Abbildung replikativer Domänen in ultrastrukturell konserviertem Chromatin mittels Elektronentomographie

Sophie Sosnovskaya; Amir N. Zakirov; Ekaterina D. Ryumina; Ekaterina Kharybina; Sergei A. Golyshev; Olga S. Strelkova; Oxana A. Zhironkina; Andrei Moiseenko; Anton Orekhov; Igor I. Kireev

doi:10.3791/62803

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Methodenartikel

Abbildung replikativer Domänen in ultrastrukturell konserviertem Chromatin mittels Elektronentomographie

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DOI:

10.3791/62803

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20. Mai 2022

Sophie Sosnovskaya^*¹^,² , Amir N. Zakirov^*¹^,² , Ekaterina D. Ryumina^*¹^,³ , Ekaterina Kharybina¹^,² , Sergei A. Golyshev¹ , Olga S. Strelkova¹ , Oxana A. Zhironkina¹ , Andrei Moiseenko² , Anton Orekhov⁴ , Igor I. Kireev¹^,²^,⁵

¹Belozersky Institute of Physico-chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, ²Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, ³Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, ⁴National Research Center, Kurchatov Institute, ⁵V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology, and Perinatology

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine Technik zur hochauflösenden Kartierung von Replikationsstellen in strukturell konserviertem Chromatin in situ vor, die eine Kombination aus voreingebetteter EdU-Streptatvid-Nanogold-Markierung und ChromEMT verwendet.

Zusammenfassung

Die Prinzipien der DNA-Faltung im Zellkern und ihre dynamischen Transformationen, die während der Erfüllung grundlegender genetischer Funktionen (Transkription, Replikation, Segregation usw.) auftreten, sind nach wie vor wenig verstanden, was zum Teil auf das Fehlen experimenteller Ansätze zur hochauflösenden Visualisierung spezifischer Chromatinorte in strukturell konservierten Kernen zurückzuführen ist. Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung replitiver Domänen in Monolayer-Zellkultur in situ vor, indem wir die EdU-Markierung neu synthetisierter DNA mit anschließender Markierungsdetektion mit Ag-Amplifikation von Nanogoldpartikeln und ChromEM-Färbung von Chromatin kombinieren. Dieses Protokoll ermöglicht die kontrastreiche, hocheffiziente Voreinbettungsmarkierung, die mit der traditionellen Glutaraldehydfixierung kompatibel ist und die beste strukturelle Konservierung von Chromatin für die Probenverarbeitung bei Raumtemperatur bietet. Ein weiterer Vorteil der Prä-Embedding-Kennzeichnung ist die Möglichkeit, Zellen von Interesse für die Schnittaufnahme vorzuselektieren. Dies ist besonders wichtig für die Analyse heterogener Zellpopulationen sowie für die Kompatibilität mit elektronentomographischen Ansätzen zur hochauflösenden 3D-Analyse der Chromatinorganisation an Replikationsstellen und zur Analyse der postreplizierenden Chromatin-Neuanordnung und Schwesterchromatid-Segregation in der Interphase.

Einleitung

Die DNA-Replikation ist ein grundlegender biologischer Prozess, der für das originalgetreue Kopieren und Übertragen der genetischen Information während der Zellteilung erforderlich ist. Bei höheren Eukaryoten unterliegt die DNA-Replikation einer engen räumlich-zeitlichen Regulation, die sich in einer sequentiellen Aktivierung der Replikationsursprünge^{manifestiert 1}. Benachbarte Replikationsursprünge, die synchron ausgelöst werden, bilden Cluster von replicons². Auf der Ebene der optischen Mikroskopie werden Stellen der laufenden DNA-Replikation als Replikationsherde unterschiedlicher Anzahl und Größe nachgewiesen. Replik....