Wenn Transforming Growth Factor ß-Familie Vorläuferproteine in Xenopus laevis-Embryonen ektopisch exprimiert werden, dimerisieren, gespalten werden und in die Blastokoele sezerniert werden, die von der späten Blastula bis zur frühen Gastrula beginnt. Wir beschreiben eine Methode zum Absaugen von Spaltprodukten aus der Blastokoele-Höhle für die Immunoblot-Analyse.
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Methodenartikel
Analyse der Umwandlung von Wachstumsfaktor ß Familie Spaltungsprodukte, die in die Blastokoele von Xenopus laevis Embryonen sezerniert werden
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die beiden Arme der Transforming Growth Factor ß (Tgfß) Superfamilie, vertreten durch Tgfß/Nodal bzw. Bone Morphogenetic Protein (Bmp) Liganden, spielen eine wesentliche Rolle bei der Embryonalentwicklung und der adulten Homöostase. Mitglieder der Tgfß-Familie werden als inaktive Vorläufer hergestellt, die innerhalb des endoplasmatischen Retikulums dimerisieren und falten. Der Vorläufer wird anschließend in Liganden- und Prodomänenfragmente gespalten. Obwohl nur der Dimerligand Tgfß-Rezeptoren aktivieren und die nachgeschaltete Signalübertragung aktivieren kann, wächst die Erkenntnis, dass der Prodomänen-Anteil zur Ligandenaktivität beiträgt. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, mit dem Spaltungsprodukte identifiziert werden können, die bei der Aktivierung von Tgfß-Vorläuferproteinen entstehen. RNA-kodierende Tgfß-Vorläufer werden zunächst in X. laevis-Embryonen mikroinjektiert. Am folgenden Tag werden Spaltprodukte aus der Blastokoele von Embryonen im Gastrula-Stadium gesammelt und an Western Blots analysiert. Dieses Protokoll kann relativ schnell abgeschlossen werden, benötigt keine teuren Reagenzien und bietet eine Quelle für konzentrierte Tgfß-Spaltprodukte unter physiologischen Bedingungen.
Einleitung
Mitglieder der Superfamilie Transforming Growth Factor ß (Tgfß) werden als inaktive, dimerisierte Vorläuferproteine synthetisiert. Die Vorläufer werden dann von Mitgliedern der Proprotein-Convertase-Familie (PC) gespalten, entweder innerhalb des sekretorischen Weges oder außerhalb der Zellen. Dadurch entstehen ein aktives, disulfidgebundenes Ligandendimer und zwei Prodomänenfragmente1. Obwohl seit über 30 Jahren bekannt ist, dass die Prodomäne der Vorläufer der Tgfß-Familie benötigt wird, um einen aktiven Liganden2zu erzeugen, ist das Verständnis, wie Prodomänen zur Ligandenfunktion beitragen, unvollständig.
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Protokoll
Alle beschriebenen Verfahren sind vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Utah genehmigt. Frösche sind in einer IACUC-zugelassenen Einrichtung untergebracht. Männliche Frösche werden durch Eintauchen in Tricain eingeschläfert, indem der Ventrikel des Herzens abgeschnitten wird. Weibliche Frösche werden nach hormoneller Induktion des Laichens für maximal 24 Stunden im Labor untergebracht, um die Eizellentnahme zu ermöglichen, und dann in die Pflegeeinrichtung zurückgebracht.
1. Sammlung von X. laevis Hoden
- Betäuben Sie ein geschlechtsreifes Männchen in 0,2% Tricain (Tabelle 1
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Ergebnisse
Das unten beschriebene Ziel des Experiments war es, festzustellen, ob Bmp4 und Bmp7 Heterodimere (Dimere, die aus einem Bmp4-Liganden und einem Bmp7-Liganden bestehen), Homodimere (bestehend aus zwei Bmp4- oder zwei Bmp7-Liganden) oder eine Mischung aus jedem bilden, wenn sie in X. laevis co-exprimiert werden. Die in Abbildung 2 gezeigten Daten stammen aus einer zuvor veröffentlichten Studie10. Abbildung 2A ist ein Schema, das Sp.......
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Diskussion
Die Hauptvorteile des hier beschriebenen Protokolls sind, dass es relativ schnell abgeschlossen werden kann, keine teuren Reagenzien benötigt und unter physiologischen Bedingungen eine Quelle für konzentrierte Tgfß-Spaltprodukte bietet. Ein weiterer Vorteil ist, dass es erlaubt, epitop-markierte Proteine zu analysieren und so den Mangel an kommerziell erhältlichen Antikörpern zu umgehen, die die meisten Prodomainen der Tgfß-Familie erkennen. Obwohl es auch möglich ist, die Spaltung von epitop-markierten Tgfß-Vorläuferpro.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Wir danken Mary Sanchez für die hervorragende Tierpflege. Die Forschung der Autoren wird vom National Institute of Child Health and Human Development der National Institutes of Health (NIH / NICHD) unterstützt, die R01HD067473-08 und R21 HD102668-01 und das National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) R01DK128068-01 gewähren.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calciumchlorid | Fisher | C79-500 | |
| Calciumnitrat | Fisher | C109-500 | |
| Einweg Pellet Stößel/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 Pinzette | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Fötales Rinderserum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glaskapillare, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerin | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Menschliches Chorioninsäure Gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injektionsspritze, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cystein | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesiumsulfat | Fisher | M63-500 | |
| Nadel, 26 g | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco 15140148 | ||
| Picoliter-Mikroinjektor | Warner | Instruments PLI-100A | |
| Pipettenabzieher | Narashige | PC-100 | |
| Kaliumchlorid | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membran | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Natriumbicarbonat | Fisher | S233-500 | |
| Natriumchlorid | Fisher | S271-10 | |
| Natriumdodecylsulfat | Fisher | BP166-500 | |
| Natriumhydroxid | Fisher | S318-500 | |
| Tricain-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
Referenzen
- Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
- Gray, A. M., Mason, A. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
