Ein effektives Mausmodell der einseitigen renalen Ischämie-Reperfusionsverletzung

Die Nieren gehören zu den am höchsten durchbluteten Organen im Körper und sind extrem anfällig für Veränderungen der Blutdurchblutung¹. Nierenischämie-Reperfusions-Verletzung (IRI) bleibt die Hauptursache für akutes Nierenversagen ^2,3 und ist mit hoher Morbidität und hoher Mortalität bei hospitalisierten Patienten^{verbunden 4}. Da nur begrenzte therapeutische Optionen zur Verfügung ^stehen,4,5 Die renale IRI steht derzeit im Mittelpunkt mehrerer Forschungsanstrengungen in der Biomedizin^6,7, die auf die Entwicklung neuartiger therapeutischer Ziele und die Charakterisierung früher und sensitiver Marker für Nierenschädigungen abzielen ^8,9,10 . Die Identifizierung eines zuverlässigen, zeit- und kosteneffizienten Tiermodells wird als wesentlich angesehen, um diese Anforderungen zu erfüllen. Dieses Papier stellt ein einfaches und effektives Mausmodell der einseitigen renalen IRI vor. Ischämie wird durch Klemmen des rechten Nierenpedikels für 30 min^11,12 induziert. Ein entscheidender Teil dieses Modells ist die Auswahl der am besten geeigneten Reperfusionszeit, die die pathologischen Ereignisse von Interesse wie tubuläre Nekrose, polymorphe infiltration von Entzündungszellen oder Fibrose reproduziert. Daher erhalten die Forscher diesen sequentiellen Überblick über repräsentative pathologische Veränderungen, die in der IRI-Niere erwartet werden.

Das folgende Protokoll beschreibt eine Überlebensoperation. Daher wird die höchste aseptische und chirurgische Praxis angewendet. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Um geschlechts- und stammbasierte Unterschiede in den IRI-Effekten zu eliminieren, wurden in der Studie nur männliche C57BL6-Mäuse verwendet. Alle Tiere wurden in Alter und Gewicht angepasst, um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen.

1. Vorbereitung

HINWEIS: Eine Zeitleiste der verschiedenen experimentellen Phasen und Interventionen ist in Abbildung 1A dargestellt.

1. Reinigen und desinfizieren Sie den OP-Tisch vor jedem Eingriff. Bereiten Sie alle erforderlichen Materialien vor und legen Sie sie (sterilisierte Instrumente und Wattestäbchen, sterile Gaze und Vorhänge, vorverdünnte Anästhetika, Heizkissen, sterilisierte Gefäßklemme, sterile Kochsalzlösung sowie Hautantiseptika und -nähte) auf den Operationstisch (siehe Materialtabelle).
2. Anästhesien männlicher C57BL6-Mäuse (Altersgruppe 11-13 Wochen) durch intraperitoneale Injektion von Ketamin / Xylazin (100 mg / kg bzw. 20 mg / kg Körpergewicht, zuvor in steriler Kochsalzlösung verdünnt).
   HINWEIS: Ein geschickter Umgang mit Tieren ist unerlässlich, um den Stress für das Tier zu minimieren, da Stressreaktionen die Wirkung von Anästhetika negativ beeinflussen können.
3. Rasieren Sie nach der Verabreichung von Ketamin / Xylazin den Operationsbereich an der rechten Flanke mit einer Rasierklinge und Seife.
   HINWEIS: Die Rasur der Haut verbessert die Wundheilung sowie die allgemeinen Ergebnisse von Überlebensoperationen.
4. Desinfizieren Sie die Haut im Operationsbereich zuerst mit 70% Alkohol und dann mit Povidon-Jodlösung mit einem Wattestäbchen.
5. Legen Sie die Maus nach der Hautvorbereitung auf einen Heiztisch in einer ventralen Dekubitusposition und stabilisieren Sie die Körpertemperatur bei 37 °C (überwacht durch Rektal- und Padsensorsonden).
   HINWEIS: Nieren sind leichter zugänglich und chirurgisch exponiert, wenn sie in ventralem Dekubitus und nicht lateral platziert werden.
6. Während die Körpertemperatur stabilisiert ist, tragen Sie Augensalbe auf die Augen der Maus auf.
   HINWEIS: Dissoziative Anästhetika wie Ketamin bewirken, dass die Augen des Tieres während der Narkose offen bleiben.

2. Chirurgie

1. Sobald die Schmerzreflexe fehlen (Zehenkneifen mit einer Pinzette), führen Sie einen ca. 1 cm langen dorso-lateralen chirurgischen Schnitt an der rechten Flanke mit einer Skalpellklinge durch. Beginnen Sie den Schnitt hinter der letzten Rippe und fahren Sie ca. 1 cm parallel zur Lendenmittellinie kaudal fort.
2. Transektieren Sie die Bauchmuskulatur mit einer Schere, um den retroperitonealen Raum zu visualisieren. Entfernen Sie die kleinen Mengen Blut, die während des Schneidens der Muskeln mit sterilen Wattestäbchen produziert werden.
   HINWEIS: Da der dorsolaterale Ansatz verwendet wird, wird mit diesem Verfahren auf das Retroperitoneum und nicht auf die Peritonealhöhle zugegriffen.
3. Drücken Sie die rechte Niere aus der Bauchhöhle heraus. Verwenden Sie die Graefe-Pinzette, um die Niere vorsichtig freizulegen.
   HINWEIS: Halten Sie die Pinzette immer geschlossen, um eine traumatische Verletzung der Niere zu vermeiden, wenn sie auf den Bauch gelegt wird, und verwenden Sie sie nur, um die Niere vorsichtig in Richtung des chirurgischen Einschnitts und aus ihr heraus zu drücken und zu führen.
4. Legen Sie langsam die rechte Niere frei und identifizieren Sie den Nierenpedikel. Entfernen Sie vorsichtig das Fettgewebe um den Stiel herum.
5. Um eine Ischämie zu induzieren, legen Sie die Gefäßklemme über die Nierenarterie und die Vene, die im Nierenstiel vorhanden sind, und vermeiden Sie es, den benachbarten Harnleiter zu klemmen. Verwenden Sie einen Halsted-Mosquito-Hämostat zur Manipulation der Gefäßklemme.
   HINWEIS: Ischämie wird durch die Visualisierung einer Farbänderung der Niere von rot-rosa zu dunkelviolett bestätigt (Abbildung 1B).
6. Bedecken Sie die eingeklemmte Niere mit steriler Gaze, die in Kochsalzlösung getränkt ist, um Austrocknung zu vermeiden, und lassen Sie sie 30 Minuten einwirken.
7. Überwachen Sie während dieser Zeit regelmäßig die Anästhesietiefe und -feuchtigkeit der Gaze.
   HINWEIS: Die Induktionsdosis der Anästhesie ist ausreichend, um Analgesie bis zum Ende des ischämischen Ereignisses bereitzustellen; Daher sind keine zusätzlichen anästhetischen Injektionen erforderlich.
8. Kurz vor dem Ende der Ischämieperiode entfernen Sie die Gaze und decken die Niere auf. Halten Sie den Hämostat Halsted-Mosquito für die Klemmenentfernung bereit.
9. Öffnen Sie in Minute 30 die Gefäßklemme mit dem Hämostat und entfernen Sie sie aus dem Nierenstamm, um eine Reperfusion der Niere zu ermöglichen.
   HINWEIS: Die Reperfusion wird durch die Visualisierung einer Veränderung der Nierenfarbe von dunkelviolett zu rot-rosa bestätigt (Abbildung 1C).
10. Führen Sie die gleichen Verfahren durch, die oben für Scheintiere ohne Klemmen des Nierenpedikels beschrieben wurden.
11. Nach Überprüfung der Nierenfarbveränderung bringen Sie die Niere in die Bauchhöhle zurück. Schließen Sie die Bauchmuskulatur mit resorbierbarer Naht 5-0 unter Verwendung eines Kreuzmusters.
    HINWEIS: Eine zweite Injektion von Anästhetika kann erforderlich sein, um die Analgesie während der Naht der Muskeln und der Haut aufrechtzuerhalten. Die Hälfte der Anfangsdosis hat sich bei der Bereitstellung von Analgesie bis zum Abschluss der Operation als wirksam erwiesen.
12. Schließen Sie die Haut mit einer resorbierbaren Naht 5-0 mit einem horizontalen Matratzenmuster. Reinigen Sie die Wunde mit einer Povidon-Jodlösung mit einem Wattestäbchen.

3. Genesung und nach der Operation

HINWEIS: Da die postoperative Zeit die tatsächliche Reperfusionszeit ist, ist eine ordnungsgemäße postoperative Versorgung ethisch obligatorisch und wissenschaftlich relevant. Die Reperfusionszeiten können nach Bedarf des Forschers ausgewählt werden. Reperfusionszeiten von 4 h, 8 h, 16 h, 1 Tag, 2 Tage, 4 Tage und 7 Tage werden verglichen, um einen sequentiellen Überblick über pathologische Veränderungen zu erhalten, die durch renale IRI induziert werden.

1. Halten Sie die Maus auf dem Heizkissen, bis sie sich von der Narkose erholt.
   HINWEIS: Es wird empfohlen zu warten, bis die Maus beginnt, ihre Beine zu bewegen und versucht, sich zu bewegen. In Fällen, in denen während der Operation zusätzliche Anästhesieinjektionen erforderlich sind, ist die Erholungszeit länger. Atipamezol, ein Alpha-2-Rezeptor-Antagonist, kann in einer Dosis von 0,5 mg/kg Körpergewicht intraperitoneal verabreicht werden, um die Xylazin-Effekte umzukehren und die Erholungsphase zu verkürzen. Zur Schmerzbehandlung wird Buprenorphin (0,1 mg/kg Körpergewicht, intraperitoneal) während der Genesungs- und postoperativen Phase präoperativ und alle 6 Stunden verabreicht. Von der Verwendung von nichtsteroidalen entzündungshemmenden Medikamenten wird abgeraten, da mehrere Medikamente in dieser Familie Nephrotoxizität induzieren und daher die Ergebnisse verändern können.
2. Nach der Genesung von der Narkose legen Sie die Maus zurück in ihren Käfig mit freiem Zugang zu Wasser und Nahrung.
   HINWEIS: Wurstwaren können in einer Petrischale sowie Material zum Verstecken und Spielen (z. B. Papierblätter, Papierhandtuchtuben) bereitgestellt werden.
3. Überwachen Sie die Maus täglich, um die Wundheilung, die Nahrungs- und Wasseraufnahme, das Körpergewicht und das Verhalten zu beurteilen.
   HINWEIS: Der Wundheilungsstatus wurde anhand der folgenden Skala beurteilt: 1, trocken; 2, nass; 3, teilweise geöffnet; 4, geöffnet. Eine schnelle Wundheilung wurde in dieser Studie dokumentiert, wobei mehr als 90% der trockenen Wunden nach Tag 2 auftraten.

4. Euthanasie und Probenentnahme

1. Euthanasie die Mäuse mit Natriumpentobarbital, das intraperitoneal in einer Dosis verabreicht wird, die doppelt so hoch ist wie die Anästhesiedosis für Mäuse (100 mg/kg).
2. Sammeln Sie bei Bedarf Flüssigkeits- und Gewebeproben.
   HINWEIS: Beide Nieren, Vollblut (für die Blutzellzahl), Serum (für Blutbiochemie), Urin, das Herz und die Lunge wurden gesammelt. Für die Analyse der Blutbiochemie werden einige Mikroliter Serum benötigt (Blutharnstoffstickstoff (BUN), Kreatinin, Elektrolyte). Bei Bedarf können Mäuse 24 Stunden vor der Euthanasie in Stoffwechselkäfige gelegt werden, um ein höheres Urinvolumen zu sammeln, das die Bestimmung von Nierenfunktionsparametern ermöglicht.

Physiologische Parameter
Mäuse erholten sich von dieser einseitigen renalen IRI-Operation ereignislos; erschien aktiv und aufmerksam; und zeigte normales Essen, Trinken und Verhalten am nächsten Tag. Einige Mäuse können nach der IRI einen Körpergewichtsverlust haben, obwohl er normalerweise weniger als 10% des anfänglichen Körpergewichts beträgt (Abbildung 2). Größere Körpergewichtsverluste (˃10%) können schädlich sein, und diese Tiere sollten aus der Studie entfernt werden. Scheinoperierte Mäuse zeigten keine Veränderungen des Körpergewichts nach der Operation (gemessen 24 Stunden nach der Operation). Die meisten Mäuse erholten sich zwischen den Tagen 4 und 7 nach der Operation von ihrem anfänglichen Körpergewicht (siehe IRI-7-Tage-Gruppe, Abbildung 2). Die Nierenfunktion kann mit traditionellen Markern wie Blutharnstoffstickstoff (BUN) und Kreatinin beurteilt werden. Zusätzlich wurden Elektrolytspiegel im Serum (Natrium, Kalium und Chlorid) und ein automatisiertes Differentialblutbild in die Analyse einbezogen.

Histopathologische Veränderungen
Die Beurteilung der histopathologischen Befunde erfolgte unter Verwendung von 4% paraformaldehydfixierten, paraffineingebetteten ganzen mittelsagittalen Abschnitten der Niere, die mit Hämatoxylin / Eosin (HE), Periodensäure Schiff und Massons trichromen Flecken angefärbt waren. Die offensichtlichsten Veränderungen, die durch dieses einseitige renale IRI-Modell hervorgerufen werden, sind an der kortiko-medullären Verbindung zu sehen, insbesondere in den proximalen Tubulus, dicken aufsteigenden Gliedmaßen der Henle-Schleife und distalen gewundenen Tubuli sowie im tubulären Interstitium (siehe Legende für Abbildung 3). Mikroskopische Aufnahmen, die die charakteristischsten Läsionen nach IRI in der Niere zeigen, sind in Abbildung 3 zu sehen. Eine Liste der sequentiellen histopathologischen Befunde ist in Tabelle 1 enthalten.

Ein röhrenförmiges Verletzungs-Scoring-System wurde entwickelt, um den Schaden im Laufe der Zeit zu kategorisieren (Abbildung 4). Dabei wurden fünf definierte Veränderungen von drei verschiedenen Evaluatoren bewertet: 1) tubuläre epitheliale Dämpfung; 2) Bürstenrandverlust; 3) tubuläre Nekrose; 4) luminale Obstruktion; und 5) Vorhandensein von proteinhaltigem Guss. Eine Zuweisung von "1" zeigt an, dass die Änderung vorhanden ist, "0", dass sie nicht vorhanden ist.

Abbildung 1: Experimentelles renales IRI-Modell in der Maus . (A) Phasen von Experimenten und Interventionen (Anästhesieinduktion, Ischämie und Reperfusion) werden gezeigt. Bitte beachten Sie die Veränderungen in der Farbe der rechten Niere zu dunkelrot während der Ischämie (B) zu rosa während der Reperfusion (C). (D) Makroskopisches Erscheinungsbild der rechten IRI-Niere (roter Pfeil) im Vergleich zur kontralateralen Nicht-IRI-Niere desselben Tieres 24 h nach der Operation. Der rote Pfeil in (B) zeigt die Position der hämostatischen Klemme. Abkürzung: IRI = Ischämie-Reperfusionsverletzung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Körpergewicht der Mäuse vor und nach der renalen IRI. Einzelne Daten werden angezeigt. Abkürzungen: IRI = Ischämie-Reperfusionsverletzung; h = Stunden; d = Tage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Typische mikroskopische Läsionen, die im Kortex und im kortiko-medullären Übergang von IR-betriebenen Mäusen beobachtet wurden. Schein- und unterschiedliche Reperfusionszeiten werden angezeigt (über jedem Bild angegeben). (A) Inakte Strukturen werden in Scheinform dargestellt (Vergrößerung 40x; Maßstabsstab = 20 μm). Pfeile in IRI 4 h zeigen das Vorhandensein von proteinhaltigem Guss im röhrenförmigen Lumen an (Vergrößerung 40x; Skalenbalken = 20 μm). Pfeile in IRI 8 h zeigen eine röhrenförmige Dilatation (Vergrößerung 40x; Skalenbalken = 50 μm). Schwarzer Pfeil in IRI 16 h zeigt Rohrguss in Marksegmenten; Weiße Pfeile zeigen Bereiche der zellulären Nekrose (Vergrößerung 40x; Skalenbalken = 50 μm). Schwarze Pfeile in IRI 1 d zeigen die röhrenförmige Dilatation an (Vergrößerung 10x; Skalenbalken = 100 μm). Schwarzer Pfeil in IRI 2 d zeigt vergrößerte Zellkerne; Weiße Pfeilspitzen zeigen Bereiche der Lymphozyten- und Makrophageninfiltration (Vergrößerung 40x; Skalenbalken = 50 μm). Weiße Pfeilspitzen in IRI 4 d zeigen mitotische tubuläre Zellen an (Vergrößerung 40x; Skalenbalken = 50 μm). Schwarzer Pfeil in IRI 7 d zeigt einen Bereich der fokalen Fibrose; Die weiße Pfeilspitze zeigt einen Regenerationsbereich (Vergrößerung 20x; Skalenbalken = 100 μm). (B) PAS-Färbung, die die Nierenrinde von Mäusen während der frühen Reperfusion (4 h, 8 h und 16 h) zeigt. Beachten Sie die fortschreitende Dämpfung des Pinselrahmens (Pfeile). Vergrößerungen 40x; Skalenbalken = 50 μm (C) Masson trichrome Färbung von Schein- und IRI 7 d-Mäusen, die Bereiche der interstitiellen Fibrose zeigen (weiße Pfeile). Vergrößerung 40x; Maßstabsstäbe = 50 μm. Abkürzungen: IRI = Ischämie-Reperfusionsverletzung; Glo = Glomerulus; PCT = proximal gewundener Tubulus; DCT = distaler gewundener Tubulus; CD = Sammelkanal; PAS = Periodensäure Schiff; d = Tag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Tubular Injury Score von Schein- und IRI-operierten Mäusen. Scoring-System Skala 1 bis 5 für die röhrenförmige Epitheldämpfung; Verlust des Pinselrands; tubuläre Nekrose; luminale Obstruktion; und Vorhandensein von proteinhaltigem Guss. Eine Zuweisung von "1" zeigt an, dass die Änderung vorhanden ist, "0", dass sie nicht vorhanden ist. Einzelne Werte werden angezeigt. Balken stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 4). Abkürzung: IRI = Ischämie-Reperfusionsverletzung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Signifikanteste pathologische Veränderungen im Laufe der Zeit. Diagnostiziert auf der Grundlage einer mikroskopischen Untersuchung von 4-6 Tieren pro Gruppe.

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte in Bezug auf diesen Artikel gibt.