Ein In-vivo-Mausmodell der intravenösen Vollnarkose während der Krebsresektion

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Modellierung der intravenösen Totalanästhesie (TIVA) während der Krebsresektion bei Mäusen. Ziel ist es, Schlüsselmerkmale der Anästhesieabgabe an Krebspatienten zu replizieren. Die Methode ermöglicht es zu untersuchen, wie sich die Anästhesietechnik auf das Wiederauftreten von Krebs nach einer Resektionsoperation auswirkt.

Zusammenfassung

Anästhesie ist ein routinemäßiger Bestandteil der Krebsbehandlung, der für diagnostische und therapeutische Verfahren verwendet wird. Die Anästhesietechnik wurde kürzlich mit der Beeinflussung langfristiger Krebsergebnisse in Verbindung gebracht, möglicherweise durch Modulation von adrenerg-entzündlichen Reaktionen, die das Verhalten von Krebszellen und die Funktion von Immunzellen beeinflussen. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Propofol-basierte intravenöse Vollanästhesie (TIVA) im Vergleich zu inhalativer flüchtiger Anästhesie für langfristige Krebsergebnisse von Vorteil sein kann. Die verfügbaren klinischen Befunde sind jedoch widersprüchlich. Präklinische Studien, die die zugrunde liegenden Mechanismen identifizieren, sind von entscheidender Bedeutung, um das Design klinischer Studien zu leiten, die die Erkenntnisse beschleunigen. Die meisten präklinischen Modelle der Anästhesie wurden aus der Verwendung von Anästhesie in der In-vivo-Forschung extrapoliert und sind nicht optimal darauf ausgelegt, die Auswirkungen der Anästhesie selbst als primären Endpunkt zu untersuchen. Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Verabreichung von Propofol-TIVA-Anästhesie in einem Mausmodell der Brustkrebsresektion, das wichtige Aspekte der klinischen Verabreichung bei Krebspatientinnen repliziert. Das Modell kann verwendet werden, um Wirkungsmechanismen der Anästhesie auf Krebsergebnisse bei verschiedenen Krebsarten zu untersuchen und kann auf andere Nicht-Krebsbereiche der präklinischen Anästhesieforschung extrapoliert werden.

Einleitung

Mehr als 60% der Krebspatienten erhalten eine Anästhesie für die chirurgische Resektion¹. Derzeit gibt es keine spezifischen klinischen Richtlinien, die die Wahl der Anästhesie bei Krebspatienten bestimmen. Umfragen unter Anästhesisten zeigen eine Präferenz für flüchtige Anästhesie, auch während Krebsoperationen ^2,3. Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass die Anwendung einer Propofol-basierten intravenösen Vollanästhesie (TIVA) während einer Krebsoperation im Vergleich zur flüchtigen Anästhesie mit verbesserten postoperativen Ergebnissen (progressionsfreies Überleben, Gesamtüberleben) einhergehen kann⁴. Nachfolgende klinische Studien berichten weiterhin widersprüchliche Ergebnisse 5,6,7,8. Diese Ergebnisse unterstützen die Notwendigkeit präklinischer Studien, um die mechanistischen Auswirkungen verschiedener Anästhetika auf krebsbedingte Ergebnisse besser zu verstehen.

In In-vivo-Studien , die Krebsoperationen modellieren, ist die Anästhesie jedoch häufig ein zufälliger Teil des Verfahrens. Die Begründung für die Wahl der Anästhesie steht oft nicht im Mittelpunkt des experimentellen Designs, und ihre Auswirkungen auf krebsbedingte Endpunkte werden möglicherweise nicht bewertet. Zum Beispiel verwenden In-vivo-Studien , die eine Aufrechterhaltung der Anästhesie für Krebsoperationen erfordern, am häufigsten inhalative flüchtige Anästhesie⁹. Wenn Propofol in In-vivo-Studien verwendet wurde, wurde es durch einmalige Bolusdosierung mit intraperitonealer Verabreichung verabreicht, die klinische Onko-Anästhesie-Protokolle nicht repliziert¹⁰. Dieser Ansatz der Propofol-Verabreichung induziert eine leichte Anästhesie, die für schnelle Verfahren geeignet ist. Es erlaubt jedoch keine Aufrechterhaltung der Anästhesie, die für eine Krebsresektionsoperation erforderlich ist, die langwierig sein kann. Darüber hinaus unterscheidet sich die Absorptionskinetik der intraperitonealen Verabreichung von klinischen Verabreichungsmethoden.

Ein Modell von Propofol-basiertem TIVA für die Krebsresektionschirurgie wurde entwickelt, um diesem Bedarf gerecht zu werden. Ein Protokoll für die anhaltende Aufrechterhaltung der Anästhesie mit Titration des Anästhetikums, um eine Reaktion auf den chirurgischen Reiz zu ermöglichen, wurde entwickelt, um Schlüsselaspekte der Anästhesieabgabe bei Patienten mit Krebsoperationen zu replizieren. Das resultierende Protokoll wird mit einem Mausmodell von Krebs verwendet, um TIVA während der Krebsresektion zu liefern. Die Auswirkungen auf kurz- und langfristige krebsbedingte Ergebnisse werden bewertet.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee an der Monash University durchgeführt. In dieser Studie wurden weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen verwendet.

1. Krebszellen vorbereiten

1. Tumorzellen im Medium kultivieren. Kultur 66cl4 muriner Brustkrebszellen in alpha-MEM, die 10% FBS und 200 mM Glutamin enthalten. Zellen sollten negativ für Mykoplasmen texten. OPTIONAL: Verwenden Sie Zellen, die stabil transduziert werden, um Glühwürmchen-Luciferase für die Biolumineszenz-Bildgebung zu exprimieren, um die Überwachung des Wiederauftretens von Krebs nach der Resektionsoperation^{zu ermöglichen 11} (siehe Schritt 4).
   HINWEIS: Die Zelllinie und das oben erwähnte Medium wurden in dieser Studie verwendet.
2. Zellen bei 37 °C mit 5% CO₂ züchten. Passage Zellen aseptisch in einer Haube bei <80% Konfluenz. Verwenden Sie Zellen mit geringer Passage in der logarithmischen Wachstumsphase, um optimale In-vivo-Ergebnisse zu erzielen.
3. Heben Sie die adhärenten Zellen mit 0,5 mg / ml Trypsin in PBS mit 10 mM EDTA an; 2 mL für einen T75-Kolben. Wenn es angehoben wird, fügen Sie Medium hinzu, um Trypsin zu inaktivieren, und waschen Sie die Zellen in PBS.
4. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Verdünnen Sie die Zellen in PBS für die Injektion. Für 66cl4 Brustkrebszellen injizieren Sie 1 x 10⁵ Zellen in 20 μL PBS pro Maus.
5. Legen Sie die Zellen vor der Injektion auf Eis.

2. Erstellen Sie ein Mausmodell für Brustkrebs

1. Verwenden Sie 4% Isofluran, um die Maus in einer Induktionskammer zu betäuben. Dann halten Sie die Anästhesie mit 2% -3% Isofluran mit einem Nasenkegel aufrecht. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie durch mangelnde Reaktion auf das Zehenklemmen.
2. Bereiten Sie die Injektionsstelle vor, indem Sie den vierten linken Brustfettpolsterbereich mit einem Einweg-Alkoholtupfer abwischen.
3. Tumorzellen (siehe Schritt 1.4) in eine 25-μL-Hamilton-Spritze aufziehen, die an einer sterilen 27-G-Injektionsnadel befestigt ist.
4. Injizieren Sie die Zellen in das vierte linke Brustfettpolster. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut zu sichern und anzuheben. Injizieren Sie ca. 1 mm aus der Brustwarze.
5. OPTIONAL: Wenn Zellen mit Luciferase markiert sind, bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion von Tumorzellen durch Biolumineszenz-Bildgebung. Injizieren Sie 100 μL 150 mg/kg D-Luciferin in die laterale Schwanzvene der anästhesierten Mäuse mit einer 0,5 ml Insulinspritze mit einer 30 G Injektionsnadel.
6. OPTIONAL: Legen Sie die Maus mit dem Brustfettpolster nach oben in ein Biolumineszenz-Bildgebungssystem. Warten Sie 2 Minuten nach der Luciferin-Injektion für eine optimale Gewebeaufnahme von Luciferin, dann Bild für 10 s.
7. Legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig und lassen Sie sie sich von der Narkose erholen.
8. Überwachen Sie weiterhin den Tierschutz gemäß den institutionellen Tierethikrichtlinien.

3. Induktion einer stabilen Anästhesie mit intravenöser Verabreichung von Propofol

1. Überwachen Sie das Wachstum des Primärtumors mit Hilfe der Messschiebermessung und berechnen Sie das Tumorvolumen mit der Gleichung: Volumen (mm³) = (Länge x (Breite)2 ÷ ² ).
2. Führen Sie eine Tumorresektion an Mäusen durch, wenn der Primärtumor das erforderliche Volumen erreicht hat (hier 80-90 mm³).
3. Richten Sie eine automatisierte Spritzenpumpe mit einer 30 G 1 ml Insulinspritze ein, die Propofol-Formulierung (2% Lipuro-Propofol) enthält (Abbildung 1A).
4. Induktion der Anästhesie der Maus in einer Induktionskammer mit 3% Sevofluran oder Isofluran.
   HINWEIS: Hier wurde Sevofluran verwendet, da dies das vorherrschende flüchtige Gewebe ist, das klinisch verwendet wird.
5. Setzen Sie die Maus für die Dauer der Operation auf ein 37 °C heißes Heizkissen um. Halten Sie die Anästhesie mit 2% -3% Sevofluran mit einem Nasenkegel kurz aufrecht.
6. Tragen Sie wässriges Gleitmittel auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
7. Injizieren Sie 0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan zur Analgesie.
8. Um sich auf die Operation vorzubereiten, rasieren Sie den Bauch und bereiten Sie die Haut mit einer Jod-Povidon-Lösung für die Operation vor. Wischen Sie die Haut mit einem Alkohol oder einem sterilen Tuch ab.
9. Um TIVA auf Propofol-Basis zu verabreichen, kanülieren Sie die laterale Schwanzvene mit einer sterilen 30 G Injektionsnadel, die an einem sterilen Polyurethankatheter befestigt ist. Bestätigen Sie die korrekte Platzierung durch Blutrückblende in den Katheter (Abbildung 1B). Passen Sie die Abgabe von Sevofluran während der intravenösen Kanülierung nach Bedarf an, um eine stabile Anästhesietiefe aufrechtzuerhalten, die durch den Verlust des Hornhaut- und Pedalreflexes und die Atemfrequenz < 100 Atemzüge pro Minute nachgewiesen wird.
10. Beginnen Sie mit Propofol-TIVA durch Verabreichung von 2% Propofol als initialen Bolus von 27 mg/kg für mehr als 1 Minute. Beenden Sie die Verabreichung von Sevofluran.
11. Setzen Sie die Infusion von Propofol mit einer Erhaltungsrate von 2,2-4,0 mg/kg/min fort, um eine stabile Anästhesietiefe für die Dauer der Operation aufrechtzuerhalten (Abbildung 1C).

4. Resektieren Sie den Primärtumor

1. Machen Sie einen geraden 1 cm langen Einschnitt unterhalb des Tumors im Bereich des linken vierten Brustfettpolsters. Sorgfältig den Tumor und den linken Leistenlymphknoten durch Dissektion mit stumpfer Pinzette resezieren.
2. OPTIONAL: Wenn Sie Luciferase-markierte Tumorzellen verwenden, verwenden Sie Biolumineszenz-Bildgebung, um klare chirurgische Ränder zu bestätigen. Injizieren Sie 150 mg/kg D-Luciferin in die laterale Schwanzvene, warten Sie 2 min und nehmen Sie dann 60 s mit einem Biolumineszenz-Bildgebungssystem ab. Wenn ein Resttumor identifiziert wird, resezieren Sie zusätzliches Gewebe aus dem Brustfettpolster und machen Sie ein neues Bild, um klare Ränder zu erzielen.
3. Stellen Sie die Blutstillung an der Operationsstelle sicher und schließen Sie die Haut mit 5-0-Nylonnähten. Stellen Sie sicher, dass das Fell nicht in die Operationsstelle gelangt.
4. Nach Abschluss der Resektionsoperation die Anästhesie beenden. Legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig auf einem 37 °C heißen Heizkissen und lassen Sie sie sich von der Narkose erholen.
5. Überwachen Sie alle 15 Minuten nach der Anästhesie, bis die Maus wieder normal wach ist. Überwachen Sie die Maus dann alle 12 Stunden für 48 Stunden nach der Operation.
6. 0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan alle 12 h für 48 h nach der Operation verabreichen.
7. Nach 7-10 Tagen entfernen Sie die Nähte mit sterilen gebogenen Stichschneidern unter kurzer Sevofluran- oder Isofluran-Anästhesie.

5. Verfolgen Sie das Wiederauftreten von Krebs mit In-vivo-Bildgebung

1. Verwenden Sie Biolumineszenz-Bildgebung, um das Wiederauftreten von Krebs nach einer Resektionsoperation nicht-invasiv zu verfolgen. Verwenden Sie ein Biolumineszenz-Bildgebungssystem, um die Mäuse einmal pro Woche auf Hinweise auf ein Wiederauftreten des Primärtumors oder ein Fernrezidiv zu überwachen, beginnend in der Woche nach der Operation.
2. Induktion der Anästhesie der Maus in einer Induktionskammer mit 4% Isofluran. Dann übertragen Sie die Maus für die Dauer der Anästhesie auf ein 37 ° C Heizkissen und halten Sie die Anästhesie mit 2% -4% Isofluran mit einem Nasenkegel aufrecht.
3. Tragen Sie wässriges Gleitmittel auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
4. Injizieren Sie D-Luciferin 150 mg/kg in die laterale Schwanzvene. Warten Sie 2 Minuten und messen Sie dann die Biolumineszenz über eine Exposition von 60 s, um ein Wiederauftreten des Primärtumors oder eine Fernmetastasierung zu erkennen.
5. Wenn der Primärtumor erneut auftritt und tastbar wird, beginnen Sie mit der Überwachung des Tumorwachstums mit Messschiebermessungen.
6. Am Ende des Experiments töten Sie die Mäuse gemäß dem genehmigten Protokoll human. Hier wurde CO₂ verwendet, gefolgt von zervikaler Dislokation.

Ergebnisse

Diese Methode beschreibt ein Modell der totalen intravenösen Anästhesie (TIVA) mit Propofol während der Krebsresektionsoperation bei Mäusen. Propofol wird in diesem Mausmodell über einen intravenösen Katheter unter Verwendung einer Spritzenpumpe (Abbildung 1A,B) verabreicht, um die Verabreichung von TIVA im klinischen Umfeld der Anästhesie für Krebsoperationen zu replizieren. Die Verwendung der Spritzenpumpe minimiert die Exposition gegenüber flüchtiger Anästhesie, indem sie...

Diskussion

Diese Studie berichtet über ein Protokoll zur Verabreichung einer intravenösen Vollanästhesie (TIVA) mit Propofol in einem Mausmodell für Brustkrebs, das wichtige Aspekte der klinischen Praxis für TIVA bei Patientinnen repliziert, die eine Krebsoperation benötigen. Das Protokoll ermöglicht die Untersuchung sowohl kurzfristiger als auch langfristiger klinisch relevanter Ergebnisse nach Krebsoperationen in einem Mausmodell der Krebsprogression, einschließlich der Messung der Zytokinspiegel und des Wiederauftretens von Kreb...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,9 % Kochsalzlösung	Fresnius Kabi	AUST R 197198
Arterienzange		Proscitech TS1322-140
Buprenorphin	Temgesic	TEMG I
Beheizte Operationsmatte	Custom-Injektionsnadel
(30 G, 1 mL Insulinspritze)	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer
Luciferin	Promega	P1041/2/3
Polyurethan-Katheter	Intramedic	427401
Povidon Jod	Betadine	AUST R 29562
Propofol Lipuro, 2%	Braun	3521490
Sevofluran	Baxter	ANZ2L9117
Sevofluran Verdampfer	Vetquip	VQ1334
Sterile Gaze	Multigate Medizinische Produkte	11-600A
Chirurgische Schere	Proscitech	TS1044
Nähte, 5-0 Nylon	Dynek	V504
Spritzenpumpe	Harvard Apparatur	70-4500
Spritzen (1 mL)	Terumo	SS+01T

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