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Methodenartikel

Schnelle, kostengünstige und unkomplizierte Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat

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DOI:

10.3791/62753

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29. Oktober 2021

 ,  ,  , 
1Biocircuits Institute, University of California, San Diego, 2Present address, Kyoto Institute of Technology, 3Present address, Vertex Pharmaceuticals, 4Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 5Molecular Biology Section, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode zur Herstellung von bakteriellem Lysat für die zellfreie Genexpression unter Verwendung eines technisch hergestellten Stammes von Escherichia coli und erfordert nur Standardlaborgeräte.

Zusammenfassung

Die zellfreie Genexpression bietet die Kraft der Biologie ohne die Komplikationen eines lebenden Organismus. Obwohl es viele solcher Genexpressionssysteme gibt, sind die meisten ziemlich teuer in der Anschaffung und / oder erfordern spezielle Ausrüstung und fein geschliffenes Fachwissen, um effektiv zu produzieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat, das ein hohes Maß an Genexpression unterstützt, nur Standardlaborgeräte verwendet und nur minimale Verarbeitung erfordert. Die Methode verwendet einen Escherichia coli-Stamm, der ein Endolysin produziert, das das Wachstum nicht beeinflusst, aber ein geerntetes Zellpellet nach einem einfachen Gefrier-Tau-Zyklus effizient lysiert. Die einzige weitere Verarbeitung, die erforderlich ist, ist eine kurze Inkubation, gefolgt von einer Zentrifugation, um das Autolysat von Zelltrümmern zu befreien. Dynamische Genschaltkreise können durch heterologe Expression der ClpX-Protease in den Zellen vor der Ernte erreicht werden. Ein E. coli-Stamm, dem das lacZ-Gen fehlt, kann für hochempfindliche, zellfreie Biosensoranwendungen unter Verwendung einer kolorimetrischen oder fluoreszierenden Anzeige verwendet werden. Das gesamte Protokoll erfordert nur 8-9 Stunden, mit nur 1-2 Stunden praktischer Arbeit von der Impfung bis zur Fertigstellung. Durch die Reduzierung der Kosten und des Zeitaufwands für die Gewinnung von zellfreiem Lysat soll diese Methode die Erschwinglichkeit der zellfreien Genexpression für verschiedene Anwendungen erhöhen.

Einleitung

Die Genexpression in zellfreien Lysaten hat mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung lebender Zellen1,2,3,4. Lysate können leicht biochemisch modifiziert und unter Bedingungen verwendet werden, die für lebende Zellen schädlich oder unmöglich zu erreichen sein könnten. Genexpressionsschaltkreise müssen nicht mit biologischen Prozessen des Wirts konkurrieren oder konkurrieren, und das Testen neuer genetischer Schaltkreise ist so einfach wie das Hinzufügen von DNA. Aus diesen Gründen hat die zellfreie Genexpression verschiedene Anwendungen gefunden, von den Biosensoren5,6 über das schnelle Prototyping synthetischer Genschaltkreise7,8 bis hin zur Entwicklung künstlicher Zellen9. Die meisten zellfreien Genexpressionen verwenden zelluläre Lysate, die hochgradig verarbeitet wurden und im Allgemeinen lange und komplexe Protokolle, spezielle Ausrüstung und / oder empfindliche Schritte erfordern, die zu erheblichen Abweichungen zwischen Benutzern und Chargen führen können10,11.

Dieses Papier beschreibt eine einfache, effiziente Methode zur Herstellung von zellfreiem Lysat, die minimale Verarbeitung und Expertise erfordert (Abbildung 1A)12. Die Methode basiert auf E. coli-Zellen, die so konstruiert sind, dass sie nach einem einfachen Gefrier-Tau-Zyklus lysieren. Die Zellen exprimieren ein Endolysin aus Phagen-Lambda, das die Zellwand abbaut. Während die Zellen wachsen, verbleibt dieses Endolysin im Zytoplasma, abgetrennt von der Zellwand. Ein einfacher Gefrier-Tau-Zyklus stört jedoch die zytoplasmatische Membran und setzt das Endolysin in das Periplasma frei, wo es die Zellwand abbaut, was zu einer schnellen Zelllyse führt. Das Protokoll kann mit nur wenigen Stunden praktischer Arbeit abgeschlossen werden und erfordert nur einen Gefrierschrank, eine Zentrifuge mit einer Kapazität von 30.000 × g (für optimale Ergebnisse; niedrigere Geschwindigkeiten können mit mehr Sorgfalt verwendet werden, um das Pellet nicht zu stören), einen Wirbelmischer und eine einfache Pufferlösung. Funktionelles Lysat kann sogar hergestellt werden, indem die Zellen gefriergetrocknet und in siturehydriert werden. Diese Methode produziert jedoch Lysate mit geringerer Aktivität, vermutlich aufgrund der verbleibenden Zelltrümmer.

Die Lysate sind hochaktiv für die zellfreie Genexpression und können je nach Endverwendung auf verschiedene Weise verbessert werden. Die Geschwindigkeit der Proteinsynthese kann weiter erhöht werden, indem das Lysat unter Verwendung von Standard-Spinkonzentratoren konzentriert wird. Lineare DNA kann durch Zugabe von gereinigtem GamS-Protein vor dem Abbau geschützt werden. Der Proteinabbau, der für komplexere Schaltkreisdynamiken wie Oszillation notwendig ist, kann durch Co-Exprimation eines ClpX-Hexamers im autolysatproduzierenden Stamm13erreicht werden. Schließlich werden LacZ-basierte visuelle Auslesungen ermöglicht, indem ein Autolysat-Stamm ohne lacZverwendet wird. Insgesamt erzeugt dieses Verfahren ein hochaktives zellfreies Lysat, das sich für ein breites Anwendungsspektrum eignet.

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Protokoll

1. Bereiten Sie Medien und Puffer vor.

  1. Bereiten Sie 2xYTPG Medium vor.
    1. Mischen Sie 62 g 2xYT Pulver, 5,99 g Kaliumphosphat monobasisch, 13,93 g Kaliumphosphat zweibasisch und entionisiertes Wasser zu 2 L.
    2. Autoklav auf Flüssigkeitszyklus mit einer Einwirkzeit von 30 min14.
    3. Auf 400 ml 2xYTP-Medien aus 1.1.2 werden 7,2 g D-Glucose (Dextrose) zugegeben und bis zur Auflösung gemischt.
    4. Filter-Sterilisieren Durch einen 0,2 μm Filter.
  2. Bereiten Sie den S30A-Puffer vor.
    1. Mischen Sie Tris-HCl (pH 7,7, 50 mM Endkonzentration), Kaliumglutamat (60 mM end) und Magnesiumglutamat (14 mM Endkonzentration).
    2. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M KOH auf 7,7 ein.
  3. Bereiten Sie Lösung 1 vor (siehe Tabelle 1).
    1. Resuspend 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES) in 2 mL Wasser.
    2. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 8,0 ein.
    3. Fügen Sie alle anderen Komponenten aus Tabelle 1 hinzu.
    4. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M KOH auf 7,6 ein. Filter-sterilisieren.
  4. 2,5-fache Vormischungslösung zubereiten (siehe Tabelle 2).
    1. Mischen Sie alle Komponenten in Tabelle 2.
    2. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,5 ein.
    3. Aliquot und bei -80 °C einfrieren.
      HINWEIS: Eine 20-μL-Reaktion verwendet 8,9 μL Vormischung.

2. Bereiten Sie Zellen vor.

  1. Die Autolysatzellen mit einer Impfschleife auf LB-Agarplatten mit 50 μg/ml Ampicillin streifen und bei 37 °C wachsen (siehe Anmerkung 1).
  2. Eine einzelne Kolonie mit einer Pipettspitze in eine Starterkultur aus LB/Ampicillin-Medium aufnehmen und über Nacht bei 37 °C wachsen lassen.
  3. 400 ml 2xYTPG-Medium mit 50 μg/ml Ampicillin mit 400 μL Starterkultur impfen und bei 37 °C in einem 1 L Erlenmeyerkolben unter Schütteln bei 300 U/min wachsen.
  4. Messen Sie periodisch die optische Dichte der Kultur bei 600 nm (OD600) mit einem Spektralphotometer, um eine optische Küvette mit einer Weglänge von 1 cm abzulesen. Wenn der OD600 1 überschreitet, beginnen Sie vor den Messungen mit der 5-fachen Verdünnung der Kultur, um sicherzustellen, dass die Messungen im linearen Bereich eines typischen Laborspektrophotometers bleiben. Züchten Sie die Zellen weiter, bis die 5-fach verdünnte Kultur OD600 von 0,3 erreicht (entsprechend einer Kultur OD600 von 1,5).

3. Bereiten Sie das Lysat vor.

  1. Bereiten Sie den S30A-Puffer vor, der mit 2 mM Dithiothreitol (DTT) ergänzt wird. Mischen Sie 3 ml S30A-Puffer mit 6 μL DTT-Stammlösung bei 1 M. Legen Sie sie zur Verwendung in Schritt 3.7 auf Eis.
  2. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 1800 × g für 15 min bei Raumtemperatur.
  3. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn abgießen und mit einem Pipett die verbleibende Flüssigkeit entfernen.
  4. Resuspendieren Sie das Pellet in 45 ml kaltem (4-10 °C) S30A-Puffer mit einem Wirbelmischer.
  5. Wiegen Sie ein leeres 50-ml-Zentrifugenröhrchen, übertragen Sie die Zellen hinein und wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.3, um die Zellen zu waschen.
  6. Wiegen Sie das Pellet und ziehen Sie das Gewicht eines leeren 50-ml-Rohres ab. Achten Sie darauf, den verbleibenden Überstand vorsichtig abzusaugen, um eine genaue Messung des Pelletgewichts zu gewährleisten.
    HINWEIS: Eine typische Ausbeute beträgt ~1,3 g Zellpellet aus 400 ml Produktionskultur.
  7. Fügen Sie 2 Volumina kalten S30A-Puffers hinzu, ergänzt mit 2 mM Dithiothreitol, d. H. 2 ml Puffer pro 1 g Zellpellet, und resuspendieren Sie die Zellen durch kräftiges Wirbelmischen.
  8. Frieren Sie die Zellen ein. Legen Sie das 50-ml-Röhrchen mit den Zellen in einen Gefrierschrank mit -20 °C oder -80 °C, bis das Pellet gründlich eingefroren ist.
    HINWEIS: Der Gefrierschritt ist ein guter Haltepunkt für den Tag.
  9. Tauen Sie die Zellen in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auf.
  10. 2-3 min kräftig wirbeln.
  11. Bei 37 °C für 45 min mit Schütteln bei 300 U/min inkubieren.
  12. Reinigen Sie die Probe von schweren Zelltrümmern durch Zentrifugieren in transparenten Zentrifugenröhrchen bei 30.000 × g für 45 min bei 4 °C.
    HINWEIS: Wenn eine Zentrifuge mit einer Kapazität von 30.000 x g nicht verfügbar ist, zentrifugieren Sie für 45 min bei 21.000 × gund seien Sie in Schritt 3.13 besonders vorsichtig, da das Pellet weniger kompakt ist.
  13. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig mit einem Pipett in ein neues Rohr, um das Pellet so weit wie möglich zu stören. Wenn der übertragene Überstand mit Material aus dem Pellet verunreinigt ist, wiederholen Sie den vorherigen Schritt.
  14. Den Überstand auf 1,5 mL Zentrifugenröhrchen umfüllen und bei 21.000 × g (oder der Höchstgeschwindigkeit einer Tischzentrifuge) für 5 min noch einmal zentrifugieren.
  15. Aliquotieren Sie das gereinigte Autolysat in die gewünschten Volumina, vermeiden Sie sorgfältig verbleibende Pellets und frieren Sie bei -80 °C ein oder verwenden Sie es sofort.
    HINWEIS: Eine einzelne 20-μL-Reaktion verwendet 8 μL Autolysat.

4. Zellfreie Genexpression

HINWEIS: Das Autolysat ist nun für jede gewünschte Endverwendung bereit. Im Folgenden finden Sie ein Beispiel für ein Standardprotokoll für die zellfreie Genexpression.

  1. Für eine 20 μL-Reaktion mischen Sie auf Eis 8 μL Autolysat und 8,9 μL Premix. Siehe HINWEIS am Ende des Protokollabschnitts bezüglich der Optimierung der Magnesiumglutamat- und PEG 8000-Konzentrationen.
  2. Fügen Sie DNA (z. B. pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 auf eine Endkonzentration von 8 nM), andere Reagenzien und Wasser auf 20 μL hinzu.
  3. Platzieren Sie die Reaktion in einer 384-Well-Mikroplatte und messen Sie den Fluoreszenzzeitverlauf und/oder die Endpunkte mit einem Plattenleser. Verwenden Sie für grün fluoreszierendes Protein (GFP) eine Anregungswellenlänge von 485 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm.

5. Protokolländerungen

HINWEIS: Die folgenden Änderungen des Protokolls ermöglichen es, andere Anwendungen zu bedienen.

  1. Zellfreie Genexpression mittels linearer DNA-Templates
    1. Führen Sie die Schritte in Abschnitt 4 durch und ergänzen Sie die Reaktion mit 2,2 μM gereinigtem GamS-Protein (exprimiert und gereinigt wie beschrieben12),bevor die lineare DNA hinzugefügt wird.
  2. Zellfreie Genexpression mit Proteinabbau
    1. Verwenden Sie in Schritt 2.1 Autolysatzellen, die das Plasmid pACYC-FLAG-dN6-His enthalten (siehe Materialtabelle). In allen Wachstumsmedien zusätzlich 34 μg/ml Chloramphenicol enthalten.
    2. In Schritt 2.3 werden 40 μM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) in das Wachstumsmedium aufgenommen, um die Expression aus dem Plasmid zu induzieren.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.4 (Waschen) zwei weitere Male (für insgesamt drei Wäschen), um die vollständige Entfernung von Chloramphenicol, einem Translationsinhibitor, sicherzustellen. Für die ersten beiden Waschungen (Schritt 3.4) ersetzen Sie den S30A-Puffer durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4).
    4. Ergänzen Sie in Schritt 4.2 ein zusätzliches 3 mM ATP (zugesetzt aus einer Stammlösung von 100 mM ATP in Wasser, pH 7,2) und 4,5 mM Magnesiumglutamat (unter Verwendung einer 1 M Stammlösung in Wasser) (Endkonzentrationen), um den hohen ATP-Einsatz durch ClpXP sowie die Chelatbildung von Magnesium durch das zusätzliche ATP auszugleichen.
  3. Zellfreie Genexpression mittels LacZ-basierter Auslesungen (einschließlich kolorimetrischer)
    1. Verwenden Sie in Schritt 2.1 Autolysatzellen, die LacZ nicht nativ exprimieren (siehe Materialtabelle).
  4. Alternativ können Sie das Lysat direkt aus gefriergetrockneten Zellen herstellen.
    1. Führen Sie alle Schritte von 1.1 bis 3.7 aus.
    2. Mischen Sie 8 μL Zellsuspension mit 8,9 μL Premix.
    3. Fügen Sie Plasmid-DNA (falls gewünscht), andere benutzerdefinierte Reagenzien und Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 20 μL zu erreichen.
    4. Übertragen Sie die Reaktion auf eine 384-Well-Mikrotiterplatte und trocknen Sie sie gefrier.
      HINWEIS: Gefriergetrocknete Proben können bis zu einer Woche und möglicherweise länger gelagert werden.
    5. Um die Reaktion zu beginnen, rehydrieren Sie es mit 18 μL deionisiertem Wasser, ergänzt mit einer beliebigen DNA oder anderen Reagenzien.
    6. Verfolgen Sie die Fluoreszenzdynamik in einem Plattenleser.

HINWEIS 1: Autolysatzellen sind so konzipiert, dass sie bei einem Gefrier-Tau-Zyklus lysieren, daher ist es besonders wichtig, kryoprotektiv bei der Herstellung von gefrorenen Beständen zu verwenden. Wir haben Bestände in 24% Gew./Vol.-Glycerin eingefroren und bei -80 °C gelagert.

ANMERKUNG 2: Magnesiumionen und PEG 8000 sind entscheidend für die Lysatleistung. Die Basen-2,5-fache Vormischung enthält auf der Grundlage zuvor veröffentlichter Daten 6 mM Magnesiumglutamat und 4,8 % Gew./Vol. PEG 8000, die in der Endreaktion zu 2,4 mM bzw. 1,9 % werden. Das mit dem hier hergestellten Autolysat funktioniert typischerweise am besten mit einem zusätzlichen 5 mM Mg-Glutamat und 1,5% PEG 8000 in der Endreaktion. Dies kann jedoch im Bereich von einem zusätzlichen 0-10 mM Mg Glutamat und einem zusätzlichen 0-3% PEG 8000 (im Vergleich zum Basenvormix) optimiert werden. Um die Vormischung mit den empfohlenen zusätzlichen 5 mM Mg-Glutamat und 1,5% PEG 8000 (Endkonzentrationen) herzustellen, mischen Sie 380 μL Vormischung mit 4,75 μL Magnesiumglutamat bei 1 M und 36,1 μL PEG 8000 bei 40% Gewicht/Volumen.

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Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse können beobachtet werden, indem man mit Autolysat GFP aus einem konstitutiv exprimierenden Plasmid, hier pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, exprimiert und einen Zeitverlauf der GFP-Fluoreszenz in einem Plattenleser aufzeichnet (Abbildung 1B). Eine Verdünnungsserie von Plasmid-DNA fand selbst bei 1 nM-DNA eine starke Expression. Im Vergleich zu einem handelsüblichen Lysat kann das Autolysat eine größere Gesamtausbeute erzeugen und eine größere maximale Produktionsrate...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll liefert hochaktives bakterielles Lysat für die zellfreie Genexpression. Der Schlüssel liegt darin, Zellen zu verwenden, die das Plasmid pAD-LyseR tragen, das den Lambda-Phagen Endolysin zytosolisch exprimiert. Diese Zellen werden potenziert, um sich bei der Permeabilisierung der inneren Membran selbst zu lysieren, so dass das Endolysin Zugang zur Zellwand erhält, was die Methode durch einen einfachen Gefrier-Tau-Zyklus erreicht. Da sich die Zellen effektiv selbst lysieren, wird das Produkt...

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Offenlegungen

J.H. ist Mitbegründer von GenCirq Inc., die sich auf Krebstherapeutika konzentrieren. Er ist Mitglied des Board of Directors und hat Eigenkapital in GenCirq.

Danksagungen

Die Autoren danken Zachary Sun und Richard Murray (California Institute of Technology) für die freundliche Bereitstellung des Plasmids P_araBAD-gamS und Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) für die freundliche Bereitstellung einer Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health und des ARO MURI-Programms unterstützt und teilweise von der Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan, unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2xYT MediumEMD Millipore4.85008oder gleichwertig
3-PGASigma AldrichP8877oder gleichwertig
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit, 3 kDa CutoffMillipore Sigma UFC900308optional, kann zum Konzentrieren von Lysat verwendet werden, Auswahl der Konzentratorkapazität, die für das zu konzentrierende Volumen geeignet
AmpicillinSigma AldrichA0166-5Goder Carbenicillin, eine stabilere Variante
ATPSigma AldrichA8937oder gleichwertiges
cAMPSigma AldrichA9501oder gleichwertiges
CoASigma AldrichC4282oder gleichwertiges
CTPUnited States Biosciences14121oder gleichwertiges
D-Glucose (Dextrose)Fisher ScientificAAA1749603oder äquivalentes
Dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632-1Goder gleichwertiges
E. coli BL21-Gold (DE3) mit pAD-LyseR Addgene99244
E. coli BL21-Gold (DE3) & Delta; lacZ mit pAD-LyseRAddgene99245
FolinsäureSigma AldrichF7878oder gleichwertig
GTPUnited States Biosciences16800oder gleichwertig
HEPES,Sigma AldrichH3375-25Goder gleichwertiges
LB-MediumFisher ScientificDF0446075oder gleichwertiges
MagnesiumglutamatSigma Aldrich49605-250Goder gleichwertiges
NADSigma AldrichN6522oder gleichwertiges
Kaliumglutamat,Sigma AldrichG1501-100Goder gleichwertiges
Kaliumhydroxid (KOH)Sigma Aldrich221473-25Gzum Einstellen des pH-Werts
Kaliumphosphat, zweibasischFisher ScientificBP363-500oder gleichwertig
monobasisches KaliumphosphatFisher ScientificBP362-500oder gleichwertiges
SpermidinSigma Aldrich85558oder gleichwertiges
Tris-HClFisher Scientific9310500GModer gleichwertiges
tRNA-MixRoche10109541001oder gleichwertiges
UTPUnited States Biosciences23160oder gleichwertig
ist , , , , , , , , , ,

Referenzen

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