65 °C i 10 minuter för att inaktivera DNase I och sätt RNA-proverna omedelbart vid 4 °C.
- Tillsätt 11,6 μL av reaktionsblandningen som innehåller 1 μL oligo (dT) primers (45 μM), 6 μL 5x 1: a strängbuffert, 3 μL dNTP (2 mM), 0,6 μL RNase-hämmare (50 Unit/μL) och 1 μL omvänd transkriptas (200 Unit/μL) till RNA-proverna (50 Unit/μL) och 1 μL omvänd transkriptas (2 mM), 0,6 μL RNase-hämmare (50 Unit/μL) och 1 μL omvänd transkriptas (200 Unit/μL) till RNA-proverna (50 Unit/μL) och 1 μL omvänd transkriptas (2 mM), 0,6 μL RNase-hämmare (50 Unit/μL) och 1 μL omvänd transkriptas (200 Unit/μL) till RNA-proverna (50 Unit/μL) och 1 μL omvänd transkriptas (2 mM), 0,6 μL RNase-hämmare (50 Unit/μL) och 1 μL omvänd transkriptas (200 Unit/μL) till RNA-proverna (50 unit/μL) och 1 μL omvänd transkriptas (200 unit/μL) till RNA-proverna (50 unit/μ
- Stoppa reaktionen genom uppvärmning vid 70 °C i 10 minuter och späd reaktionsblandningen med 30 μL H2O.
- Ta 2 μL av den utspädda RT-reaktionsblandningen som DNA-mall och PCR förstärka den med hjälp av primers mot Tcf4 eller Id2 (se tabell 1 för termocykelförhållanden).
OBS: Primersekvenserna ingår i materialtabellen.
4. In vitro-differentiering av de stabila knockdown iHSPC-cellinjerna
- Bibehålla den stabila enskilda knockdown av LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) eller Id2 (shId2) i iHSPCs i komplett medium som innehåller 100 ng/mL FL och 1 μM β-estradiol.
- Samla shLacZ, shTcf4 och shId2 odifferentierade iHSPCs i ett 15 mL rör och centrifug i 5 min vid 500 x g för att pellet cellerna.
- Kassera supernatanten och tillsätt 10 ml PBS för att tvätta cellerna. Upprepa det här steget två gånger.
- Återanvänd och frö iHSPC-cellerna med en densitet av 2 x 105 celler/ml till en 12-välplatta i 1 ml komplett medium som endast innehåller 100 ng/ml FL.
- Tillsätt 1 ml färskt komplett medium som innehåller 100 ng/mL FL tre dagar senare.
- Analysera de differentierade cellerna (shLacZ, shTcf4 och shId2 iHSPCs) efter flödescytometri två dagar senare.
5. Flödescytometrisk analys av de differentierade DCs
- Samla cellerna i 1,5 ml-rör genom att leda cellerna upp och ner 2-3 gånger i plattan och centrifugera i 5 min vid 500 x g vid rumstemperatur (RT).
OBS: In vitro-differentierade DCs kommer att fästas något på plattorna. Skonsam pipettering hjälper till att återställa DCs från plattorna. - Kassera supernatanten och återanvänd cellerna i 50 μL FACS-buffert. Tillsätt sedan 50 μL anti-CD16/32 hybridom supernatant och inkubera i 5-10 min på is.
OBS: Den Fc-blockerande antikroppen förhindrar ospecificerad bindning av antikroppar mot Fc-receptorer som uttrycker sig på vissa myeloiska celler och B-celler och är kommersiellt tillgänglig via olika leverantörer. - Tillsätt fluorescerande färgkonjugerade antikroppar (0,04 μg för varje antikropp) direkt till cellerna och inkubera i 15 minuter på is i mörkret. De antikroppar som används är APC/cy7 antimus CD11c, FITC anti-mouse CD11b och PE anti-mouse B220.
PDC definieras som CD11c+CD11b-B220+, och CDC definieras som CD11c+CD11b+B220-. - Tvätta celler med 1 ml FACS-buffert och centrifug i 5 min vid 500 x g vid RT.
- Återanvänd cellerna i 100 μL FACS-buffert och analysera efter flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kartan över lentiviral vektor pLKO.1-Puro visas (bild 1). Efter leverans av lentivirus uttrycker shRNA mot LacZ (en icke-inriktning kontroll), Tcf4 och Id2 i IHSPCs, knockdown effektivitet bekräftas av RT-qPCR visade att uttrycket av Tcf4 minskades i shTcf4 iHSPCs, jämfört med shLacZ iHSPCs (figur 2A). Å andra sidan observerades det minskade uttrycket av Id2 också i shId2 iHSPCs, jämfört med shLacZ iHSPCs kontroll (figur 2B). Cellinjerna shLacZ, shTcf4 och shId2 iHSPCs differentierades till pDC och cDC in vitro med FL. Efter fem dagars kultur av shLacZ iHSPCs var frekvensen av CD11c + celler, som representerar DC population7, cirka 95% (figur 3A, vänster panel). Nedslagning av Tcf4 eller Id2 minskade dock genereringen av CD11c+ DCs något (figur 3A, mitten och höger panel). Dessutom visade ytterligare analys av CD11c + DCs att shLacZ iHSPCs differentierades till 70% av cDC (CD11c + CD11b + B220 +) och 22% av pDCs (CD11c + CD11b-B220 +) (figur 3B, vänster panel). ShTcf4 iHSPCs genererade dock en betydligt lägre andel pDC (4 %) än shLacZ-kontrollen (figur 3B, mittpanelen). Å andra sidan genererade shId2 iHSPCs en betydligt lägre andel cDC (54%) men en högre andel pDC (39%) än shLacZ-kontrollen (figur 3B, höger panel). Därför tyder dessa resultat på att iHSPCs troget återspeglar samma krav på transkriptionsfaktorer för att kontrollera DC-utveckling.
Bild 1: Konstruktionen av lentiviral vektor pLKO.1-Puro. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Knockdown-effektiviteten hos shTcf4 och shId2. Efter stabil gen knockdown isolerades RNAs från shLacZ, shTcf4 och shId2 iHSPCs och återförändras till cDNA, och uttrycket av Tcf4 och Id2 mättes med RT-qPCR. Relativa genuttryck normaliserades till Rpl7. A. Uttrycket av Tcf4 i shLacZ och shTcf4 iHSPCs. B. Uttrycket av Id2 i shLacZ och shId2 iHSPCs. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Knockdown av Tcf4 försämrar utvecklingen av pDC, medan nedslagning av Id2 minskar cDC-genereringen från iHSPCs in vitro. iHSPCs var stabilt transduced med shLacZ, shTcf4 och shId2-bärande lentiviruses, sedan in vitro differentieras i DCs med FL (100 ng/mL). Efter kultur i 5 dagar färgades cellerna och analyserades av flöde cytometri. A. Procentandelen CD11c+-celler visas. B. Analysen för pDC (CD11c+B220+CD11b-) och CDC (CD11c+B220-CD11b+) visas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| PCR-reaktion | |||
| Trappsteg | Temperatur | Tid | Cykler |
| Första denaturation | 95°C | 3 minuter | 1 |
| Denaturering | 95°C | 15 sekunder | 35-40 |
| Glödgning | 60°C | 20 sekunder | |
| Förlängning | 72°C | 20 sekunder | |
| Slutlig förlängning | 80°C | 20 sekunder | 1 |
| Hålla | 4°C | ∞ | 1 |
Tabell 1: Termocykelförhållanden för PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lentivirusbaserade shRNA-vektorer används ofta för gendämpning genom virustransduktion i celler och möjliggör stabil integration i värdgenomet. Olika transduktionseffektivitet i olika celltyper måste dock övervägas, och ett antal metoder har vidtagits för att övervinna detta problem.
Polybrene är en polyklik polymer som kan neutralisera laddningarna på cellmembranet och därigenom förbättra virionbindningen till cellerna under transduktion20. Även om det är ett effektivt sätt att öka flyttningshastigheten, är det också giftigt för vissa celltyper när man lägger till överdrivna mängder. I detta fall är det nödvändigt att testa toxiciteten hos polybrene och optimera koncentrationen i olika celler. Protaminsulfat, en katjonisk förening, kanske ett alternativt tillvägagångssätt för att öka cellens livskraft21. Dessutom kan uppdatera kompletta medier på samma infektionsdag förbättra representerar överlevnadsgraden efter transduktion.
De flesta shRNA-leveranssystem har en selektiv markör för att eliminera celler som inte har smittats framgångsrikt. Det lentivirala systemet vi använde innehåller en puromycinresistent gen så att de infekterade cellerna kunde väljas efter transduktion. Dessutom är lentivirus som uttrycker GFP också ett annat alternativ för valet. Det finns dock både fördelar och nackdelar med båda metoderna. Att använda puromycin som urvalsmetod är svårt att direkt mäta flyttningseffektiviteten om inte uttrycket av målgener bekräftades av qPCR. Men puromycin ger stress för urval för att hålla det främmande DNA inuti cellerna och upprätthålla knockdown-fenotypen. Däremot är GFP också en urvalsmetod som inte ger stress till cellerna även om flyttningseffektiviteten omedelbart kan utvärderas av flödescytometri.
En av begränsningarna i denna metod är det relativt lilla antalet cDC1-celler som genereras av iHSPCs in vitro19. Även om iHSPCs har pDC och CDC-potential som drivs av FL in vitro, är de flesta cDC-undertyper som genereras cDC2s, men inte cDC1s. Detta beror sannolikt på kravet på Notch-signalering under in vitro cDC1 differentiering22. Därför kan samkultur med OP9-DL1 stromal celler som uttrycker Notch ligand Delta-liknande 1 återställa cDC1 potential av iHSPCs, vilket förbättrar de mekanistiska studierna på cDC1s.
Tillämpningen av detta protokoll inte bara för att undersöka TFs roll utan också för andra gener, som metaboliska gener som sannolikt kommer att delta i utvecklingen av DCs eller andra celltyper. Ett framväxande koncept belyser att DC utvecklingsväg är associerad med olika cellulära metabolism23,24. Därför är gen knockdown i DC-stamceller en kraftfull strategi för att studera metabolisk reglering som svar på miljösignaler och bestämma hur olika metaboliska vägar reglerar DC-differentiering genom att slå ner kritiska gener i ämnesomsättningen25. Å andra sidan har iHSPCs kapacitet att differentiera sig till myeloiska celler bortom DC-härstamningar genom att använda specifika differentieringsfaktorer. Användning av makrofag koloni-stimulerande faktor (M-CSF) och granulocyt-koloni stimulerande faktor (G-CSF) resulterar i utvecklingen av makrofager respektive granulocyter, från iHSPCs19. Baserat på samma strategi kan denna metod också tillämpas på forskning om myeloisk cellutveckling.
Sammantaget ger det beskrivna protokollet från gen knockdown till in vitro differentiering av iHSPCs ett snabbt och effektivt sätt att underlätta studien av DC-utveckling och svarar på grundläggande frågor om immuncellsutveckling i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för teknisk support från Dr. Tz-Ling Chen. Vi tackar National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) för att ha tillhandahållit shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 och MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) |
References
- Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).
- Liu, Y. -J. IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).
- Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A.
- Durai, V., Murphy, K. M.
- Mashayekhi, M., et al. CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites. Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
- Kumamoto, Y., et al. CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity. Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Grajkowska, L. T., et al. Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification. Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).
- Jackson, J. T., et al. Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages. The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).
- Suzuki, S., et al. Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).
- Rodrigues, P. F., et al. Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).
- Brown, C. C., et al. Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity. Cell. 179 (4), 846-863 (2019).
- Redecke, V., et al. Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential. Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection. Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).
- Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).
- Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).
- Pearce, E. J., Everts, B.
- Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information. Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
