Method Article

Untersuchungen von Chaperon-Cochaperon-Interaktionen mit homogenem Bead-based Assay

DOI:

10.3791/62762

⸱

July 21st, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience Care and Society, Division of Neurogeriatrics, Karolinska Institutet, 2Department of Pharmaceutical Engineering & Technology, Indian Institute of Technology (BHU), 3Theme Inflammation and Aging, Karolinska University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll stellt eine Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen unter Verwendung von Glutathion-verknüpften Spenderperlen mit GST-verschmolzenen TPR-Motiv-Co-Chaperonen und Akzeptorperlen in Verbindung mit einem Hsp90-abgeleiteten Peptid vor. Wir haben diese Technik verwendet, um kleine Moleküle zu screenen, um Hsp90-FKBP51- oder Hsp90-FKBP52-Interaktionen zu stören, und potente und selektive Hsp90-FKBP51-Interaktionshemmer identifiziert.

Abstract

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Das Targeting der Wechselwirkungen mit dem Hitzeschockprotein 90 (Hsp90)-Cochaperon bietet die Möglichkeit, Hsp90-abhängige intrazelluläre Prozesse gezielt zu regulieren. Das konservierte MEEVD-Pentapeptid am C-Terminus von Hsp90 ist für die Wechselwirkung mit dem Tetratricopeptid-Wiederholungsmotiv (TPR) von Co-Chaperonen verantwortlich. FK506-bindendes Protein (FKBP) 51 und FKBP52 sind zwei ähnliche TPR-Motiv-Co-Chaperone, die an steroidhormonabhängigen Erkrankungen mit unterschiedlichen Funktionen beteiligt sind. Daher bietet die Identifizierung von Molekülen, die spezifisch Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und FKBP51 oder FKBP52 blockieren, ein vielversprechendes therapeutisches Potenzial für mehrere menschliche Krankheiten. Hier beschreiben wir das Protokoll für einen amplifizierten lumineszierenden homogenen Näherungsassay zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und seinen Partner-Co-Chaperonen FKBP51 und FKBP52. Zunächst haben wir die TPR-motivhaltigen Proteine FKBP51 und FKBP52 in Glutathion-S-Transferase (GST)-getaggter Form gereinigt. Unter Verwendung der Glutathion-verknüpften Spenderperlen mit GST-verschmolzenen TPR-Motivproteinen und den Akzeptorperlen in Verbindung mit einem 10-mer C-terminalen Peptid von Hsp90 haben wir Protein-Protein-Interaktionen in einer homogenen Umgebung untersucht. Wir haben diesen Assay verwendet, um kleine Moleküle zu screenen, um Hsp90-FKBP51- oder Hsp90-FKBP52-Interaktionen zu stören, und potente und selektive Hsp90-FKBP51-Interaktionshemmer identifiziert.

Introduction

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Molekulare Chaperone tragen zur Protein-Homöostase bei, einschließlich Proteinfaltung, Transport und Abbau. Sie regulieren mehrere zelluläre Prozesse und sind mit zahlreichen Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen verbunden1. Das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) ist eines der wichtigsten Chaperone, dessen Funktion von Konformationsänderungen abhängt, die durch ATP-Hydrolyse und Bindung an Client-Proteine, die durch seine Co-Chaperone vermitteltwerden, angetriebenwerden 2 . Trotz eines offensichtlichen Potenzials von Hsp90 als therapeutisches Ziel stellt die Feinabstimmung seiner Funktion eine große Herausforderung dar. Es gibt mehrere Hsp90-Inhibitoren, die auf die N-terminale ATP-Bindungsregion abzielen, die in klinischen Studien untersucht wurden, aber keiner von ihnen wurde für die Vermarktung zugelassen3. Aufgrund des Fehlens einer gut definierten Ligandenbindungstasche4hatte das Targeting der C-terminalen Region von Hsp90 nur begrenzten Erfolg4. Kürzlich wurde die Störung von Hsp90-Cochaperon-Wechselwirkungen durch kleine Moleküle als alternative Strategie untersucht5. Die Ausrichtung auf die Hsp90-Cochaperon-Interaktionen würde keine allgemeine Zellstressreaktion hervorrufen und bietet die Möglichkeit, verschiedene intrazelluläre Prozesse spezifisch zu regulieren. Das konservierte MEEVD-Pentapeptid am C-Terminus von Hsp90 ist für die Wechselwirkung mit dem Tetratricopeptid-Wiederholungsmotiv (TPR) der Co-Chaperone verantwortlich6. Von den 736 TPR-motivhaltigen Proteinen, die in der humanen Proteindatenbank annotiert sind, interagieren ~20 verschiedene Proteine über dieses Peptid mit Hsp907. Moleküle, die um die MEEVD-Peptidbindung konkurrieren, würden die Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und Co-Chaperonen, die eine TPR-Domäne enthalten, stören. Die Peptidbindungsstelle hat eine ähnliche tertiäre Struktur, aber die Gesamthomologie zwischen verschiedenen TPR-Motivdomänen ist relativ niedrig7, was die Möglichkeit bietet, Moleküle zu identifizieren, die spezifisch in der Lage sind, Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und bestimmten TPR-Motiv-Co-Chaperonen zu blockieren. Unter diesen TPR-Motiv-Co-Chaperonen sind FK506-bindendes Protein (FKBP) 51 und FKBP52 Regulatoren der Steroidhormonrezeptor-Signalisierung (SHR) und an mehreren Steroidhormon-abhängigen Krankheiten beteiligt, darunter Krebs, stressbedingte Krankheiten, Stoffwechselerkrankungen und Alzheimer-Krankheit8. Obwohl FKBP51 und FKBP52 > Sequenzähnlichkeit von 80% teilen, unterscheiden sich ihre Funktionen: FKBP52 ist ein positiver Regulator der SHR-Aktivität, während FKBP51 in den meisten Fällen ein negativer Regulator ist8. Daher bietet die Identifizierung von Molekülen, die spezifisch Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und FKBP51 oder FKBP52 blockieren, ein vielversprechendes therapeutisches Potenzial für verwandte Krankheiten.

Einmplified Luminescent Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) wurde erstmals 1994 von Ullman EF et al.9entwickelt. Jetzt wird es häufig verwendet, um verschiedene Arten von biologischen Interaktionen wie Peptid10, Protein11, DNA12, RNA13und Zucker14zu erkennen . Bei dieser Technik gibt es zwei Arten von Perlen (Durchmesser 200 nm), eine ist die Spenderperle und die andere ist die Akzeptorperle. Die Biomoleküle werden auf diesen Perlen immobilisiert; ihre biologischen Wechselwirkungen bringen Spender- und Akzeptorperlen in die Nähe. Bei 680 nm beleuchtet ein Photosensibilisator in der Spenderperle und wandelt Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff um. Da der Singsingstoff eine kurze Lebensdauer hat, kann er nur bis zu 200 nm diffundieren. Befindet sich die Akzeptorperle in der Nähe, reagiert ihr Thioxenderivat mit dem Singulett Sauerstoff, der bei 370 nm Chemilumineszenz erzeugt. Diese Energie aktiviert weiterhin Fluorophore in derselben Akzeptorperle, um Licht bei 520-620 nm15zu emittieren. Wenn die biologischen Wechselwirkungen gestört sind, können die Akzeptorperle und die Spenderperle keine Nähe erreichen, was zum Sauerstoffzerfall des Singuletts und zu einem schwach produzierten Signal führt.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das diese Technik zum Screening kleiner Moleküle verwendet, die Wechselwirkungen zwischen Hsp90- und TPR-Co-Chaperonen hemmen, insbesondere FKBP51 und FKBP52. Die 10 Aminosäuren langen Peptide, die Hsp90 extremem C-Terminus entsprechen, sind an Akzeptorperlen gebunden. Gereinigte GST-markierte TPR-Co-Chaperone interagieren mit Glutathion-verknüpften Spenderperlen. Wenn die Wechselwirkung zwischen Hsp90-abgeleiteten Peptiden und TPR-Motiv-Co-Chaperonen die Perlen zusammenbringt, wird ein verstärktes Signal erzeugt (Abbildung 1A). Wenn die gescreenten kleinen Moleküle die Wechselwirkungen zwischen Hsp90- und TPR-Motiv-Co-Chaperonen hemmen können, wird dieses verstärkte Signal verringert (Abbildung 1B). Ihr IC50 kann durch quantitative Messung berechnet werden. Dieses Protokoll kann auf alle Chaperon-TPR-Motiv-Co-Chaperon-Interaktionen von Interesse erweitert werden und ist von großer Bedeutung für die Entwicklung neuartiger Moleküle, die insbesondere die Wechselwirkung zwischen Hsp90 und FKBP51 oder FKBP52 blockieren.

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Abbildung 1: Das Grundprinzip dieses Assays. (A) Gereinigte GST-FKBP51 interagiert mit Glutathion-verknüpften Spenderperlen. Die 10 Aminosäuren langen Peptide, die dem extremen C-Terminus von Hsp90 entsprechen, sind an Akzeptorperlen gebunden. Die Interaktion zwischen Hsp90-abgeleiteten Peptiden und der TPR-Domäne von FKBP51 bringt die Spender- und Akzeptorperlen in die Nähe. Bei 680 nm beleuchtet ein Photosensibilisator in der Spenderperle und wandelt Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff um. Das Thioxenderivat auf der Akzeptorperle reagiert mit dem Singulett Sauerstoff und erzeugt eine Chemilumineszenz bei 370 nm. Diese Energie aktiviert weiterhin Fluorophore in derselben Akzeptorperle, um Licht bei 520-620 nm zu emittieren. (B) Wenn kleine Moleküle die Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und FKBP51 hemmen, können die Spender- und Akzeptorperlen keine Nähe erreichen. Dann zerfällt der Singulett-Sauerstoff mit kurzer Lebensdauer und es wird kein nachweisbares Signal erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HINWEIS: Eine Übersicht über dieses Protokoll ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Expression und Reinigung von GST-FKBP51 und GST-FKBP52 (Abbildung 2A)

  1. Plasmide
    HINWEIS: Beziehen Sie cDNA-Klone für menschlicheS FKBP51 (Klon-ID: 5723416) und für menschliches FKBP52 (Klon-ID: 7474554) vom IMAGE-Konsortium.
    1. Amplifizieren Sie die humane FKBP51-DNA durch PCR mit Primern (vorwärts; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', umgekehrt; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3'), die BamHI- und XhoI-Überhänge enthalten, und klonen Sie sie an BamHI / XhoI-Restriktionsstellen in pGEX6-1-Vektor.
    2. Amplifizieren Sie die humane FKBP52-DNA durch PCR mit Primern (vorwärts; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', umgekehrt; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') mit EcoRI- und XhoI-Überhängen und klonen Sie sie an EcoRI / XhoI-Restriktionsstellen in pGEX6-2-Vektor.
      HINWEIS: Aufbau der PCR-Reaktion und Bedingungen sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt.
    3. Überprüfen Sie die eingefügte Sequenz und wandeln Sie die Plasmide gemäß dem Herstellungsprotokoll in die chemisch kompetenten E. coli um.
  2. Proteinexpression und -reinigung
    1. Fügen Sie 25 g Luria Brühe (LB) Basis in 1 L destilliertes Wasser hinzu, um die LB-Lösung herzustellen. Autoklavieren Sie es bei 121 °C für 15 min. Nach dem Abkühlen 50 μg/ml Ampicillin hinzufügen.
    2. Nehmen Sie eine Bakterienkolonie, die GST-FKBP51 oder GST-FKBP52 exprimieren, und mischen Sie sie mit 500 μL LB-Lösung in einem 1,5-ml-Röhrchen. Wirbel.
    3. Die Mischung aus "1.2.2" in 1 L LB-Lösung in den mit einer Aluminiumfolie bedeckten Erlenmeyerkolben geben. Den Erlenmeyerkolben über Nacht bei 37 °C im Shaker inkubieren.
    4. Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (IPTG) zum Erlenmeyerkolben und setzen Sie die Inkubation für weitere 2 h fort.
    5. Um Zellpellets zu erhalten, zentrifugieren Sie bei 5.000 x g für 15 min. Entfernen Sie den Überstand.
      HINWEIS: Die Zellpellets können bei -20 °C gelagert werden.
    6. Die Zellpellets in 40 ml PBS wieder auffüllen und 3 x 20 s auf Eis beschallen. Fügen Sie 1 mM PMSF, 1 mM EDTA und Protease-Inhibitor-Cocktail (1 Tablette) hinzu, um die Proteolyse zu verhindern.
    7. Zentrifugieren Sie die Suspension für 30 min 50.000 x g, um Zellablagerungen zu entfernen und tragen Sie den Überstand auf die 5 mL GST-Trap-Säule auf.
    8. Nachdem Sie die Säule mit 30 mL PBS gewaschen haben, eluieren Sie GST-FKBP51 und GST-FKBP52 mit 5 mL 10 mM Glutathion in PBS.
    9. Konzentrieren Sie Proteine auf 15 mL 10.000 MWCO Zentrifugationseinheit. Um freies Glutathion zu entfernen, geben Sie die Konzentrate durch die PD-10-Säule, die mit 0,5x PBS ausgeglichen ist, und konzentrieren Sie sich erneut auf die Filterzentrifuge.
    10. Sammeln Sie proteinhaltige Fraktionen. Überprüfen Sie die Proteine in SDS-PAGE und passen Sie die Proteinkonzentrationen auf 1 mg/ml an.
      HINWEIS: Die typische Proteinausbeute beträgt 2-5 mg / L Kultur. Das Protein kann bei -20 °C gespeichert werden.

2. Kopplung des Hsp90 C-terminalen Peptids an die Akzeptorperlen (Abbildung 2B)

  1. Hsp90 Peptidpräparat
    1. Synthese von zehnAminosäurepeptid NH2-EDASRMEEVD-COOH entsprechend den Aminosäuren 714-724 der humanen Hsp90 beta-Isoform (UniProt ID: P08238) durch einen Peptidsynthesedienst.
    2. Verdünnen Sie das Hsp90-Peptid in PBS auf 1 mg/ml Konzentration.
  2. Vorbereitung von Akzeptorperlen
    1. Die unkonjugierten Akzeptorperlen in PBS auf 1 mg/ml Konzentration verdünnen und in ein 1,5 ml Röhrchen überführen.
    2. Waschen Sie durch Zentrifugation bei 16.000 x g für 15 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
  3. Konjugation
    1. Stellen Sie das Verhältnis zwischen Perlen und Peptid auf 10:1 ein. In das 1,5-ml-Röhrchen mit 1 mg Akzeptorperlenpellet (wie oben beschrieben hergestellt) 1 ml PBS (pH 7,4), 0,1 mg verdünntes Peptid, 1,25 μL Tween-20,10 μL einer 400 mM-Lösung von Natriumcyanoborohydrid (NaBH3 CN) in Wasser geben.
      ACHTUNG: NaBH3CN ist giftig; Verwenden Sie eine Abzugshaube und Handschuhe. NaBH3CN Lösung sollte frisch zubereitet werden.
    2. 24 h bei 37 °C mit End-over-End-Rührung (10-20 U/min) auf einem Rotationsschüttler inkubieren.
  4. Reaktionsabschreckung und Perlenwäsche
    1. 20 μL 1 M Tris-HCl (pH 8,0) Lösung werden der Reaktion hinzugefügt, um nicht umgesetzte Stellen zu blockieren. 1 h bei 37 °C inkubieren.
    2. Zentrifuge bei 16.000 x g (oder Höchstgeschwindigkeit) für 15 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Perlenpellet in 1 ml Tris-HCl-Lösung (100 mM, pH 8,0).
    3. Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal.
    4. Nach der letzten Zentrifugation die Perlen bei 1 mg/ml im Speicherpuffer (1 ml 0,5 × PBS mit 0,01% Natriumazid als Konservierungsmittel) wieder auffüllen. Lagern Sie die konjugierte Akzeptorperlenlösung bei 4 °C lichtgeschützt.
      ACHTUNG: Natriumazid ist giftig; Verwenden Sie eine Abzugshaube und Handschuhe.

3. Der Assay, der die Wechselwirkung zwischen GST-FKBP51 oder GST-FKBP52 und Hsp90 C-terminales Peptid und Hemmung mit Verbindungen mit kleiner Molekülmasse untersucht (Abbildung 2C)

  1. GST-markierte Proteine, die mit Glutathion-Spenderperlen interagieren
    1. Richten Sie die Reaktionen in 384-Well-Platten ein.
    2. Bereiten Sie die Lösung mit 10 μg/ml der Glutathionspenderperlen in 0,5x PBS, pH 7,4 vor.
      HINWEIS: Nach längerer Lagerung setzen sich die Perlen ab und müssen vorgetexed werden.
    3. GST-FKBP51 oder GST-FKBP52 wird zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml hinzugefügt.
    4. Im Dunkeln bei 25 °C 10 min inkubieren.
      HINWEIS: In diesem Schritt interagieren GST-markierte Proteine mit Glutathion, das an die Perlen gebunden ist. Für jede Vertiefung werden 22,5 μL dieser Mischung verwendet. Die Konzentration der Bindungspartner muss empirisch bestimmt werden. Titrieren Sie GST-FKBP51 und GST-FKBP52 und wählen Sie die Konzentration, die das beste Signal liefert.
  2. Zusammengesetzte Zugabe
    1. Machen Sie serielle Verdünnungen von Testverbindungen in DMSO.
      HINWEIS: Die verwendeten Konzentrationen betragen typischerweise 10, 30, 100, 300, 1.000 und 3.000 μM.
    2. Fügen Sie 0,25 μL DMSO (Negativkontrolle) oder Hsp90 C-terminales Peptid (Positivkontrolle, 30 μM) oder Verbindungen in DMSO in die Ecke jeder Vertiefung der Platte hinzu. Verwenden Sie Triplikate für jede Verbindungskonzentration.
    3. Fügen Sie 22,5 μL der Lösung, die Glutathion-Spenderperlen mit GST-markierten Proteinen enthält, zu jeder Vertiefung hinzu.
    4. Schütteln Sie den Teller vorsichtig mit der Hand, aber gründlich. Im Dunkeln bei 25 °C 15 min inkubieren.
      HINWEIS: Während dieser Zeit interagieren Verbindungen mit der TPR-Domäne an der Hsp90 C-terminalen Peptidbindungsstelle.
  3. Akzeptorperlenzusatz
    1. Verdünnen Sie die Akzeptorperlen mit angehängtem Hsp90 C-terminalem Peptid auf 100 μg/ml in 0,5x PBS.
    2. Fügen Sie 2,25 μL verdünnte Akzeptorperlen zu jeder Vertiefung hinzu.
    3. Sanft aber gründlich mischen. Im Dunkeln bei 25 °C 15 min inkubieren.
      HINWEIS: In diesem Schritt werden Spender- und Akzeptorperlen durch die Protein-Peptid-Interaktionen in die Nähe gebracht. Das Endvolumen des Reaktionsgemisches beträgt 25 μL. Daher liegen die Endkonzentrationen der Verbindungen zwischen 0,1 und 30 μM.
  4. Plattenlesung
    HINWEIS: Lesen Sie die Platte mit einem Plattenleser, der im entsprechenden Modus eingestellt ist.
    1. Schalten Sie das Instrument ein und öffnen Sie die Software
    2. Wählen Sie das entsprechende Protokoll aus.
    3. Klicken Sie auf Plattenkarte bearbeiten und wählen Sie das in der Platte verwendete Bohrmittel für die Messung aus.
    4. Klicken Sie auf Weiter, um fortzufahren, und führen Sie das ausgewählte Protokoll aus.
    5. Klicken Sie nach der Messung auf Ergebnisse anzeigen, um die Ergebnisse anzuzeigen.
    6. Exportieren Sie die Daten.

4. Datenanalyse

  1. Z-Faktor und Signal-Hintergrund-Verhältnis (S/B)
    1. Berechnen Sie den Z'-Faktor und das S/B-Verhältnis für den Assay mit der folgenden Gleichung:
      Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│16
      S/B=μneg/μpos
      wobei σ und μ die Standardabweichungen und Mittelwerte der positiven (Hsp90 C-terminales Peptid, 30 μM) bzw. negativen (DMSO) Kontrollen darstellen. Ein Z'-Faktor > 0,5 stellt sicher, dass der Assay robust genug für das Screening ist. Zur Überwachung der Assay-Sensitivität wurde auch das S/B-Verhältnis berechnet.
  2. Dosis-Wirkungs-Kurve und IC 50
    HINWEIS: Verwenden Sie die nichtlineare Regressionsanalyse, um die Daten von Hsp90-Cochaperon-PPI-Inhibitoren per Software anzupassen.
    1. Erstellen Sie eine XY-Datentabelle im Begrüßungsdialogfeld, und wählen Sie X-Zahlenaus, und Y Geben Sie 3 ein (wenn tripliziert), replizieren Sie Werte in nebeneinander gelegenen Spalten.
    2. Normalisieren Sie die Signaldaten der Proben in die negative Kontrollgruppe. Importieren Sie Konzentrationswerte in die Spalte X und die Signalwerte in die Spalte Y.
    3. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie unter | transformieren die Option Konzentration transformieren (X) Normalisieren. Wählen Sie Transform to Logarithms.
      HINWEIS: Dadurch wird die Konzentration in eine Protokollskala transformiert. Wenn Ihre Anfangskonzentration Null ist, setzen Sie sie auf eine sehr kleine Zahl, die effektiv Null ist (z. B. 0,1 nM), um diese Werte nicht zu verlieren, da der Logarithmus von Null nicht definiert ist.
    4. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie Unter XY-Analysendie Option Nichtlineare Regression (Kurvenpassung), öffnen Sie die Dosis-Wirkungs-Hemmung und wählen Sie Log(Inhibitor) vs. Response -- Variable Steigung.
    5. Klicken Sie auf OK, um die Ergebnisse (mit ic50-Wert) und die Diagrammeanzuzeigen.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung dieses Protokolls. (A) Ausdruck und Reinigung von GST-FKBP51 und GST-FKBP52. (B) Kopplung des Hsp90 C-terminalen Peptids an die Akzeptorperlen. (C) Der Assay, der die Wechselwirkung zwischen GST-FKBP51 oder GST-FKBP52 und Hsp90 C-terminales Peptid untersucht. Hemmung mit Verbindungen mit geringer Molekülmasse. Erstellt mit BioRender.com Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In unserem Assay liegen der Z-Faktor und das S/B-Verhältnis bei 0,82 bzw. 13,35 (Abbildung 3A), was zeigt, dass unser Assay robust und zuverlässig für das Hochdurchsatz-Screening ist. Wir haben es dann verwendet, um Verbindungen mit kleiner molekularer Masse zu screenen. Abbildung 3B zeigt die dosisabhängige Hemmung von Chaperon-Cochaperon-Wechselwirkungen mit einem ausgewählten kleinen Molekül (D10). Die Dosis-Wirkungs-Kurven für D10 werden durch nichtlineare R...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir ein Protokoll mit dem Assay zum Screening kleiner Moleküle, die Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und TPR-Motiv-Co-Chaperonen, insbesondere FKBP51 und FKBP52, hemmen. Sein hoher Z'-Wert (>0,8) zeigt die Robustheit und Zuverlässigkeit für ein Format mit hohem Durchsatz. Ergebnisse können innerhalb einer Stunde erzielt werden, und kleine Mengen an Perlen, Protein und Verbindungen sind erforderlich. Darüber hinaus könnte dieses Protokoll leicht auf alle Hsp90 / Hsp70 - TPR-Motiv-Co-Chaperon-Interaktionen ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Schwedischen Forschungsrats (2018-02843), der Brain Foundation (Fo 2019-0140), der Foundation for Geriatric Diseases am Karolinska Institutet, der Gunvor and Josef Anérs Foundation, der Magnus Bergvalls Foundation, der Gun and Bertil Stohnes Foundation, der Tore Nilssons Foundation for Medical Research, der Margaretha af Ugglas Foundation und der Foundation for Old Servants unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
384-Well-PlattenPerkin Elmer6008350Assay-Volumen 25 ml
Amicon 10.000 MWCO ZentrifugationseinheitMilliporeUFC901008Konzentrat Protein
AmpicillinSigmaA0166Antibiotika
Bakterienschüttler Unimax 1010HeidolphKulturbakterien
cDNA-Klone für den Menschen FKBP51Quelle BioScienceKlon-ID: 5723416pCMV-SPORT6-Vektor
cDNA-Klone für den Menschen FKBP52QuelleBioScience-Klon-ID: 7474554pCMV-SPORT6-Vektor
Chemisch kompetent E. coliInvitrogenC602003One Shot BL21 Star (DE3)
Datenanalyse-SoftwareGraphPad Prism9.0.0Analysedaten und -zahlen
Datenanalyse-SoftwareExcelAnalysedaten
DMSOSupelco1.02952.1000Verdünnte Verbindungen
DPBSGibco14190-144Lösung vorbereiten
EDTACalbiochem344504Proteolyse während der Beschallung verhindern
GlutathionSigmaG-4251Eluieren GST-markierte Proteine
Glutathion-DonorkügelchenPerkin Elmer6765300Donorkügelchen
GST-FallensäuleCytiva (GE Healthcare)17528201Aufreinigung GST-markierter Proteine
Isopropyl-β-D-ThiogalactosidThermo Fisher ScientificR0392Induktion der Proteinexpression
LB Broth (Miller)SigmaL3522Mikrobielles Wachstumsmedium
PCR-GerätBIO-RADS1000 ThermocyclerAmplifikation/PCR
PD-10-SäuleCytiva (GE Healthcare)17085101Lösungsaustausch
pGEX-6P-1 VektorCytiva (GE Healthcare)28954648Plasmid
pGEX-6P-2 VektorCytiva (GE Healthcare)28954650Plasmid
Plate ReaderPerkinElmer EnSpire 2300 Multilabel ReaderRead alpha
plate Plate Reader SoftwarePerkin ElmerEnSpire ManagerSoftware für Plattenleser
Softwareprotokoll für PlattenleserPerkin ElmerAlpha 384-well Geringes VolumenVerwenden Sie dieses Protokoll zum Lesen von Platten
PMSFSigmaP7626Verhindern Sie die Proteolyse während der Beschallung
Proteaseinhibitor-CocktailSigmaS8830Verhindern Sie die Proteolyse während der Beschallung
NatriumazidSigmaS2002Als Konservierungsmittel
Natriumcyanoborohydrid (NaBH3CN)Sigma156159Aktiviert die Matrix für die Kopplung
Zehn-Aminosäure-Peptids NH2-EDASRMEEVD-COOH, das den Aminosäuren 714-724 der humanen Hsp90-Beta-IsoformPeptid 2.0 incentspricht: Synthetisiert das Hsp90 C-terminale Peptid
Reagenzglas-RotatorLABINCOFührt zu Ende-über-Ende-Rührung
Tris-HClSigma10708976001Blockieren Sie nicht umgesetzte Stellen von Akzeptorkügelchen
Tween-20SigmaP1379Verhindern Sie die Aggregation von Kügelchen
Ultra-Zentrifuge Avanti J-20 XPBeckman-Coulter-Zentrifugezur Gewinnung von Bakterienzellpellets
Ultraschall-ZelldisruptorMicrosonUltraschallzellen beschallen, um Protein freizusetzen
Unkonjugierte AkzeptorkügelchenPerkin Elmer6762003Akzeptor beads
XCell SureLock Mini-Cell und XCell II Blot ModulInvitrogenEI0002SDS-PAGE
des . :

References

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