Hier stellen wir eine Methode zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) vor, die von den Thrombozytenlysaten (PL) abgeleitet sind, und deren Verwendung zur Beschichtung von Titan (Ti) Implantatoberflächen. Wir beschreiben das Drop-Casting-Beschichtungsverfahren, das EVs-Freisetzungsprofil von den Oberflächen und die In-vitro-Biokompatibilität von EVs beschichteten Ti-Oberflächen.
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Methodenartikel
Thrombozyten-abgeleitete extrazelluläre Vesikelfunktionalisierung von Ti-Implantaten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind biologische Nanovesikel, die eine Schlüsselrolle in der Zellkommunikation spielen. Ihr Inhalt umfasst aktive Biomoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren, die ein großes Potenzial in der regenerativen Medizin darstellen. In jüngerer Zeit haben EVs, die von Thrombozytenlysat (PL) abgeleitet wurden, eine osteogene Fähigkeit gezeigt, die mit PL vergleichbar ist. Außerdem werden Biomaterialien häufig in der Orthopädie oder Zahnrestauration eingesetzt. Hier stellen wir eine Methode zur Funktionalisierung von Ti-Oberflächen mit PL-abgeleiteten EVs zur Verfügung, um ihre osteogenen Eigenschaften zu verbessern.
EVs werden durch Größenausschlusschromatographie von PL isoliert, und anschließend werden Ti-Oberflächen mit PL-EVs durch Drop-Casting funktionalisiert. Die Funktionalisierung wird durch die Freisetzung von EVs und ihre Biokompatibilität durch den Laktatdehydrogenase (LDH) -Freisetzungsassay nachgewiesen.
Einleitung
EVs sind Membranvesikel (30-200 nm), die von jeder Zelle sezerniert werden und eine Schlüsselrolle in der Zell-zu-Zell-Kommunikation spielen, indem sie ihre Fracht liefern. Sie enthalten eine Vielzahl von aktiven Biomolekülen, die Nukleinsäuren, Wachstumsfaktoren oder bioaktive Lipide enthalten können1. Aus diesen Gründen wurden EVs auf ihren potenziellen Einsatz in Therapeutika hin untersucht. In Bezug auf Orthopädie und Knochenregeneration wurden EVs aus verschiedenen Quellen getestet. Unter ihnen wurde gezeigt, dass Thrombozyten-abgeleitete EVs einen Differenzierungseffekt auf Stammzellen induzieren und gleichzeitig ein niedriges zytotoxisch....
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Protokoll
Thrombozytenlysat (PL) wird wie zuvor beschrieben in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien3 unter Verwendung von frischen Büffelmänteln gewonnen, die von der IdISBa Biobank als Ausgangsmaterial zur Verfügung gestellt werden. Ihre Verwendung für das aktuelle Projekt wurde von ihrer Ethikkommission genehmigt (IB 1995/12 BIO).
1. EVs Isolierung von PL
- Entfernung größerer Körper
- PL bei Raumtemperatur auftauen.
- Zentrifuge PL bei 1.500 x g für 15 min bei 4 °C. Entsorgen Sie das Pellet, da es Zellablagerungen enthält.
- Sammeln Sie den Überstand und führen Sie z....
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Ergebnisse
Die in diesem Artikel vorgestellte Methode ermöglicht es, funktionalisierte Titanscheiben von Elektrofahrzeugen zu erhalten. EVs sind physisch an die Oberfläche gebunden, was eine anhaltende Freisetzung im Laufe der Zeit ermöglicht. Die Anzahl der freigesetzten EVs kann durch NTA an Tag 2, 6, 10 und 14 gemessen werden. Die ersten Messungen an Tag 2 zeigen, dass rund 109 EVs freigesetzt werden, gefolgt von einer anhaltenden Freisetzung an Tag 6 (~ 108 EVs); Tag 10 (~107 EVs) und Tag 14 (~<.......
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Diskussion
Dieses Protokoll zielt darauf ab, klare Anweisungen für die Funktionalisierung von Elektrofahrzeugen auf Ti-Oberflächen bereitzustellen. Das vorgestellte Verfahren basiert auf einer Tropfengießstrategie, bei der es sich um eine Physisorptionsart der Funktionalisierung handelt. Es gibt eine schlechte Bibliographie in Bezug auf die Funktionalisierung von Elektrofahrzeugen auf Ti-Oberflächen, obwohl es nur wenige Studien gibt, die unterschiedliche Vorteile durch die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen auf
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Diese Forschung wurde vom Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, kofinanziert durch den Europäischen Sozialfonds ESF und den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung EFRE (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), die Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), und PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finanziert durch die nachhaltige Tourismussteuer der Balearen.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,8 &Mikro; m Spritzenfilter | Sartorius | 16592K | |
| 1,5 mL Zentrifugenröhrchen | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL Spritze | BD | 303174 | |
| 96-Well-Kulturplatte | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Wird zur Herstellung von 20 % Ethanol mit Milli-Q® Wasser |
| AKTA verwendet Reiniger | System GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Zentrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A schwingender Rotor |
| Zentrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 Rotor |
| Konisches Röhrchen, konischer Boden, 50ml | SPL Life Sciences | PLC50050 | |
| Zytotoxizitätsnachweis Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Einwegspritzen 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0,2 µ m | Spritzenfilter Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Fertigteilsäulen |
| mesenchymalen Stammzellen der menschlichen Nabelschnur (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 Spektralphotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 Nanopartikel-Tracking-Analyse | Malvern | NS300 | Gerät mit eingebettetem Laser bei λ= 532 nm und Kamera sCMOS |
| Nadel | Terumo | 946077135 | |
| Salpetersäure 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultrazentrifuge | Beckman Schar | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Lösung 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Teststreifen 4,5-10,0 | Sigma | P-4536 | |
| Thrombozytenlysat (PL) | IdISBa Biobank | Gewonnen aus Buffy-Mänteln, die nach einer Blutspende entsorgt | |
| Zentrifugenwannen aus Polypropylen | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power Wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Schraubverschlussröhrchen, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, mit Aufdruck | Sarstedt | 62554502 | |
| Natriumhidroxid | Sharlau | SO04251000 | |
| Repliken von Titanimplantaten | Implantmedia, SA | NA | Titan Grad IV. Durchmesser: 6,2 mm. Höhe: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 x | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referenzen
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
