Methodenartikel

Thrombozyten-abgeleitete extrazelluläre Vesikelfunktionalisierung von Ti-Implantaten

DOI:

10.3791/62781

⸱

5. August 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB), 4Department of Fundamental Biology and Health Sciences, University of the Balearic Islands

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir eine Methode zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) vor, die von den Thrombozytenlysaten (PL) abgeleitet sind, und deren Verwendung zur Beschichtung von Titan (Ti) Implantatoberflächen. Wir beschreiben das Drop-Casting-Beschichtungsverfahren, das EVs-Freisetzungsprofil von den Oberflächen und die In-vitro-Biokompatibilität von EVs beschichteten Ti-Oberflächen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind biologische Nanovesikel, die eine Schlüsselrolle in der Zellkommunikation spielen. Ihr Inhalt umfasst aktive Biomoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren, die ein großes Potenzial in der regenerativen Medizin darstellen. In jüngerer Zeit haben EVs, die von Thrombozytenlysat (PL) abgeleitet wurden, eine osteogene Fähigkeit gezeigt, die mit PL vergleichbar ist. Außerdem werden Biomaterialien häufig in der Orthopädie oder Zahnrestauration eingesetzt. Hier stellen wir eine Methode zur Funktionalisierung von Ti-Oberflächen mit PL-abgeleiteten EVs zur Verfügung, um ihre osteogenen Eigenschaften zu verbessern.

EVs werden durch Größenausschlusschromatographie von PL isoliert, und anschließend werden Ti-Oberflächen mit PL-EVs durch Drop-Casting funktionalisiert. Die Funktionalisierung wird durch die Freisetzung von EVs und ihre Biokompatibilität durch den Laktatdehydrogenase (LDH) -Freisetzungsassay nachgewiesen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EVs sind Membranvesikel (30-200 nm), die von jeder Zelle sezerniert werden und eine Schlüsselrolle in der Zell-zu-Zell-Kommunikation spielen, indem sie ihre Fracht liefern. Sie enthalten eine Vielzahl von aktiven Biomolekülen, die Nukleinsäuren, Wachstumsfaktoren oder bioaktive Lipide enthalten können1. Aus diesen Gründen wurden EVs auf ihren potenziellen Einsatz in Therapeutika hin untersucht. In Bezug auf Orthopädie und Knochenregeneration wurden EVs aus verschiedenen Quellen getestet. Unter ihnen wurde gezeigt, dass Thrombozyten-abgeleitete EVs einen Differenzierungseffekt auf Stammzellen induzieren und gleichzeitig ein niedriges zytotoxisches Profil beibehalten2,3. Daher ist weitere Forschung erforderlich, um die Möglichkeit der Kombination von Elektrofahrzeugen mit Biomaterialien zu untersuchen, um sie in der täglichen klinischen Praxis zu verwenden.

Biomaterialien auf Titanbasis werden aufgrund ihrer mechanischen Eigenschaften, ihrer hohen Biokompatibilität und ihrer langfristigen Haltbarkeit häufig als Gerüste für klinische Eingriffe zur Knochenheilung eingesetzt4. Dennoch sind Ti-Implantate ein bioinertes Material und weisen daher eine schlechte Bindungsfähigkeit mit dem umgebenden Knochengewebe auf5. Aus diesem Grund werden Titanmodifikationen untersucht, um ihre Leistung zu verbessern, indem eine funktionellere Mikroumgebung auf ihrer Oberfläche erreicht wird4,6,7. In diesem Sinne können EVs durch chemische8 oder physikalische Wechselwirkungen an Titan verankert werden9,10. Immobilisierte EVs, die aus Stammzellen oder Makrophagen gewonnen werden, verbessern die Bioaktivität von Ti, indem sie die zelluläre Adhäsion und Proliferation fördern und dadurch eine osteogene Wirkung hervorrufen8,9,10.

Dieser Artikel konzentriert sich im Detail auf eine Tropfengussstrategie für die Beschichtung von Ti-Oberflächen mit PL-abgeleiteten Elektrofahrzeugen. Darüber hinaus werden wir das Freisetzungsprofil von Elektrofahrzeugen von der beschichteten Oberfläche im Laufe der Zeit bewerten und seine zelluläre Biokompatibilität in vitro bestätigen.

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Protokoll

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Thrombozytenlysat (PL) wird wie zuvor beschrieben in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien3 unter Verwendung von frischen Büffelmänteln gewonnen, die von der IdISBa Biobank als Ausgangsmaterial zur Verfügung gestellt werden. Ihre Verwendung für das aktuelle Projekt wurde von ihrer Ethikkommission genehmigt (IB 1995/12 BIO).

1. EVs Isolierung von PL

  1. Entfernung größerer Körper
    1. PL bei Raumtemperatur auftauen.
    2. Zentrifuge PL bei 1.500 x g für 15 min bei 4 °C. Entsorgen Sie das Pellet, da es Zellablagerungen enthält.
    3. Sammeln Sie den Überstand und führen Sie zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C durch.
      HINWEIS: Das Pellet entspricht größeren Elektrofahrzeugen wie Mikrovesikeln und wird in diesem Fall verworfen.
    4. Filtern Sie den Überstand zuerst durch 0,8 μm poröse Membran und dann durch 0,2 μm poröse Membran.
      HINWEIS: Mit diesen Schritten werden alle nicht gewünschten EVs entfernt.
    5. Den gefilterten PL in einem Pool auffüllen und bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.
  2. Größenausschlusschromatographie
    1. Die an Chromatographiegeräte gekoppelte Säule wird mit der gewünschten Durchflussrate mit gefiltertem PBS ausgeglichen.
      ANMERKUNG: Der verwendete Durchfluss hängt von den Spalteneigenschaften ab. in diesem Fall wird sie auf 0,5 ml/min eingestellt.
    2. Laden Sie das verarbeitete PL (5 ml) mit einer Spritze auf das Gerät.
    3. Injizieren Sie das PL in die Säule und beginnen Sie, 5 ml Fraktionen in 15 ml Röhrchen zu sammeln.
    4. Sammeln Sie die mit Elektrofahrzeugen angereicherten Fraktionen und lagern Sie sie bis zum Gebrauch bei -80 °C.
      HINWEIS: Wenn Sie das Experiment zum ersten Mal durchführen, charakterisieren Sie alle Fraktionen durch Proteinquantifizierung und Immundetektion, um diejenige zu bestimmen, die mit EVs angereichert ist3,11. In diesem Experiment wird die 9. Fraktion gesammelt.
    5. Waschen Sie die chromatographische Säule mit 30 ml 0,2% iger NaOH-Lösung und lagern Sie sie in 20% iger Ethanollösung, sobald sie das Gleichgewicht erreicht hat.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) durch Thrombozytenlysat (PL). PL wird zuerst bei 1.500 x g und dann bei 10.000 x g zentrifugiert, um größere Körper zu entfernen. Der Überstand wird durch 0,8- und 0,2-μm-Filter filtriert. Verarbeitetes PL wird auf die Säule geladen, und EVs werden durch Größenausschlusschromatographie getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Charakterisierung von Elektrofahrzeugen

HINWEIS: Die Charakterisierung von Elektrofahrzeugen ist notwendig, um funktionelle Studien durchzuführen12. Über Elektronenmikroskopie oder Western-Blot-Charakterisierung wurde bereits berichtet13. Dieser Bericht konzentriert sich auf die wesentlichen Charakterisierungstechniken für die Ti-Oberflächenfunktionalisierung.

  1. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
    1. Verdünnen Sie die EVs (1:1000) in 0,2 μm gefiltertem PBS.
      HINWEIS: Zu konzentrierte Proben oder zu verdünnte Proben liegen außerhalb des Bereichs für die NTA-Bestimmung, und es ist eine Anpassung erforderlich.
    2. Laden Sie 1 ml der verdünnten EVs mit einer Spritze auf die NTA-Ausrüstung und injizieren Sie sie in die NTA-Ausrüstung.
    3. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers zur Bestimmung der Partikelkonzentration und der Größenverteilung.
  2. Proteinkonzentration
    1. Bestimmen Sie die Konzentration mit 1 μL der EVs-Lösung. Messen Sie die Absorption mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 280 nm.
      HINWEIS: EVs sollten im Vergleich zur Anzahl der Partikel einen geringen Proteingehalt aufweisen.
    2. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um den Absorptionswert mit dem Spektralphotometer zu erhalten.

3. Titan-Oberflächenfunktionalisierung

HINWEIS: Bei diesem Verfahren werden bearbeitete Titanscheiben, c.p. Grad IV, 6,2 mm Durchmesser und 2 mm Höhe, verwendet. Die Scheiben können mit einer Ti-Pinzette manipuliert werden, aber es ist wichtig, nicht an der Oberfläche zu kratzen. Darüber hinaus muss die bearbeitete Seite während des gesamten Prozesses nach oben zeigen.

  1. Ti Discs waschen
    HINWEIS: Das Volumen der für das Ti-Waschen verwendeten Lösungen sollte ausreichen, um Ti-Platten abzudecken. Legen Sie Ti-Scheiben in ein Glasbecherglas und gießen Sie Lösungen darauf. Entfernen Sie dann die Lösung durch Dekantieren.
    1. Waschen Sie Ti-Implantate mit entionisiertem (DI) Wasser und entsorgen Sie dann das Wasser.
    2. Waschen Sie Ti-Implantate mit Ethanol 70% und dekantieren Sie dann, um die Lösung zu entfernen.
    3. Setzen Sie die Implantate in DI-Wasser und beschallen Sie sie bei 50 °C für 5 min. Entsorgen Sie das Wasser.
    4. Inkubieren Sie Ti-Implantate in einer 40% igen NaOH-Lösung bei 50 °C für 10 min unter Rühren. Verwerfen Sie die Lösung.
      ACHTUNG: NaOH-Lösung erwärmt sich während der Zubereitung. Die Lösung ist korrosiv und sollte in einem Abzug verwendet werden.
    5. Beschallen Sie die Implantate in DI-Wasser bei 50 °C für 5 min und entfernen Sie dann das Wasser.
    6. Führen Sie mehrere Wäschen mit DI-Wasser (mindestens 5) durch, bis der neutrale pH-Wert erreicht ist. Überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Indikatoren.
    7. Die Implantate in DI-Wasser bei 50 °C für 5 min beschallen und das Wasser entfernen.
    8. Inkubieren Sie Ti-Implantate in einer 50% igen HNO3-Lösung bei 50 °C für 10 min unter Rühren. Entfernen Sie die Lösung.
      VORSICHT: HNO3 ist eine korrosive und oxidierende Substanz und sollte in einem Abzug verwendet werden.
    9. Beschallung der Implantate in DI-Wasser bei 50 °C für 5 min. Entfernen Sie das Wasser.
    10. Führen Sie mehrere Wäschen mit DI-Wasser (mindestens 5) durch, bis ein neutraler pH-Wert erreicht ist. Überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Indikatoren.
    11. Beschallung der Implantate in DI-Wasser bei 50 °C für 5 min. Entfernen Sie das Wasser.
      HINWEIS: An diesem Punkt kann das Experiment gestoppt werden, indem Ti-Implantate in einer 70% igen Ethanollösung gelagert werden.
  2. Ti Passivierung
    HINWEIS: Ti-Passivierungsschritte werden durchgeführt, indem Ti-Discs vollständig mit den verschiedenen Lösungen in der unten aufgeführten Reihenfolge abgedeckt werden. Ti-Scheiben werden in ein Glasbecherglas gelegt und Lösungen werden sanft auf sie gegossen. Die in allen Waschschritten verwendeten Volumina müssen die Implantate vollständig bedecken und werden durch Dekantieren entfernt.
    1. Inkubieren Sie die Ti-Implantate in einer 30% HNO3-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur unter sanfter Bewegung. Entfernen Sie die Lösung.
    2. Führen Sie mehrere Wäschen mit DI-Wasser (mindestens 5) durch, bis der neutrale pH-Wert erreicht ist. Überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Indikatoren.
    3. Inkubieren Sie Ti-Implantate über Nacht bei Raumtemperatur in DI-Wasser.
    4. Trocknen Sie die Implantate unter Vakuumbedingungen bei 40 °C für 10 min ab.
  3. EVs Drop Casting
    HINWEIS: Für Zellfunktionsstudien ist es wichtig, in einem Zellkulturschrank zu arbeiten.
    1. Legen Sie die Ti-Implantate in eine 96-Well-Platte, wobei die bearbeitete Seite nach oben zeigt.
      HINWEIS: Wenn die Implantate auf den Kopf gestellt werden, kann eine Nadel verwendet werden, um sie zurückzusetzen.
    2. Tauen Sie die EVs-Lösung auf und mischen Sie sie mit Rührung. Verwenden Sie einen Wirbel, um für 3 s zu pulsieren.
    3. Legen Sie die EVs auf der Ti-Oberfläche ab. In dieser Studie werden Tropfen von 40 μL EVs-Lösung auf das Ti gegeben, um maximal 4 x 1011 EVs pro Implantat entsprechend der durch NTA bestimmten Konzentration zu immobilisieren.
    4. Stellen Sie die Platten mit dem Ti unter Vakuumbedingungen bei 37 °C auf, bis die Tropfen vollständig trocken sind (~2 h).
      HINWEIS: Stellen Sie die Zeit in Abhängigkeit von der Anzahl der Implantate und dem in der Vakuumkammer vorhandenen Wasser ein.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung der Ti-Passivierung und der Funktionalisierung von Elektrofahrzeugen durch Tropfenguss. Ti-Implantate werden zunächst durch Inkubation für 30 min in einer 30% igen HNO3-Lösung bei Raumtemperatur passiviert. Nach mehreren Wäschen mit DI-Wasser erreicht der pH-Wert neutral. Dann werden Ti-Implantate über Nacht bei Raumtemperatur in DI-Wasser inkubiert. Danach werden die Implantate unter Vakuumbedingungen bei 40 °C abgetrocknet. Für die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen werden 40 μL EVs-Lösung auf Ti-Implantate aufgefüllt. Als nächstes werden Implantate im Vakuum für 2 h inkubiert, bis EVs physisch an die Oberfläche gebunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Ti-Oberflächencharakterisierung

  1. Release-Studie
    1. Inkubieren Sie die Ti-Oberfläche mit 200 μL gefiltertem PBS bei 37 °C.
      HINWEIS: PBS wird gefiltert, um Interferenzen mit der NTA-Messung zu vermeiden.
    2. Ersetzen Sie den PBS zu verschiedenen Zeitpunkten und lagern Sie ihn bei -80 °C.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden 2-, 6-, 10- und 14-Tage-Zeitpunkte analysiert.
    3. Analysieren Sie gespeichertes PBS für Partikelstudien durch NTA gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: Die Partikelkonzentration in PBS zu verschiedenen Zeiten ist eine Darstellung des Freisetzungsprofils von Elektrofahrzeugen im Laufe der Zeit.
  2. Biokompatibilitätsstudien
    HINWEIS: Menschliche nabelschnurgeleitete mesenchymale Stammzellen (hUC-MSC) werden aus der IdISBa Biobank in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien gewonnen.
    1. Halten Sie hUC-MSC in DMEM niedriger Glukose, ergänzt mit 20% FBS bis zur Verwendung. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche.
    2. Für die Zellaussaat waschen Sie die Zellen zweimal in Kolben mit 5 ml PBS.
    3. Trypsinisieren Sie hUC-MSC, indem Sie 1 ml Trypsinlösung hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass es die Monoschicht der Zellen vollständig bedeckt. Die Trypsinlösung wird entfernt und der Zellkulturkolben bei 37 °C für ca. 2 min aufgestellt. Sehen Sie sich die Zellablösung unter dem Mikroskop an. Abgelöste Zellen erscheinen rund in der Form und sind in Suspension.
    4. Resuspend Zellen in DMEM niedrige Glukose mit 1% EVs erschöpften FBS.
      HINWEIS: Bereiten Sie Medien vor, die mit 1% FBS ergänzt wurden, und zentrifugieren Sie dann 18 h lang bei 120.000 x g , um FBS-EVs zu entfernen. Es ist wichtig, Elektrofahrzeuge zu entfernen, um Interferenzen mit Thrombozyten-Elektrofahrzeugen zu vermeiden.
    5. Bestimmen Sie die Zellkonzentration, indem Sie die Anzahl der Zellen mit einer Neubauer-Kammer zählen14.
    6. Bringen Sie hUC-MSC auf eine Konzentration von 50.000 Zellen/ ml.
    7. Säen Sie 200 μL der Zelllösung auf die Ti-Implantate.
    8. Sammeln Sie nach 48 h 50 μL Medien und führen Sie die zytotoxische Bestimmung unter Verwendung des Laktatdehydrogenase (LDH) -Aktivitätskits gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.

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Ergebnisse

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Die in diesem Artikel vorgestellte Methode ermöglicht es, funktionalisierte Titanscheiben von Elektrofahrzeugen zu erhalten. EVs sind physisch an die Oberfläche gebunden, was eine anhaltende Freisetzung im Laufe der Zeit ermöglicht. Die Anzahl der freigesetzten EVs kann durch NTA an Tag 2, 6, 10 und 14 gemessen werden. Die ersten Messungen an Tag 2 zeigen, dass rund 109 EVs freigesetzt werden, gefolgt von einer anhaltenden Freisetzung an Tag 6 (~ 108 EVs); Tag 10 (~107 EVs) und Tag 14 (~<...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll zielt darauf ab, klare Anweisungen für die Funktionalisierung von Elektrofahrzeugen auf Ti-Oberflächen bereitzustellen. Das vorgestellte Verfahren basiert auf einer Tropfengießstrategie, bei der es sich um eine Physisorptionsart der Funktionalisierung handelt. Es gibt eine schlechte Bibliographie in Bezug auf die Funktionalisierung von Elektrofahrzeugen auf Ti-Oberflächen, obwohl es nur wenige Studien gibt, die unterschiedliche Vorteile durch die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen auf

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde vom Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, kofinanziert durch den Europäischen Sozialfonds ESF und den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung EFRE (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), die Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), und PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finanziert durch die nachhaltige Tourismussteuer der Balearen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,8 &Mikro; m SpritzenfilterSartorius16592K
1,5 mL ZentrifugenröhrchenSPL life sciencesPLC60015
1mL SpritzeBD303174
96-Well-KulturplatteSPL life sciencesPLC30096
Absolut ethanolScharlauET0006005PWird zur Herstellung von 20 %  Ethanol mit Milli-Q® Wasser
AKTA verwendet ReinigerSystem GE Healthcare8149-30-0014
Allegra X-15R ZentrifugeBeckman Coutler392934SX4750A schwingender Rotor
Zentrifuge 5430 REppendorf5428000210F-45-48-11 Rotor
Konisches Röhrchen, konischer Boden, 50mlSPL Life SciencesPLC50050
Zytotoxizitätsnachweis Kit (LDH)Roche11644793001
Einwegspritzen 10 mlBecton DickinsonBDH307736
DMEM Low Glucose GlutamaxGIBCO21885025
Dulbecco's PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic CertifiedGIBCO16000044
Filtropur S 0,2 µ mSpritzenfilter Sarstedt83.1826.001
HiPrep  16/60 Sephacryl  S-400 HRGE Healthcare28-9356-04Fertigteilsäulen
mesenchymalen Stammzellen der menschlichen Nabelschnur (hUC-MSC)IdISBa Biobank
Nanodrop 2000 SpektralphotometerThermoFisherND-2000
NanoSight NS300 Nanopartikel-Tracking-AnalyseMalvernNS300Gerät mit eingebettetem Laser bei λ= 532 nm und Kamera sCMOS
NadelTerumo946077135
Salpetersäure 69,5%ScharlauAC16071000
Optima L-100 XP UltrazentrifugeBeckman Schar8043-30-1124SW-32Ti Rotor
Penicillin-Streptomycin Lösung 100XBiowestL0022
pH Teststreifen 4,5-10,0SigmaP-4536
Thrombozytenlysat (PL)IdISBa BiobankGewonnen aus  Buffy-Mänteln, die nach einer Blutspende entsorgt
Zentrifugenwannen aus PolypropylenBeckman Coutler326823
Power Wave HTBioTek10340763
Schraubverschlussröhrchen, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, mit AufdruckSarstedt62554502
NatriumhidroxidSharlauSO04251000
Repliken von TitanimplantatenImplantmedia, SANATitan Grad IV. Durchmesser: 6,2 mm. Höhe: 1,95 mm
Trypsin-EDTA 1 xBiowestL0930
Tryton X100SigmaT8787
aus wurden

Referenzen

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Platelet Derived EVsExtracellular VesiclesTitanium FunctionalizationDrop CastingSize Exclusion ChromatographyNanoparticle TrackingBone RegenerationLDH Release AssayRegenerative MedicineBiomaterial Coating

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