Summary
Lärande och minne är potenta mätvärden för att studera antingen utvecklingsmässiga, sjukdomsberoende eller miljömässigt inducerade kognitiva funktionsnedsättningar. De flesta kognitiva bedömningar kräver specialiserad utrustning och omfattande tidsåtaganden. Pendelboxens analys är dock ett associativt inlärningsverktyg som använder en konventionell gellåda för snabb och tillförlitlig bedömning av vuxen zebrafiskkognition.
Abstract
Kognitiva underskott, inklusive nedsatt lärande och minne, är ett primärt symptom på olika utvecklings- och åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar och traumatisk hjärnskada (TBI). Zebrafisk är en viktig neurovetenskaplig modell på grund av deras transparens under utveckling och robusta regenerativa förmågor efter neurotrauma. Medan olika kognitiva tester finns i zebrafisk, undersöker de flesta kognitiva bedömningar som är snabba icke-associativt lärande. Samtidigt kräver associativt lärande analyser ofta flera dagar eller veckor. Här beskriver vi ett snabbt associativt inlärningstest som använder en negativ stimulans (elektrisk stöt) och kräver minimal förberedelsetid. Shuttle box-analysen, som presenteras här, är enkel, idealisk för nybörjare utredare, och kräver minimal utrustning. Vi visar att detta skyttelboxtest, efter TBI, reproducerbart bedömer kognitivt underskott och återhämtning från ung till gammal zebrafisk. Dessutom är analysen anpassningsbar för att undersöka antingen omedelbart eller fördröjd minne. Vi visar att både en enda TBI och upprepade TBI-händelser negativt påverkar lärande och omedelbart minne men inte fördröjd minne. Vi drar därför slutsatsen att skyttelboxanalysen reproducerande spårar progressionen och återhämtningen av kognitiv svikt.
Introduction
Lärande och minne används rutinmässigt som mätvärden för kognitiv försämring, vilket händer på grund av åldrande, neurodegenerativ sjukdom eller skada. Traumatiska hjärnskador (TBC) är den vanligaste skadan som resulterar i kognitiva underskott. TBC är av växande oro på grund av deras associering med flera neurodegenerativa störningar, såsom frontotemporal demens och Parkinsons sjukdom1,2. Dessutom tyder de ökade beta-amyloidaggregeringarna som observerats hos vissa TBI-patienter på att det också kan vara förknippat med utvecklingen av Alzheimers sjukdom3,4. TBC är ofta resultatet av trubbigt våld trauma och spänner över en radsvårighetsgrader 5, med milda hjärnskador (miTBI) är den vanligaste. MiTBIs är dock ofta orapporterade och feldiagnostiserade eftersom de resulterar i mindre kognitiva försämringar under endast en kort period, och de skadade individerna återhämtar sig vanligtvishelt 6. Däremot har upprepade miTBI-händelser varit ett växande problem eftersom det är mycket vanligt hos unga och medelålders vuxna, kan ackumuleras övertid 7, kan försämra kognitiv utveckling och förvärra neurodegenerativa sjukdomar1,2,3,4,5, liknande individer som upplever antingen en måttlig eller svår TBI8.
Zebrafish (Danio rerio) är en användbar modell för att utforska en mängd olika ämnen inom neurovetenskap, inklusive förmågan att regenerera förlorade eller skadade nervceller i hela centrala nervsystemet9,10,11,12,13. Neurala regenerering visades också i telencephalon, som innehåller archipallium i regionen dorsala-inre. Denna neuroanatomiska region är analog med hippocampus och krävs sannolikt för kognition i fisk och för korttidsminnet hos människor14,15,16. Dessutom har zebrafiskbeteendet karakteriserats ochkatalogiserats 17. Lärande har studerats genom olika tekniker, inklusive tillvänjning till det häpnadsväckandesvaret 18, som kan representera en snabb form av icke-associativt lärande när det utförs i korta block och med uppmärksamhet på den snabba förfallstiden19. Mer komplexa tester av associativt lärande, såsom T-lådor, plus-labyrinter och visuelldiskriminering 20,21 används men är ofta tidskrävande, kräver dagar eller veckor av förberedelse och förlitar sig på shoaling eller positiv förstärkning. Här beskriver vi ett snabbt paradigm för att bedöma både associativt lärande och antingen omedelbart eller försenat minne. Denna shuttle box analys använder en aversive stimulans och negativ förstärkning konditionering för att bedöma kognitiva underskott och återhämtning efter trubbigt våld TBI. Vi visar att oskadad kontroll av vuxna zebrafiskar (8-24 månader) reproducerbart lär sig att undvika rött ljus inom 20 försök (<20 minuters bedömning) i skyttelboxen, med en hög grad av konsekvens mellan observatörer. Dessutom visar vi med hjälp av skyttelboxen att inlärnings- och minnesförmågor hos vuxna (8-24 månader gamla) är konsekventa och användbara för att analysera kognition med betydande försämringar mellan antingen olika TBI-svårighetsgrader eller upprepad TBI. Dessutom kan denna metod snabbt användas som ett mått för att spåra ett brett spektrum av sjukdomsprogressioner eller effekt av läkemedelsinterventioner som påverkar underhåll eller återhämtning av kognition hos vuxna zebrafiskar.
Här ger vi en instruktionsöversikt över en snabb kognitiv bedömning som kan undersöka både komplext associativt lärande (avsnitt 1) och minne när det gäller både omedelbart och fördröjd minne. Detta paradigm ger en bedömning av korttids- och långtidsminnet för en lärd associativ kognitiv uppgift (avsnitt 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafisk växte upp och bibehölls i Notre Dame Zebrafish-anläggningen i Freimann Life Sciences Center. De metoder som beskrivs i detta manuskript godkändes av University of Notre Dame Animal Care and Use Committee (Djurskyddsförsäkringsnummer A3093-01).
1. Paradigm för inlärning av skyttelboxar( Figur 1A)
OBS: Inlärningsparadigmet ger en snabb bedömning av kognition när det gäller associativt lärande.
- Förbered skyttelboxen genom att modifiera en 30,5 x 19 x 7,5 cm gellåda med en 5 x 19 cm bit plexiglas av akvariekvalitet som läggs till på varje sida i 45° vinkel. Gör en linje som markerar tankens halvvägspunkt för att bedöma när fisken har korsat mitten av tanken (figur 1B).
- Tillsätt 800 ml systemvatten till skyttelboxen. Gör detta vatten genom att lösa upp 60 mg Instant Ocean i 1 L avjoniserat RO-vatten. Fyll vattnet till mitten av tanken till ett djup av 5 cm.
OBS: Ersätt med färskt systemvatten vid 28 °C varje timme eller efter provning av 3 fiskar. - Placera 2-3 fiskar i en hålltank som innehåller systemvatten, som ligger i ett mörkt rum där pendelboxens analys kommer att utföras.
- I det mörka rummet placerar du 1 fisk i mitten av skyttelboxen, säkrar locket och fästr elektroderna på en strömförsörjning.
OBS: Rummet ska förbli så mörkt som möjligt under acklimatisering och testning.
- I det mörka rummet placerar du 1 fisk i mitten av skyttelboxen, säkrar locket och fästr elektroderna på en strömförsörjning.
- Acklimatisera fisken i skyttelboxen i 15 minuter.
OBS: Prövaren bör stanna kvar i rummet under acklimatiseringsperioden eller återvända till testrummet tyst med gott om tid före provningen så att fisken kan anpassa sig till prövarens närvaro. Framgångsrik acklimatisering kan övervägas när fisken fritt utforskar tanken.- Om fisken inte utforskar, fortsätt acklimatisering i ytterligare 15 minuter. Om fisken fortfarande inte acklimatiserar sig till skyttelboxen, ta bort fisken. Använd inte denna fisk för testning.
- Lyser manuellt en 800-lumen röd lins ficklampa ~ 2 cm från gelboxväggen på sidan som upptas av fisken, efter acklimatisering.
OBS: Starta inte en provperiod om fisken vilar bredvid platinatråden mot väggen nära skyttelboxens djupa ändar. - Lys ljusstimulansen direkt på fisken och följ manuellt fiskens laterala rörelse med ljuset för att säkerställa kontinuerlig visualisering av stimulansen (Figur 1C). Fortsätt att ge ljusstimulansen tills något av följande villkor är uppfyllt.
- Tänk på att leden lyckas om fisken korsar tankens halvvägspunkt inom de 15 s av ljusexponering. När fisken har korsat halvvägs, stoppa ljusstimulansen omedelbart (Bild 1D).
- Betrakta spåret som misslyckat om fisken inte korsar över lådans halvvägspunkt på 15 s. I detta fall, använd en elektrofores strömförsörjning för att applicera en negativ chock stimulans (20 mV:1 A) alternerande 2 s av På, 2 s av Av under en 15 s period (högst 4 chocker), eller tills fisken passerar halvvägs punkten i lådan, då punkt avsluta både ljus och negativ stimulans.
- Låt fisken vila i 30 s och upprepa steg 1,5-1,6,2. Håll ett detaljerat register över ordningen på lyckade försök (1.6.1) och misslyckade försök (1.6.2).
Obs: Här definierade vi lärande som slutförandet av 5 på varandra följande framgångsrika försök. När lärdomen har visats bör fisken avlägsnas från skyttelboxen och avlivas på ett humant sätt.
2. Minnesparadigm( Figur 1A)
OBS: Detta paradigm ger en bedömning av korttids- och långtidsminnet för en lärd associativ kognitiv uppgift.
- Utbildningsperiod
- Tillsätt 800 ml systemvatten till skyttelboxen. Gör detta vatten genom att lösa upp 60 mg Instant Ocean i 1 L avjoniserat RO-vatten. Fyll vattnet till mitten av tanken till ett djup av 5 cm.
OBS: Vatten bör bytas ut mot färskt systemvatten vid 28 °C varje timme eller efter provning av 3 fiskar. - Placera 2-3 fiskar i en hålltank som innehåller systemvatten, beläget i ett mörkt rum där pendelboxens analys kommer att utföras.
- I det mörka rummet placerar du 1 fisk i mitten av skyttelboxen, säkrar locket och fästr elektroderna på en strömförsörjning.
OBS: Rummet ska förbli så mörkt som möjligt under acklimatisering och testning. - Acklimatisera fisken i skyttelboxen i 15 minuter.
OBS: Prövaren bör stanna kvar i rummet under acklimatiseringsperioden eller återvända till testrummet tyst med gott om tid före testningen så att fisken kan anpassa sig till prövarens närvaro. Bestäm framgångsrik acklimatisering när fisken fritt utforskar tanken. - Om fisken inte utforskar, fortsätt acklimatisering i ytterligare 15 minuter. Om fisken fortfarande inte acklimatiserar sig till skyttelboxen, ta bort fisken och använd den inte för testning.
- Efter den framgångsrika acklimatiseringen, lyser manuellt en 800-lumen röd lins ficklampa ~ 2 cm från gelboxens sidovägg, på sidan av skyttelboxen som upptas av fisken.
- Lys ljusstimulansen direkt på fisken och följ fiskens laterala rörelse med ljuset för att säkerställa kontinuerlig visualisering av stimulansen av fisken.
- Medan ljuset lyser på fisken, applicera samtidigt den negativa chockstimulansen (20 mV:1 A) alternerande 2 s På, 2 s Av i 15 s (högst 4 stötar), eller tills fisken passerar lådans halvvägspunkt. När detta har uppnåtts, avsluta både ljuset och den negativa stimulansen.
OBS: Låt fisken vila i 30 s och upprepa sedan steg 2.1.6-2.1.8 för 25 iterationer(figur 1A).
- Tillsätt 800 ml systemvatten till skyttelboxen. Gör detta vatten genom att lösa upp 60 mg Instant Ocean i 1 L avjoniserat RO-vatten. Fyll vattnet till mitten av tanken till ett djup av 5 cm.
- Inledande testning
- Låt fisken vila i 15 minuter efter träningsperioden. Ta inte bort dem från skyttelboxen. Testa den första minnes kvarhållningen genom att spela in varje test som strikt godkänd/misslyckad, omedelbart efter denna viloperiod.
- Applicera endast ljusstimulansen i upp till 15 s och registrera svaren enligt följande.
- Betrakta försöket som framgångsrikt om fisken korsar halvvägs i skyttelboxen inom 15 s efter att ha startat ljusstimulansen. Stoppa ljusstimulansen omedelbart när fisken korsar halvvägspunkten.
- Betrakta försöket som misslyckat om fisken inte korsar halvvägs i skyttelboxen 15 s efter att ha startat ljusstimulansen. Stoppa ljusstimulansen efter 15 s.
OBS: Under den första testningen tillämpas inte en negativ stimulans efter ett misslyckat försök.
- Upprepa steg 2.2.2, med en viloperiod på 30 s mellan försöken, och spela in lyckade försök (2.2.2.1) och misslyckade försök (2.2.2.2) i 25 försök. Detta värde kommer att fungera som en individuell referens för varje fisk.
- Omedelbart minne
- Inducera skada omedelbart efter den första testperioden genom föredraget skadeparadigm (t.ex. ett trubbigt våld med hjälp av den modifierade Marmarou-viktminskningen). Husfisk individuellt för en enkel identifiering. Registrera deras ursprungliga testvärden och returnera fisk till djuranläggningen.
OBS: Fisk skadades av trubbig tbi som tidigare beskrivits22. - Samla in 2–3 oskadad fisk eller TBI-fisk 4 timmar efter inledande provning och/eller 4 timmar efter skada (eller inom den experimentella tidsramen i fråga) från djuranläggningen. Förvara all fisk i det mörka rummet i enskilda tankar som innehåller systemvatten.
- Placera fisken i mitten av skyttelboxen (beredd med systemvatten enligt beskrivningen i 1.1), en fisk i taget och säkra locket. Fäst strömförsörjningen och låt fisken acklimatisera sig i 15 minuter.
- Efter acklimatisering, utvärdera omedelbart minne (strikt passera / misslyckas) genom att endast applicera ljusstimulansen i upp till 15 s och registrera svaren enligt följande.
- Tänk på att försöket lyckas om fisken korsar över lådans halvvägspunkt inom 15 s testperiod. Avsluta ljusstimulansen när du korsar halvvägspunkten.
- Betrakta försöket som misslyckat om fisken inte korsar över lådans halvvägspunkt inom 15 s för att starta ljusstimulansen. Avsluta ljusstimulansen efter 15 s period är över.
OBS: Under denna testning efter skada tillämpas inte negativa chockstimulanser efter ett misslyckat försök.
- Upprepa steg 2.3.4, med en viloperiod på 30 s mellan försöken, och registrera antalet lyckade försök (2.3.4.1) och misslyckade försök (2.3.4.2) i 25 försök.
- Beräkna procentskillnaden i lyckade försök efter skada till den första testperioden med hjälp av ekvationen:
- Inducera skada omedelbart efter den första testperioden genom föredraget skadeparadigm (t.ex. ett trubbigt våld med hjälp av den modifierade Marmarou-viktminskningen). Husfisk individuellt för en enkel identifiering. Registrera deras ursprungliga testvärden och returnera fisk till djuranläggningen.
- Fördröjd minne
- Returnera fisk, som inrymts individuellt för enkel identifiering och registrering av deras ursprungliga testvärden, till djuranläggningen omedelbart efter den första testperioden.
- Tillåt fisk 4 dagar (eller den experimentella tidsramen i fråga) mellan den inledande testningen och skadan och/eller fördröjd minnestestning.
- Inducera skada genom det föredragna skadeparadigmet (till exempel den modifierade Marmarou-viktminskningen för att inducera ett trubbigt våldstrauma). Husfisk individuellt för enkel identifiering av initiala testvärden och returnera fisk till djuranläggningen.
OBS: Fisk skadades av trubbig tbi som tidigare beskrivits22. - Samla in 2–3 oskadad fisk eller TBI-fisk 4 timmar efter inledande provning och/eller 4 timmar efter skada (eller inom den experimentella tidsramen i fråga) från djuranläggningen.
- Förvara all fisk i det mörka rummet i enskilda tankar som innehåller systemvatten och placera en i taget i mitten av skyttelboxen (beredd med systemvatten enligt beskrivningen i 1.1), fäst locket, fäst strömförsörjningen och låt fisken 15 min acklimatisera sig.
- Efter acklimatisering, utvärdera omedelbart minne (strikt passera / misslyckas) genom att endast applicera ljusstimulansen i upp till 15 s och registrera följande svar:
- Tänk på att leden lyckas om fisken korsar över lådans halvvägspunkt inom 15 s testperiod. Avsluta ljusstimulansen när du korsar halvvägspunkten.
- Betrakta spåret som misslyckat om fisken inte korsar över lådans halvvägspunkt inom 15 s efter att ha startat ljusstimulansen, avsluta ljusstimulansen.
OBS: Under denna testning efter skada tillämpas inte en negativ chockstimulans efter ett misslyckat försök.
- Upprepa steg 2.4.6, med en viloperiod på 30 s mellan försöken, och registrera antalet lyckade försök (2.4.6.1) och misslyckade försök (2.4.6.2) i 25 försök.
- Beräkna procentskillnaden i lyckade försök efter skada till den första testperioden med ekvationen:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inlärningsparadigmet, som beskrivs i protokollet och schemat (figur 1), ger en snabb bedömning av kognition med avseende på associativt lärande. Dessutom har detta paradigm en hög stringensnivå genom att definiera lärande som en upprepad och konsekvent visning av 5 på varandra följande positiva prövningar. Detta paradigm är också tillämpligt på en rad åldrar och skador. Oskadad fisk vid 8 månader (ung vuxen), 18 månader (medelålders vuxen) och 24 månader (äldre vuxen) krävde ett liknande antal prövningar för att lära sig beteendet att undvika rött ljus (Oskadad 8 m: 15,28 ± 4,92 prövningar, 18 m: 17,66 ± 5,5 försök, 24 m: 16,2 ± 4,79 försök, 8 m mot 18 m p=0,92, 8 m jämfört med 24 m p=0,98, 18 m jämfört med 24 m p=0,97, figur 2A). Vi använde också en allvarlig trubbigt våld traumatiska hjärnan skada (sTBI) modell22 och observerade att fisk i olika åldrar krävde liknande antal prövningar för att behärska analysen över 1-5 dagar efter skada (dpi; 8 m vs 18 m, p=0,09, 8 m vs 24 m, p=0,96, 18 m vs 24 m, p=0,12, figur 2A). Vid dag 1 efter sTBI krävde fisk i alla åldrar (8, 18 och 24 m) ett liknande antal försök för att lära sig beteendet (8 m: 73,3 ± 9,45 försök, 18 m: 79,33 ± 6,35 försök, 24 m: 68,25 ± 6,65 försök, 8 m mot 18 m p=0,71, 8 m mot 24 m p=0,76, 18 m mot 24 m p=0,28, Figur 2A) och de var alla betydligt större än de oskadade kontrollerna (p<0.01). Sammantaget visar dessa data att skyttelboxen kan användas för att undersöka skadeinducerade kognitiva underskott över åldersintervall och tyder på att vuxna zebrafiskar kan återhämta sig kognitivt efter trubbig kraftskada.
Eftersom upprepade miTBI-händelser i allt högre grad kan försämra kognitiv funktion, använde vi shuttle box-analysen som ett mått för att spåra dosberoende progression med repetitiv TBI. Vi använde denna analys för att bedöma lärande efter en miTBI trubbigtvåld skada 22 som upprepas dagligen under de olika tidsperioderna. Som tidigare observerats behärskade oskadad fisk snabbt skyttelboxen och uppnådde 5 på varandra följande positiva försök i 16,4 ± 3,5 försök(figur 2B). En dag efter en enda miTBI visar fisk en betydande ökning av antalet försök för att lära sig beteendet (40,25 ± 12,65 försök, p<0,05, figur 2B). Detta underskott ökade efter 2 miTBI händelser (48 ± 14,9 försök) och höjdes ytterligare efter 3 miTBI skador (56,63 ± 12,75 försök, figur 2B). Dessutom observerade vi en betydande ökning av kognitiv svikt mellan miTBI fisk som fick en singular skada och 3 skador (p<0,05).
Vi undersökte också hur minnet påverkades efter upprepade miTBI-händelser med protokollet för omedelbara och fördröjda minnesparadigmer (Figur 1A). Naiv oskadad fisk fick en utbildningsperiod och en inledande testperiod, varefter en del fisk skadades för omedelbart minne och andra återvände till fiskanläggningen i 4 dagar för att få tillgång till försenat minne (figur 2C). Oskadad fisk uppvisar en liten ökning av procentskillnaden av framgångsrika försök i både omedelbart minne (6,22% ± 4,7%) och fördröjd minne (6,13% ± 5,57%) i förhållande till den första testperioden. Vi undersökte sedan effekten av flera trubbiga TBI händelser hade på minnet. Betydande underskott observerades efter miTBI i omedelbart minne, men inte i fördröjd minne. Efter en enda miTBI uppvisade fisken betydande omedelbara minnesunderskott (-26,77 % ± 8,93 %) jämfört med oskadad fisk (p<0,0001, figur 2C). Denna trend fortsatte med upprepade skador med ökande underskott efter både 2x miTBI (-37,42% ± 10,01%) och 3x miTBI (-39,71% ± 11,39%). Dessutom observerade vi en liknande doseffekt mellan fisk som behandlats med en enda (1x) miTBI och 3x miTBI (p<0,05, figur 2C). Dessa data tyder på att lärande och minne reduceras i miTBI fisk med det ökande antalet skador, avsevärt öka underskottet och skyttelbox analys och protokoll beskrivs ovan är känsliga nog att upptäcka dessa skillnader.
Figur 1:Shuttle Box Assay. (A) Instruktionsöversikt över inlärnings- och minnesparadigm för kognitiv bedömning. (B)Schematisk av en ombyggd stor DNA-gellåda för skyttelboxens analys. C,D) Grafisk representation av stimuli ansökan under prövningar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Zebrafisk uppvisar kognitiva underskott efter trubbigt våld TBI. (A) Efter sTBI uppvisar zebrafisk vid 8, 18 och 24 månaders ålder inlärningsunderskott som inte skiljer sig avsevärt mellan åldersgrupper. Betydande ökningar av antalet försök att lära sig skyttelboxparadigmet jämfört med åldersmatchade kontroller observerades vid 1 dpi återvände till oskadade nivåer med 4-5 dpi. B,C) Upprepad miTBI fisk visade både lärande (B) och minne (C) underskott på ett dosberoende sätt. Medelvärdet ± SEM ritas i A och B, medan medelvärdet ± Standardavvikelse ritas i C. Varje datapunkt i alla tre diagrammen representerar en enda vuxen zebrafisk. Statistiska analyser utfördes med antingen en enkel- eller tvåvägs-ANOVA följt av ett Tukey post hoc-test. # p<0.05, ## p<0.01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kognitiv svikt kan avsevärt och negativt påverka livskvaliteten. På grund av ökad synlighet och förekomst av hjärnskakningar och traumatiska hjärnskador i hela befolkningen är det viktigt att förstå hur de orsakar kognitiv svikt och hur skadan kan minimeras eller vändas. Av dessa skäl spelar modellorganismer som kan testas för kognitiv nedgång en kritisk roll i dessa studier. Gnagare har länge varit den primära modellen för att undersöka neurobehavior och kognition, men zebrafisk har dykt upp som en användbar modell med många distinkta beteenden för att undersöka en rad utvecklingsmässiga, åldersrelaterade och förvärvade kognitiva underskott17,20,23,24,25,26. Olika metoder för att bedöma kognition har använts från endimensionellt lärande i form av tillvänjning, till komplext lärande och rumsligt minne, nytt objekt och platsigenkänning ochbeslutsfattande 18,19,20,21,27,28. Dessa kognitiva tester är dock begränsade till att testa icke-associativ kognition eller kräver en komplex uppsättning, finansiella investeringar i utrustning eller ett omfattande tidsåtagande innan tester kan utföras. Däremot använder skyttelboxen och de inlärnings- och minnesparadigmer som beskrivs här en komplex associativ inlärningsanalys som är kostnadseffektiv, en snabbt bedömd och lätt anställd av en nybörjare. Viktigast av allt, i överensstämmelse med de andra kognitiva testerna, visar vår analys att oskadad fisk snabbt lär sig den associativa uppgiften och kan minnas uppgiften dagar senare utan intermittent träning29.
Analysens anpassningsförmåga ger vägar att undersöka olika tidpunkter för lärande och minne som ett mått på sjukdomsprogression eller mekanistiska interventioner. Det finns två primära egenskaper i analysen. För det första är metoden enkel. Analysen sätts snabbt upp och har tydliga och distinkta slutpunkter när det gäller framgångsrika och misslyckade försök, vilket gör den tillgänglig för en rad utredare. Vi fann att på grund av enkelheten i denna analys behövs det mycket lite felsökning för att använda skyttelboxen framgångsrikt. För det andra är analysen extremt snabb i jämförelse med andra kognitiva undersökningar, vilket ger flexibilitet eller möjlighet att undersöka ett stort antal fiskar snabbt på en enda dag. Tiden för att bedöma lärandet är minst 19,75 min (figur 1), med fisken som kräver 15 minuter för att acklimatisera sig till skyttelboxen (bestäms av tankutforskning), följt av en enda misslyckad studie (15 s lätt stimulans, 15 s aversionstimulans, 30 s mellan försök) och 5 omedelbara och på varandra följande positiva försök (<15 s ljusstimulans). I praktiken observerade vi att oskadad fisk kräver 6-30 försök (19,75 min-43,75 min), medan i extrema fall (efter ett allvarligt trubbigt våld trauma), de allvarligaste underskotten kan kräva 100 prövningar (113,75 min). Minnesstudier utförs också snabbt. Enligt protokollets översikt är den minsta tid som krävs för acklimatisering, träning och inledande provning 67,5 min (15 min acklimatisering, 25 iterationer av ljus och stötar för 15 s, 30 s vila mellan försöken och upprepa för inledande testning utan de negativa stimuli). Medan omtestning av antingen omedelbart eller försenat minne kräver endast 33,75 min (15 min acklimatisering, 25 iterationer av endast ljusstimulans för 15 s och 30 s vila mellan prövningar), oavsett skada, behandling eller kognitivt underskott.
Vid bedömning av neurobehavior, olika paradigm använder antingen positiva eller negativa stimuli. Positiva stimuli i form av mat eller social interaktion, som ofta används i klassiska T-box labyrinter, kan bidra till ett starkt svar av en lärd uppgift. Analyser som använder positiv association gör det dock på bekostnad av tiden. Däremot, medan konditionering som svar på en negativ stimulans ger en snabb association och stark beteendemässig respons, är det på bekostnad av den negativa stimulansen. Oskadad fisk lär sig ofta snabbt skyttelboxtestet och utsätts därför för ett minimalt antal chocker, och verkar därför inte ha några negativa händelser. Neurologiskt komprometterad fisk (TBI), med allvarliga kognitiva underskott, kräver dock ett betydande antal prövningar och elektriska stötar. Dessa flera chocker har observerats för att ibland resultera i tonic-kloniska beslag. Alla fiskar som drabbas av ett tonisk-kloniskt anfall medan de befinner sig i skyttelboxen bör omedelbart avlägsnas och avlivas etiskt. Alla försök för avlivad fisk, fram till och med beslagshändelsen, bör uteslutas i alla statistiska analyser. Dessutom är det värt att notera att elektriska stötar för ett neurologiskt skadat ämne kan medföra oavsiktliga skillnader mellan skadad fisk som är och inte härrör från skyttelboxen. Av den anledningen föreslår vi att all fisk som utsätts för neurobehavior bedömning inte bör användas för någon annan kvantitativ metrisk (serum biomarkör, IHC, etc.). Det är också viktigt att förstå att denna inlärningsmetod bygger på en visuell stimulans och inte är lämplig för skador som kan äventyra visuella kretsar, eftersom det kommer att förvirra resultaten.
Våra resultat visar att zebrafisk efter trubbigt våld TBI uppvisar ett snabbt kognitivt underskott som resulterar i ökade försök att behärska en associativ uppgift i skyttelboxanalysen. Liknande omedelbara underskott ses i gnagare modeller av TBI, men dessa underskott kan minska, de kvarstår ofta och förblir betydande30. Zebrafisk visar däremot kognitiv återhämtning inom 7 dagar efter skada. Den vuxna zebrafiskens regenerativa kapacitet är väl dokumenterad9,10,11,12,13,14,15, med kända neurogena nischer i ventrikulära / subventricular zonerna i telencephalon31,32. Den kognitiva återhämtning som observeras i vår analys efter TBI ger insikt i nödvändiga undersökningar för att identifiera om dessa neurogena nischer stimuleras och spelar en roll i vävnad och kognitiv återhämtning.
Sammanfattningsvis ger skyttelboxen en snabb bedömning av kognition när det gäller associativt lärande och minne. Analysen använder minimal och klosterutrustning och är tekniskt enkel. Framtida tillämpningar skulle kunna användas för att bedöma genetiska och farmakologiska interventioner på neurologiskt förolämpad fisk när det gäller neuroprotection samt andra skadeparadigmer eller neurodegenerativa modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Hyde lab-medlemmarna för deras tankeväckande diskussioner och Freimann Life Sciences Center tekniker för zebrafiskvård och djurhållning. Detta arbete stöddes av Center for Zebrafish Research vid University of Notre Dame, Center for Stem Cells and Regenerative Medicine vid University of Notre Dame, och stipendier från National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH) och Pat Tillman-stipendiet (JTH). Figur 1 gjord med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flashlight | Ultrafire | 9145 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Large DNA Gel Box | Fisher Scientific | FB-SB-1316 | Shuttle Box |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB-105 |
References
- Deutsch, M., Mendez, M., Teng, E. Interactions between traumatic brain injury and frontotemporal degeneration. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 39, 143-153 (2015).
- Gardner, R., et al. Traumatic brain injury in later life increases risk for Parkinson disease. Annals in Neurology. 77, 987 (2015).
- Fleminger, S., Oliver, D., Lovestone, S., Rabe-Hesketh, S., Giora, A. Head injury as a risk factor for Alzheimer's disease: the evidence 10 years on; a partial replication. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 74, 857-886 (2003).
- Johnson, V., Stewart, W., Smith, D. Traumatic brain injury and amyloid-β pathology: a link to Alzheimer's disease. Nature Reviews Neurosciences. 11, 361-370 (2010).
- Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31, 379-387 (2016).
- Corrigan, J. D., Selassie, A. W., Orman, J. A. L.
- Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14, 506-517 (2015).
- GBD 2016 Traumatic Brain Injury and Spinal Cord Injury Collaborators. Global, regional, and national burden of traumatic brain injury and spinal cord injury, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet, Neurology. 18 (1), 56-87 (2019).
- Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
- Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342, 26-38 (2010).
- Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Reviews of Vision Sciences. 6, 171-193 (2020).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), Cambridge, England. 4831-4841 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Bhattarai, P., et al. Neuron-glia interaction through Serotonin-BDNF-NGFR axis enables regenerative neurogenesis in Alzheimer's model of adult zebrafish brain. PLoS Biology. 18 (1), 3000585 (2020).
- Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Chanin, S., et al. Assessing startle responses and their habituation in adult zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Humana Press. (2012).
- López-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 54, 134-139 (2019).
- Maheras, A. L., et al. Genetic pathways of neuroregeneration in a novel mild traumatic brain injury model in adult zebrafish. eNeuro. 5 (1), (2018).
- Gaspary, K. V., Reolon, G. K., Gusso, D., Bonan, C. D. Novel object recognition and object location tasks in zebrafish: Influence of habituation and NMDA receptor antagonism. Neurobiology of Learning and Memory. 155, 249-260 (2018).
- Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A scalable model to study the effects of blunt-force injury in adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Wu, Y. J., et al. Fragile X mental retardation-1 knockout zebrafish shows precocious development in social behavior. Zebrafish. 14 (5), 438-443 (2017).
- Rea, V., Van Raay, T. J. Using zebrafish to model autism spectrum disorder: A Comparison of ASD risk genes between zebrafish and their mammalian counterparts. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 575575 (2020).
- Zhdanova, I. V., et al. Aging of the circadian system in zebrafish and the effects of melatonin on sleep and cognitive performance. Brain Research Bulletin. 75 (2-4), 433-441 (2008).
- Yu, L., Tucci, V., Kishi, S., Zhdanova, I. V.
- Bahl, A., Engert, F. Neural circuits for evidence accumulation and decision making in larval zebrafish. Nature Neuroscience. 23 (1), 94-102 (2020).
- Ngoc Hieu, B. T., et al. Development of a modified three-day t-maze protocol for evaluating learning and memory capacity of adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1464 (2020).
- Williams, F. E., White, D., Messer, W. S. A simple spatial alternation task for assessing memory function in zebrafish. Behavioural Processes. 58 (3), 125-132 (2002).
- Zohar, O., et al. Closed-head minimal traumatic brain injury produces long-term cognitive deficits in mice. Neuroscience. 118 (4), 949-955 (2003).
- Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration, and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
