Summary
Ce protocole présente une technique de cartographie à haute résolution des sites de réplication dans la chromatine structurellement préservée in situ qui utilise une combinaison de marquage pré-intégration EdU-streptavidin-Nanogold et ChromEMT.
Abstract
Les principes du repliement de l’ADN dans le noyau cellulaire et ses transformations dynamiques qui se produisent lors de l’accomplissement des fonctions génétiques de base (transcription, réplication, ségrégation, etc.) restent mal compris, en partie en raison du manque d’approches expérimentales de visualisation à haute résolution de loci de chromatine spécifiques dans des noyaux structurellement préservés. Nous présentons ici un protocole pour la visualisation des domaines réplicatifs dans la culture cellulaire monocouche in situ, en combinant le marquage EdU de l’ADN nouvellement synthétisé avec la détection ultérieure du marquage avec l’amplification Ag des particules Nanogold et la coloration ChromEM de la chromatine. Ce protocole permet l’étiquetage pré-intégration à contraste élevé et à haute efficacité, compatible avec la fixation traditionnelle du glutaraldéhyde qui offre la meilleure conservation structurelle de la chromatine pour le traitement des échantillons à température ambiante. Un autre avantage de l’étiquetage de pré-intégration est la possibilité de présélectionner les cellules d’intérêt pour la section. Ceci est particulièrement important pour l’analyse de populations cellulaires hétérogènes, ainsi que pour la compatibilité avec les approches de tomographie électronique pour l’analyse 3D à haute résolution de l’organisation de la chromatine sur les sites de réplication, et l’analyse du réarrangement post-réplicatif de la chromatine et de la ségrégation des chromatides sœurs dans l’interphase.
Introduction
La réplication de l’ADN est un processus biologique de base requis pour la copie fidèle et la transmission de l’information génétique pendant la division cellulaire. Chez les eucaryotes supérieurs, la réplication de l’ADN est soumise à une régulation spatio-temporelle étroite, qui se manifeste par une activation séquentielle des origines de la réplication1. Les origines de réplication voisines tirant de manière synchrone forment des groupes de replicons2. Au niveau de la microscopie optique, les sites de réplication continue de l’ADN sont détectés comme des foyers de réplication de nombre et de taille variés. Les foyers de réplication présentent des modèles spécifiques de distribution spatiale dans le noyau cellulaire en fonction du moment de la réplication de l’ADN marqué 3,4, qui, à son tour, est étroitement corrélé avec son activité génique. Grâce à une séquence bien définie de réplication de l’ADN, strictement ordonnée dans l’espace et le temps, le marquage réplicatif est une méthode puissante de marquage précis de l’ADN non seulement pour l’étude du processus de réplication en soi, mais aussi pour discriminer une sous-fraction spécifique de l’ADN avec une activité de transcription et un niveau de compactage définis. La visualisation de la chromatine répliquante est généralement réalisée par la détection des principaux composants protéiques de la machinerie de réplication de l’ADN (soit par immunocoloration, soit par expression de marqueurs de protéines fluorescentes 5,6) ou par l’incorporation de précurseurs modifiés de synthèse de l’ADN 7,8,9,10 . Parmi celles-ci, seules les méthodes basées sur l’incorporation de nucléotides modifiés dans l’ADN nouvellement répliqué permettent de capturer les changements conformationnels de la chromatine pendant la réplication et de retracer le comportement des domaines réplicatifs une fois leur réplication terminée.
Chez les eucaryotes supérieurs, l’emballage de l’ADN en chromatine ajoute un autre niveau de complexité à la régulation des fonctions génétiques de base (transcription, réplication, réparation, etc.). Le repliement de la chromatine affecte l’accessibilité de l’ADN aux transfacteurs régulateurs et aux changements conformationnels de l’ADN (dénouement en double hélice) nécessaires à la synthèse du gabarit. Par conséquent, il est généralement admis que les processus synthétiques dépendants de l’ADN dans le noyau cellulaire nécessitent une transition structurelle de la chromatine de son état condensé et répressif vers une conformation plus accessible et ouverte. Cytologiquement, ces deux états de chromatine sont définis comme l’hétérochromatine et l’euchromatine. Cependant, il n’y a toujours pas de consensus concernant le mode de repliement de l’ADN dans le noyau. Les hypothèses vont d’un modèle de « polymère fondu »11, où la fibre nucléosomique se comporte comme un polymère aléatoire pour lequel la densité d’emballage est contrôlée par des mécanismes de séparation de phase, à des modèles de pliage hiérarchique postulant la formation séquentielle de structures ressemblant à des fibres de chromatine d’épaisseur croissante12,13. Les modèles de repliement hiérarchique ont récemment été soutenus par des approches moléculaires basées sur l’analyse des contacts ADN-ADN in situ (capture de conformation chromosomique, 3C), démontrant l’existence de la hiérarchie des domaines structurels de la chromatine14. Il est important de noter que les unités de réplication sont très bien corrélées à ces domaines de la chromatine15. La principale critique de ces modèles est basée sur l’agrégation potentielle de la chromatine artificielle causée par les procédures de préparation des échantillons, telles que la perméabilisation des membranes cellulaires et l’élimination des composants non chromatines, afin d’améliorer le contraste de la chromatine pour les études ultrastructurales tout en améliorant l’accessibilité de la chromatine pour diverses sondes (par exemple, les anticorps). Les progrès techniques récents dans la coloration sélective de l’ADN pour la microscopie électronique par photo-oxydation de la diaminobenzidine médiée par fluorophore liant l’ADN (ChromEMT6) ont permis d’éliminer cet obstacle. Cependant, les mêmes considérations sont vraies pour la visualisation par microscopie électronique de l’ADNrépliqué 17,18. Nous décrivons ici une technique qui permet la cartographie ultrastructurale simultanée à haute résolution de l’ADN nouvellement synthétisé et de la chromatine totale dans des cellules réticulées au aldéhyde intactes. La technique combine la détection de l’ADN marqué EdU par Click-chemistry avec des sondes biotinylées et streptavidin-Nanogold, et ChromEMT.
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Protocol
Le protocole est optimisé pour les cellules adhérentes et a été testé sur les lignées cellulaires HeLa, HT1080 et CHO.
1. Étiquetage et fixation des cellules
- Cellules de plaque sur des couvercles nettoyés à l’acide dans une boîte de Petri de 3 cm. Cultiver les cellules dans le milieu recommandé pour la lignée cellulaire utilisée à 70% de confluence.
- Ajouter l’EdU (5-éthyynyl-2'-désoxyuridine) à partir de 10 mM de stock jusqu’à la concentration finale de 10 μM et placer les cellules dans l’incubateur pendant 10 min ou plus (selon l’objectif de l’expérience). Pour des impulsions plus courtes (jusqu’à 2 min), préparez une boîte de Petri avec des milieux de culture frais préchauffés complétés par 10 μM d’EdU et transférez-y des couvercles, plutôt que d’ajouter directement de l’EdU aux cellules.
REMARQUE: Toutes les étapes suivantes sont effectuées à température ambiante sauf indication contraire. - Fixer les cellules marquées avec 2,5% de glutaraldéhyde, fraîchement fabriqué en diluant 25% du bouillon dans un tampon cacodylate de 100 mM, pendant 1 h.
REMARQUE: Les étapes de détection EdU suivantes sont sensibles au moment de la fixation. Des temps de fixation plus longs peuvent nuire à l’étiquetage EdU, entraînant un rapport signal/bruit plus faible. - Éliminer le glutaraldéhyde en lavant les échantillons avec du PBS complété par 5 mM MgCl2 (PBS* par la suite). Laver trois fois avec une incubation de 10 minutes pour chaque lavage.
- Perméabiliser les membranes plasmiques avec 1 % de Triton X-100 dans pbS* (PBS*T par la suite). Laver deux fois avec une incubation de 5 minutes pour chaque lavage.
- Lavez abondamment l’échantillon avec PBS*. Effectuez cinq changements et incubez pendant 5 minutes dans chaque changement.
- Trempez les groupes aldéhydes sans résidus avec 20 mM de glycine dans du PBS*, deux fois pendant 10 min chacun.
- Bloquer les échantillons dans 1% de BSA dans PBS* pendant 30 min.
2. Cliquez-réaction
REMARQUE : Cette procédure est modifiée à partir d’un protocole19 publié précédemment.
- Immédiatement avant utilisation, préparer le mélange Click-reaction pour la détection de l’EdU : dans un tube de microcentrifugation, mélanger 430 μL de 100 mM de Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL de 100 mM CuSO4, 1,2 μL de biotine-azoture (10 mM dans le DMSO) et 50 μL d’acide ascorbique 0,5 M. Pour le contrôle de la qualité de l’étiquetage réplicatif et de la procédure Click au niveau de la microscopie fluorescente, l’azoture de biotine peut être remplacé par l’azoture AlexaFluor 488.
REMARQUE: L’ordre d’addition des composants dans la réaction ci-dessus est important. - Effectuez une réaction par clic dans une chambre humide pour minimiser l’évaporation et les changements de concentration dans le cocktail de réaction. Préparez la chambre humide en plaçant une feuille de papier filtre humide sur le fond de la boîte de Pétri et en la recouvrant d’un film de paraffine. Placez les couvercles sur la surface du film avec les cellules tournées vers le haut et superposez 50 à 100 μL du cocktail de réaction sur le couvercle. La réaction prend 30 min à température ambiante.
- Arrêtez la réaction en lavant l’échantillon dans 0,1 % de Triton X-100 dans pbS* (PBS*T), cinq fois pendant 5 min chacun.
- Bloquer 1% BSA dans PBS*T pendant 30 min à température ambiante.
- Préparer la solution de streptavidine-Nanogold avec du PBS*T contenant 1 % de BSA. Incuber l’échantillon avec de la streptavidine, conjuguée avec des particules de Nanogold (Nanosondes) de 1,4 nm dans 1% de BSA + PBS*T pendant la nuit à +4 °C dans la chambre humide nouvellement préparée.
- Arrêtez la réaction et lavez l’échantillon en PBS*T, cinq fois pendant 10 minutes chacun.
- Stabiliser le complexe de biotine streptavidine en post-fixant 1% de glutaraldéhyde dans PBS* pendant 30 min.
- Retirer le glutaraldéhyde par lavage intense à l’eau désionisée et laver l’échantillon dans du PBS*, cinq fois pendant 20 min chacun.
- Trempez les groupes aldéhydes libres avec 1 mg/mL de NaBH4 fraîchement préparé dans de l’eau, deux fois pendant 10 min chacun. Pendant l’incubation, des bulles de H2 se forment qui peuvent soulever les couvercles. Poussez-les soigneusement vers le bas avec la pince à épiler.
- Laver à l’eau désionisée cinq fois pendant 5 minutes chacun.
REMARQUE: Pour le contrôle de la qualité à l’étape de l’étiquetage, il est conseillé d’effectuer un étiquetage de contrôle avec de la streptavidine marquée par fluorescence (Figure 2). Cela fournirait une estimation de l’intensité de l’étiquetage et du niveau de fond avant de passer à des étapes ultérieures fastidieuses et sujettes aux artefacts.
3. Amplification agricole
NOTE : Cette procédure est modifiée à partir de Gilerovitch et coll., 1995 (voir 20,21).
- Remettre en suspension 50 g de poudre d’acacia dans 100 mL d’eau désionisée. Dissoudre pendant 3 jours, dégazer et filtrer à travers quatre couches d’étamine. Conserver congelé dans des aliquotes de 5 mL dans des tubes de 50 mL. Décongeler immédiatement avant utilisation.
- Ajouter 2 mL de 1 M MES (pH = 6,1) à 5 mL d’aliquote décongelée de solution de poudre d’acacia pour obtenir 7 mL de 0,28 M MES (pH = 6,1) dans une solution de poudre d’acacia. Mélanger en berçant lentement le tube pendant 30 min. Enveloppez le tube avec du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière.
- Simultanément à l’étape 3.2., laver les couvercles avec tampon de lavage (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM de saccharose), trois fois pendant 10 min chacun.
- Préparer la solution fraîche de gallate de N-propyle (NPG). Dans un tube de 15 mL, dissoudre 10 mg de NPG dans 250 μL d’éthanol à 96 % et ajuster à 5 mL avec de l’eau désionisée.
- Mettez 36 mg de lactate d’argent dans un tube de 15 mL enveloppé de papier d’aluminium.
- Après l’étape 3.2. est terminé, ajouter 1,5 mL de solution de NPG au mélange de poudre d’acacia et à la roche pendant encore 3 min.
REMARQUE: Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans une chambre noire. Utilisez un voyant non actinique (jaune ou rouge). - Équilibrez l’échantillon avec un tampon de lavage et dirigez-vous vers la pièce sombre. Simultanément, ajouter 5 mL d’eau désionisée au lactate d’argent et dissoudre en agitant vigoureusement pendant 1-2 min.
- Ajouter 1,5 mL de solution de lactate d’argent au mélange de poudre d’acacia, faire basculer lentement pendant 1 min. Évitez la formation de bulles, car l’oxygène dans le mélange ralentira la réaction.
- Égoutter la solution du plat avec des couvercles et verser 3 mL de mélange de poudre de lactate d’argent et d’acacia sur les cellules. Secouez le plat plusieurs fois et incubez pendant 2-5 min. Le temps d’incubation dépend du lot de poudre d’acacia et de la température. Cela devrait être défini expérimentalement.
REMARQUE: Un temps d’incubation plus long peut entraîner une liaison à l’argent non spécifique. - Pour arrêter la réaction, égouttez le mélange réactionnel et lavez abondamment le plat avec trois à cinq changements d’eau désionisée, suivis de trois autres changements pendant 5 minutes chacun.
- Vérifiez la coloration sous le microscope à fond clair. Une bonne coloration doit être brun clair à brun foncé avec un fond jaunâtre très faible.
REMARQUE: Si la coloration ne se développe pas, il est possible de répéter immédiatement avec le mélange déjà fait (le mélange est actif pendant environ 15 minutes s’il est conservé dans l’obscurité). Cependant, la coloration dans ce cas peut se développer trop rapidement.
4. Tonification de l’or
NOTE: Afin de protéger les nanoparticules d’argent de la dissolution par oxydation OsO4 dans les procédures ultérieures, une imprégnation avec de l’or est utilisée à cette étape (Sawada, Esaki, 1994)22.
- Rincer les couvercles à l’eau désionisée.
- Afin de protéger les nanoparticules d’argent de la dissolution par oxydation OsO4 , incuber les échantillons dans de l’acide tétrachloroaurique à 0,05% pendant 2 min dans l’obscurité.
- Laver soigneusement à l’eau désionisée pendant 10 min.
REMARQUE: À ce stade, un contraste supplémentaire est ajouté au matériau contenant de l’ADN. La couleur de l’échantillon doit passer du brun au noir.
5. ChromEM
REMARQUE: Ce protocole a été modifié à partir de Ou et al., 201716.
- Incuber les couvercles et saturer les échantillons dans 10 μM DRAQ5 dans PBS pendant 10 min dans l’obscurité.
- Préparer une solution de tétrachlorhydrate de diaminobenzidine (DAB) à 0,2 % dans 50 mM de Tris ou de PBS :
dissoudre le DAB dans 90% du volume final en remuant vigoureusement dans l’obscurité, puis ajuster le pH à 7,0-7,4 avec du NaOH. Réglez le volume à 100% et filtrez à travers un filtre de 0,22 μM, conservez enveloppé dans du papier d’aluminium. - Ajouter la solution DAB aux cellules (2 mL par boîte de Petri de 3 cm) et incuber pendant 1 min.
- Déplacez le couvercle dans la boîte de Petri inférieure en verre et placez-le au stade d’un microscope inversé. Irradier l’échantillon (plusieurs champs de vision) sur un microscope inversé avec source lumineuse aux halogénures métalliques et filtre Cy5 réglé (640 nm, 1 W/cm2 au plan focal) à travers une lentille Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) pendant 10 min.
REMARQUE: Une indication de la photoconversion RÉUSSIE du DAB est le photoblanchiment complet du DRAQ5 et la formation de précipités DAB foncés dans les noyaux irradiés. Cependant, ce dernier n’est pas toujours apparent sur un signal EdU-argent-or intense (en particulier lorsque des impulsions EdU étendues sont utilisées). - Laver à l’eau désionisée trois fois pendant 5 minutes chacun.
6. Déshydratation et incorporation de résine époxy
- Dans un tube de microcentrifugation, préparer une solution partiellement réduite de tétraoxyde d’osmium en mélangeant une solution aqueuse à 2% de K4Fe(CN)6 avec une quantité égale de solution aqueuse à 2% d’OsO4, pour obtenir une concentration finale de 1% des deux composants. Incuber les couvercles dans osO4 réduit pendant 1 h et laver à l’eau désionisée trois fois pendant 5 min chacun.
REMARQUE: À ce stade, le composé d’osmium réduit réagit avec les dépôts DAB et augmente le contraste de l’ADN.
ATTENTION: L’osmium est toxique, travaille sous une hotte et manipule les déchets conformément aux réglementations de sécurité locales. - Déshydrater les échantillons dans une série de solutions d’éthanol graduées en pourcentages croissants: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.
- Pour l’infiltration et l’incorporation, utilisez la formule de résine avec le rapport volumétrique des composants comme suit: monomère de résine époxy: DDSA: MNA: DMP-30 = 9: 6: 4: 0,23 (w / w). Cette formule est miscible avec de l’éthanol.
- Incuber le couvercle dans le mélange éthanol-résine (3 parties 100% EtOH: 1 partie résine époxy) pendant 30 min.
- Incuber le couvercle dans le mélange éthanol-résine (1 partie 100% EtOH:1 partie résine époxy) pendant 2 h.
- Incuber le couvercle dans le mélange éthanol-résine (1 partie 100% EtOH: 3 parties de résine époxy) pendant la nuit.
- Remplacez le mélange éthanol-résine par de la résine pure fraîchement préparée. Incuber dans un mélange de résine pure pendant 8 h. Ouvrez le plat pour laisser les restes d’éthanol s’évaporer.
- Transférer les couvercles dans un nouveau plat avec de la résine pure et incuber pendant 2 h à 37-42 °C.
- Remplissez un moule en silicium avec de la résine fraîchement préparée. Placez les couvercles avec les cellules tournées vers le bas sur un moule en silicium approprié rempli de résine époxy. Durcir la résine pendant 24 h à 37 °C, puis à 60 °C pendant au moins 2 jours.
ATTENTION : Les composants du mélange de résine époxy sont potentiellement cancérigènes. Portez des gants et travaillez sous la hotte.
- Retirez la dalle de résine du moule, nettoyez la surface du couvercle avec le scalpel ou la lame de rasoir. Pour retirer le couvercle, déposez le couvercle dans de l’azote liquide, puis transférez la dalle dans l’eau bouillante. Répétez l’opération si nécessaire.
- Localisez la zone irradiée sous un stéréomicroscope et découpez-la de la dalle avec une scie à métaux ou tout autre instrument approprié. Préchauffez la dalle à 70 °C sur une plaque chauffante, si nécessaire.
- Fixez la découpe dans un porte-échantillon ultramicrotomique pour le rognage final du bloc. À l’aide du rasoir, préparez l’échantillon en forme de pyramide. Montez le support avec une pyramide sur l’ultramicrotome et installez le couteau.
- Coupez le bloc de sorte que les cellules irradiées portant l’étiquette EdU soient incluses. Préparez une section semi-mince (250 nm d’épaisseur) adaptée à la tomographie électronique.
REMARQUE: L’épaisseur de la section peut être ajustée pour répondre aux exigences expérimentales.
- Coupez le bloc de sorte que les cellules irradiées portant l’étiquette EdU soient incluses. Préparez une section semi-mince (250 nm d’épaisseur) adaptée à la tomographie électronique.
- Détachez la section du bord du couteau et placez-les sur les grilles à fente unique. Pour la tomographie électronique, des sections de 250 nm sont prélevées sur des grilles à fente unique de 1 mm et, après séchage, ces sections peuvent être recouvertes de carbone des deux côtés. Aucun contraste supplémentaire n’est nécessaire.
REMARQUE: Étant donné que les sections contiennent déjà des particules Au-Ag à contraste élevé, il n’est pas nécessaire d’ajouter des particules d’or fiduciales à la surface de la section. - Examinez les grilles dans un microscope électronique à transmission à faible grossissement (environ 600x) pour localiser les cellules avec des modèles de réplication appropriés.
REMARQUE: Ce protocole génère une densité d’étiquetage suffisamment élevée pour faciliter la détection des foyers de réplication, même à faible grossissement. Il est conseillé de créer d’abord une carte de la section pour la navigation ultérieure et la collection de projections angulaires pour la tomographie. Passez à un grossissement plus élevé et prenez des images haute résolution.
7. Tomographie électronique
- Insérez la grille dans le microscope électronique à transmission avec un support à haute inclinaison. Chargez l’échantillon dans le microscope électronique et localisez la région d’intérêt.
- Alignez le microscope en mode EFTEM en mode d’éclairage quasi parallèle. Réglez le filtre d’énergie avec une fente de sélection d’énergie de 20 eV placée à un pic de perte zéro.
- Pré-irradier la zone d’acquisition de la tomographie à un débit de dose de 40 e/Å2/s pendant au moins 1,5-2 min, ce qui correspond à la dose totale d’au moins 3000 e/Å2.
- Ajustez la hauteur eucentrique avec une tâche automatique dans SerialEM. Vérifiez la tâche de mise au point automatique pour vous assurer qu’il fonctionne correctement à un angle d’inclinaison nul et à une valeur de mise au point cible de -0,8 mkm.
- Inclinez le porte-échantillon à -60° avec la tâche Walk-Up.
- Configurez l’acquisition de la tomographie de -60 à +60° avec l’étape 2.0°. L’exposition doit être réglée en fonction de l’angle d’inclinaison pour maintenir l’intensité moyenne sur l’appareil photo. Limitez le décalage de l’image au cas où il provoquerait un décalage d’énergie et donc un désalignement de la fente. Les données de tomographie doivent être enregistrées en tant que fichier .mrc.
- Importez le fichier .mrc dans le logiciel IMOD pour la reconstruction de tomographie. Supprimez les valeurs de pixels aberrantes dues aux rayons X.
- Alignez la série d’inclinaison. Effectuez une corrélation croisée initiale, puis marquez manuellement 10 à 12 particules d’or comme fiduciales. Suivez le modèle fiducial et vérifiez que chaque fiducial est suivi correctement à travers la série d’inclinaison. Créez des tomogrammes d’échantillon (tranches) et marquez manuellement les bordures de section minces pour éviter l’inclinaison possible de la densité reconstruite à l’intérieur du volume. L’erreur résiduelle moyenne pour l’alignement fin était inférieure à 1,2 pix.
- Reconstruisez le tomogramme à l’aide d’un algorithme de rétroprojection filtré, puis coupez la sortie pour adapter la région d’intérêt au volume final.
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Representative Results
Les foyers de réplication dans les noyaux de cellules de mammifères présentent des modèles distincts de distribution dans le noyau en fonction de la progression de la phase S. Ces modèles sont en corrélation avec l’activité transcriptionnelle des loci en cours de réplication. Étant donné que la méthode présentée ici utilise une procédure de fixation assez forte, il est assez simple d’utiliser le marquage d’impulsions réplicatives pour la détection spécifique de loci de chromatine dans divers états transcriptionnels, même dans des conditions offrant la meilleure préservation structurelle de la chromatine obtenue par fixation chimique à température ambiante.
Les étapes de contrôle de la qualité visent à assurer le succès des procédures clés du présent protocole. Initialement, le succès du marquage EdU doit être confirmé par réaction de clic avec de l’azoture marqué par fluorescence, démontrant des modèles de réplication typiques si une population cellulaire hétérogène est utilisée (Figure 2). La deuxième étape importante est le marquage de la streptavidine, qui peut être fortement influencé par la fixation du glutaraldéhyde. Pour évaluer l’efficacité de la liaison à la streptavidine, utilisez la streptavidine conjuguée AlexaFluor-488 dans les mêmes conditions que la streptavidine-Nanogold (Figure 3). À ce stade, on s’attend à ce qu’un certain contexte soit principalement dû à l’autofluorescence du glutaraldéhyde ainsi qu’à un lavage incomplet de la streptavidine. Si le rapport signal/bruit est inacceptable, essayez d’augmenter le nombre et la durée des étapes de lavage à l’étape 2.6. Alternativement, ajouter la trempe au glutaraldéhyde avec NaBH4 (étapes 2.9-2.10) après l’étape 1.5.
La procédure d’amélioration de l’argent produit souvent des résultats incohérents et nécessite une optimisation. Tout d’abord, la vitesse de réaction varie considérablement en fonction du lot de solution de poudre d’acacia. La viscosité de la solution est inversement proportionnelle au temps de développement de la coloration à l’argent. C’est une bonne idée d’avoir plusieurs aliquotes du même lot et de les tester sur les échantillons témoins pour déterminer le moment optimal de la réaction. Comme la température des réactifs et l’environnement ont également un impact significatif sur la vitesse de réaction, essayez d’effectuer la réaction exactement à la même température. Si vous traitez plus de trois échantillons simultanément, il est pratique de démarrer la réaction à des intervalles de 30 secondes pour avoir suffisamment de temps pour les étapes de lavage.
Un bon résultat de la procédure d’amélioration de l’argent est la coloration brun foncé de certains noyaux (pas tous) avec une coloration cytoplasmique jaunâtre très faible (Figure 4). Cela signifie que la taille moyenne des particules d’argent est d’environ 20 nm, ce qui convient à la détection facile des étiquettes dans une large plage de grossissement de TEM sur la contre-coloration de la chromatine. Pour les expériences de tomographie, la taille des particules doit être réduite à environ 10 nm en raccourcissant le temps de réaction. La couleur dans ce cas doit être brun clair ou rougeâtre. La couleur de la coloration argentée doit être vérifiée avant la tonification de l’or.
La photoconversion et l’osmification DAB sont effectuées après la tonification de l’or pour protéger les coquilles d’argent de la dissolution. En cas d’imprégnation insuffisante de l’or, les nanoparticules d’argent s’érodent et acquièrent une forme irrégulière, mais restent visibles sous TEM. La qualité de la photoconversion DAB est d’abord surveillée par blanchiment DRAQ5 (en mode fluorescence), puis en mode champ clair, lorsque les noyaux cellulaires d’un champ irradié deviennent brun foncé (Figure 5). L’intensité de coloration DAB ne doit pas être très élevée afin que la coloration Ag-Au reste bien détectée pour permettre la sélection des cellules avec le temps de réplication requis pour la section.
Les sections ultraminces ou semi-minces ne nécessitent pas de coloration supplémentaire et peuvent être visualisées directement sous TEM. L’étiquetage approprié se traduit généralement par des grappes bien définies de nanoparticules Ag délimitant les sites de réplication (Figure 6), tandis que l’étiquetage de fond est limité à quelques nanoparticules par micromètre carré. Les sections semi-minces sont prêtes pour la tomographie et ne nécessitent pas l’ajout de nanoparticules d’or à la surface de la section, car les nanoparticules Ag présentes dans une section peuvent être utilisées comme marques fiduciaires (Figure 7). Dans cette figure, l’effet du temps d’étiquetage prolongé est montré: les foyers de réplication individuels fusionnent en structures ressemblant à des fibres, délimitant des domaines de chromatine d’ordre supérieur.
Graphique 1. Vue d’ensemble de la méthode. Les cellules cultivées sur des couvercles sont marquées avec de l’EdU, fixées avec 2,5% de glutaraldéhyde, perméabilisées, et la réaction de Click est réalisée avec de l’azoture biotinylé. Alternativement, les azotures marqués par fluorescence sont utilisés dans l’observation microscopique de la lumière. Les sites d’incorporation de biotine sont marqués avec de la nano-streptavidine (ou de la streptavidine marquée par fluorescence comme témoin), de l’argent amélioré et après une tonification à l’or soumise à une photoconversion et à une osmification DAB médiées par DRAQ5. Les échantillons sont incorporés dans de la résine époxy, sectionnés, examinés en TEM et soumis à une tomographie électronique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Modèles de réplication dans les cellules de mammifères révélés par le marquage EdU et la réaction de clic (vert). La progression de la phase S du début à la fin de la phase S (de gauche à droite) se manifeste par un changement ordonné des modèles de réplication: A, B - phase S précoce, C - phase S moyenne, D, E - phase S tardive. L’ADN est coloré avec du DAPI (rouge). Barre d’échelle = 10 um. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Modèles de réplication dans les cellules de mammifères révélés par marquage EdU et coloration en deux étapes de la biotine Click et de la streptavidine-AlexaFluor 488 après fixation du glutaraldéhyde. L’échantillon de contrôle étiqueté avec la streptavidine-AlexaFluor 488 affiche une efficacité d’étiquetage optimale et un rapport S / N après fixation du glutaraldéhyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Image représentative des cellules après la procédure d’amélioration de l’argent (étape 3). Divers motifs réplicatifs (phase S précoce, flèches; phase S moyenne, pointe de flèche; flèches tardives, doubles flèches) sont facilement visibles dans un mode de microscopie optique en champ lumineux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 5. Un résultat typique de la photoconversion DAB médiée par DRAQ5. (A) Coloration DRAQ5 (le cercle pointillé indique la zone irradiée). Notez un fort blanchiment DRAQ5 à l’intérieur du cercle. (B) La même zone observée dans le microscope à lumière à fond vif. Notez des précipitations DAB plus fortes dans les noyaux en zone irradiée. Encadré : les flèches indiquent les noyaux précoces de la phase S où les modèles de réplication marqués avec Ag-Au sont encore facilement détectables sur le fond de la coloration DAB photo-oxydée DRAQ5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 6. Foyers de réplication dans les noyaux de cellules de mammifères révélés par marquage EdU et coloration en deux étapes De la biotine Click et de la streptavidine-Nanogold après fixation du glutaraldéhyde. Sections minces de 90 nm d’une cellule en phase S montrant des amas de nanoparticules Ag-Au au niveau des foyers de réplication (A, cercles rouges). Le niveau de fond peut être apprécié dans une cellule non en phase S (B). Les pointes de flèche indiquent des fibres de chromatine de différentes échelles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 7. Projection d’inclinaison à 0° de section 250 nm. (A) et section tomographique virtuelle. (B) d’un noyau cellulaire marqué avec EdU pendant 2 h. Voir les foyers de réplication individuels fusionnés dans des structures ressemblant à des fibres (pointes de flèche). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode décrite ici présente plusieurs avantages par rapport aux protocoles précédemment publiés. Tout d’abord, l’utilisation de la chimie du clic pour le marquage de l’ADN répliqué élimine la nécessité d’une dénaturation de l’ADN préalable à la détection de BrdU avec des anticorps, préservant ainsi mieux l’ultrastructure de la chromatine.
Deuxièmement, l’utilisation de la biotine comme ligand secondaire généré après la fixation du glutaraldéhyde et la trempe appropriée des groupes aldéhydes non liés minimise la modification chimique de la cible, améliorant ainsi l’efficacité du marquage tout en réduisant le fond dû à la biotine endogène. La biotine-streptavidine ajoute également de la polyvalence car l’utilisation de streptavidine marquée par fluorescence facilite le contrôle de la qualité au tout début de la procédure. Le protocole peut être encore simplifié par l’introduction de la streptavidine marquée FluoroNanogold, cependant, dans nos mains, ces réactifs ont donné un fond un peu plus élevé par rapport à Nanogold-streptavidin, peut-être en raison de la plus grande taille des sondes.
Troisièmement, une combinaison de petites sondes, la streptavidine-Nanogold étant le plus grand composant d’environ 5 nm, fournit une très bonne pénétration dans même les cellules réticulées au glutaraldéhyde. Cela rend la technique adaptée à l’étiquetage pré-intégration de cellules préservées de manière optimale et facilement compatible avec diverses techniques de microscopie électronique 3D, y compris la reconstruction de section en série, la tomographie en réseau, la tomographie électronique, l’imagerie de face de bloc série et FIB-SEM.
L’amélioration de l’argent est l’étape la plus critique, nécessitant un contrôle précis de la diffusion du réactif et des étapes de lavage, ce qui est plus facile à effectuer avec les cellules adhérentes. D’autre part, étant donné qu’une forte réticulation avec le glutaraldéhyde peut également affecter l’amélioration de l’argent, les conditions de fixation doivent être affinées afin d’équilibrer la préservation de la structure de la chromatine et l’efficacité de l’amélioration de l’argent. Pour cette raison, les techniques de cryo-fixation/cryo-substitution, qui nécessitent une post-fixation étendue et mal contrôlée, bien que permettant une conservation encore meilleure de la structure, pourraient ne pas être entièrement compatibles avec la stratégie d’étiquetage proposée23. La technique peut être encore améliorée en utilisant l’amplification Au au lieu de l’amélioration argent24. Cette modification permet de sauter l’étape de tonification de l’or, cependant, dans nos mains, elle donne un fond considérablement plus élevé.
Enfin, l’étiquetage de pré-intégration permet la présélection des cellules cibles pour ChromEM et la section en fonction du modèle de réplication détectable sous un microscope à fond clair ou fluorescent. De plus, la méthode peut être facilement étendue au CLEM, y compris diverses techniques de super-résolution. Cela ouvre de nouveaux horizons dans l’étude de la structure et de la dynamique d’ordre supérieur de la chromatine dans divers états physiologiques. L’approche que nous avons décrite ici peut être utilisée pour des études sur l’organisation de la chromatine sur les sites de réplication, pour l’analyse du réarrangement post-réplicatif de la chromatine, y compris l’imagerie à haute résolution de la ségrégation chromatide en interphase, et pour le marquage réplicatif de grands domaines chromosomiques et les études du repliement de la chromatine d’ordre supérieur de fractions spécifiques du génome (euchromatine ou hétérochromatine, marquée en fonction du moment de la réplication). Ces types de techniques d’imagerie sont également importants comme point de référence pour les données générées par d’autres approches.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par RSF (subvention #17-15-01290) et RFBR (subvention #19-015-00273). Les auteurs remercient le programme de développement de l’Université d’État Lomonosov de Moscou (PNR 5.13) et le Centre d’excellence Nikon en imagerie corrélative de l’Institut Belozersky de biologie physico-chimique pour leur accès à l’instrumentation d’imagerie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
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