Schnelle, kostengünstige und unkomplizierte Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat

Robert M. Cooper; Taishi Tonooka; Andriy Didovyk; Jeff Hasty

doi:10.3791/62753

Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Schnelle, kostengünstige und unkomplizierte Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat

4.7K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/62753

⸱

29. Oktober 2021

Robert M. Cooper^*¹ , Taishi Tonooka^*¹^,² , Andriy Didovyk^*¹^,³ , Jeff Hasty¹^,⁴^,⁵

¹Biocircuits Institute, University of California, San Diego, ²Present address, Kyoto Institute of Technology, ³Present address, Vertex Pharmaceuticals, ⁴Department of Bioengineering, University of California, San Diego, ⁵Molecular Biology Section, University of California, San Diego

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode zur Herstellung von bakteriellem Lysat für die zellfreie Genexpression unter Verwendung eines technisch hergestellten Stammes von Escherichia coli und erfordert nur Standardlaborgeräte.

Zusammenfassung

Die zellfreie Genexpression bietet die Kraft der Biologie ohne die Komplikationen eines lebenden Organismus. Obwohl es viele solcher Genexpressionssysteme gibt, sind die meisten ziemlich teuer in der Anschaffung und / oder erfordern spezielle Ausrüstung und fein geschliffenes Fachwissen, um effektiv zu produzieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat, das ein hohes Maß an Genexpression unterstützt, nur Standardlaborgeräte verwendet und nur minimale Verarbeitung erfordert. Die Methode verwendet einen Escherichia coli-Stamm, der ein Endolysin produziert, das das Wachstum nicht beeinflusst, aber ein geerntetes Zellpellet nach einem einfachen Gefrier-Tau-Zyklus effizient lysiert. Die einzige weitere Verarbeitung, die erforderlich ist, ist eine kurze Inkubation, gefolgt von einer Zentrifugation, um das Autolysat von Zelltrümmern zu befreien. Dynamische Genschaltkreise können durch heterologe Expression der ClpX-Protease in den Zellen vor der Ernte erreicht werden. Ein E. coli-Stamm, dem das lacZ-Gen fehlt, kann für hochempfindliche, zellfreie Biosensoranwendungen unter Verwendung einer kolorimetrischen oder fluoreszierenden Anzeige verwendet werden. Das gesamte Protokoll erfordert nur 8-9 Stunden, mit nur 1-2 Stunden praktischer Arbeit von der Impfung bis zur Fertigstellung. Durch die Reduzierung der Kosten und des Zeitaufwands für die Gewinnung von zellfreiem Lysat soll diese Methode die Erschwinglichkeit der zellfreien Genexpression für verschiedene Anwendungen erhöhen.

Einleitung

Die Genexpression in zellfreien Lysaten hat mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung lebender Zellen¹^,²^,³^,⁴. Lysate können leicht biochemisch modifiziert und unter Bedingungen verwendet werden, die für lebende Zellen schädlich oder unmöglich zu erreichen sein könnten. Genexpressionsschaltkreise müssen nicht mit biologischen Prozessen des Wirts konkurrieren oder konkurrieren, und das Testen neuer genetischer Schaltkreise ist so einfach wie das Hinzufügen von DNA. Aus diesen Gründen hat die zellfreie Genexpression verschiedene Anwendungen gef....