Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Zusammenfassung

Die Aufbereitung von mit Mitochondrien angereicherten Proben aus zuvor gefrorenem archiviertem festem Gewebe ermöglichte es den Forschern, sowohl funktionelle als auch analytische Bewertungen von Mitochondrien in verschiedenen experimentellen Modalitäten durchzuführen. Diese Studie zeigt, wie man mit Mitochondrien angereicherte Präparate aus gefrorenem Herzgewebe herstellt und analytische Bewertungen von Mitochondrien durchführt.

Zusammenfassung

Das mitochondriale Elektronentransferkomplexprofil (ETC) ist im Herzgewebe der Nachkommen, die von einer trainierten Sau geboren wurden, modifiziert. Die Hypothese, die vorgeschlagen und getestet wurde, war, dass eine regelmäßige mütterliche Übung einer Sau während der Schwangerschaft die mitochondriale Effizienz der Herzbioenergetik der Nachkommen erhöhen würde. Diese Hypothese wurde getestet, indem Mitochondrien mit einem milden Isolationsverfahren isoliert wurden, um mitochondriale ETC und superkomplexe Profile zu bewerten. Das hier beschriebene Verfahren ermöglichte die Verarbeitung von zuvor gefrorenem archiviertem Herzgewebe und eliminierte die Notwendigkeit einer frischen Mitochondrienvorbereitung für die Beurteilung von mitochondrialen ETC-Komplexen, Superkomplexen und ETC-Komplex-Aktivitätsprofilen. Dieses Protokoll beschreibt die optimale ETC-Proteinkomplexmessung beim multiplexierten Antikörper-basierten Immunoblotting und der superkomplexen Bewertung mittels Blau-nativer Gelelektrophorese.

Einleitung

Das Ziel dieses Protokolls war es, detaillierte Schritte zur Gewinnung eines mit Mitochondrien angereicherten Präparats aus zuvor gefrorenem Herzgewebe mit einer neuen Technologie der niederenergetischen mechanischen Störung von Gewebe bereitzustellen, die die Gewebelyse und die Extraktion von Mitochondrien verbessert. Mit diesem Verfahren wird eine verbesserte Extraktionseffizienz ohne erzeugung hoher Scherspannung oder hoher Temperatur und kurze Homogenisierungszeit (10-12 s) ^erreicht1.

Mitochondrien aus archiviertem gefrorenem Gewebe zu gewinnen, ist ein wertvolles Gut, um sowohl ^{funktionelle2} als auch biochemische ^Studien3 durchzuführen, die sonst unter den genauen experimentellen Bedingungen nicht leicht wiederholbar sind. Ein klassischer Potter-Elvehjem Teflon Stößelglas-Homogenisator oder Dounce-Homogenisator wurde verwendet und wird immer noch in Forschungslabors verwendet, um Weichteile wie Leber, Niere und Gehirn zu homogenisieren. Die Homogenisierung von Hartgeweben wie Muskeln und Herz erfordert jedoch mehr Homogenisierungszeit, Enzymbehandlung, Hochgeschwindigkeitshomogenisierung und umfangreiche Benutzererfahrung. Dies ist nachteilig für die Extraktion intakter Organellen wie Mitochondrien aus hartem Gewebe wie Muskel und Herz. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode wird verwendet, um ein mit Mitochondrien angereichertes Präparat mit hoher Ausbeute zu erhalten, um mitochondriale Elektronentransportketten (ETC) Proteinkomplexe und ihre superkomplexe Bildung in Herzgeweben zu analysieren, die von Nachkommen geerntet werden, die von trainierten und sitzenden Sauen geboren, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung gelagert werden. Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, mit Mitochondrien angereicherte Zubereitung aus zuvor gefrorenem archiviertem Gewebe zu isolieren.

Externe Nanomaterialexposition gegenüber schwangeren Nagetieren kann die Herzfunktion und die mitochondriale Atmung und Bioenergetik von Nachkommen während der Schwangerschaft negativ ^{beeinflussen4}. Dennoch müssen aerobe, durch Bewegung induzierte positive Veränderungen der fetalen Myozyten-Bioenergetik während der Schwangerschaft noch dokumentiert werden. Neuere Studien belegen jedoch, dass mütterliche Aerobic-Übungen während der Schwangerschaft einen positiven Einfluss auf die fetale Herzfunktion ^haben5. Um weitere Beweise zu liefern, wurde eine Analyse der longitudinalen Auswirkungen von mütterlicher Bewegung auf kardiale mitochondriale Atmungskettenkomplexe der Nachkommen (d.h. Komplex I bis Komplex V) während der Schwangerschaft durchgeführt.

Diese Studie hat eine signifikante gesundheitliche Relevanz, da die Ergebnisse darauf hindeuten könnten, dass mütterliche Bewegung die Effizienz der Energieproduktion in den Herzmitochondrien der Nachkommen verbessert. In dieser Studie wurden Sauen (weibliches Schwein) aus zwei Gründen als Tiermodell verwendet: (i) Die Herzphysiologie ähnelt der des ^Menschen6 und (ii) die Herzgewebeentnahme von Nachkommen aus verschiedenen Zeitpunkten ist im Rahmen einer institutionellen IACUC-Zulassung möglich. Die vorgeschlagene Studie zielt darauf ab, viele der grundlegenden Fragen zu beantworten, die mütterliche Bewegung und ihre potenziellen positiven Auswirkungen auf die zelluläre und biochemische Zusammensetzung des Herzgewebes der Nachkommen miteinander verbinden. Dieser Ansatz erfordert sanfte, aber effektive Mitochondrien-Isolationstechniken aus zuvor gefrorenem Herzgewebe, die aus den langwierigen und kostspieligen Längsschnittstudien gewonnen wurden, die sich mit den Problemen der bioenergetischen Veränderungen in fetalen Herzmyozyten während der Schwangerschaft befassten. Die in dieser Studie beschriebene Methode ermöglicht es, große Mengen zuvor gefrorenen archivierten Gewebes für die mit Mitochondrien angereicherte Vorbereitung sowohl für analytische als auch für funktionelle Studien zu verwenden. Die Studie wird auch dazu beitragen, die Wissenslücke in diesem Bereich zu schließen, indem sie vorläufige Daten liefert, die zu zukünftigen Studien führen könnten, die die Auswirkungen von mütterlicher Bewegung auf die Herzgesundheit in utero und darüber hinaus bestimmen.

Protokoll

Gefrorenes Herzgewebe der Nachkommen wurde von Dr. Sean Newcomer zusammen mit dem institutionellen IACUC-Genehmigungsschreiben erhalten. Das Herzgewebe wurde aus einer Langzeit-Längsschnittstudie gewonnen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C für die zukünftige Verwendung gelagert. Alle Protokolle bezüglich der Verarbeitung von Herzgewebe der Nachkommen folgten den Richtlinien der IBC- und IACUC-Komitees der Kansas City University.

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

HINWEIS: Bereiten Sie alle Proben gemäß den Richtlinien des Herstellers vor. Verwenden Sie ultra-gereinigtes Wasser oder gleichwertig in allen Rezepten und Protokollschritten. Tragen Sie während dieses Verfahrens persönliche Schutzausrüstung (Laborfreude, Gesichtsmaske, Handschuhe und Schutzbrille / Gesichtsschutz). Puffervolumina eignen sich für die Verarbeitung von sechs Gewebeproben.

1. Bereiten Sie 1,5 l Gewebewaschpuffer vor, indem Sie 154,035 g Saccharose (0,3 m final), 3,904 g HEPES (10 mM final), 0,111 g EDTA (0,2 mM final) kombinieren. Fügen Sie die Zutaten auf der Rührplatte zu 1,0 l Wasser hinzu, stellen Sie den pH-Wert mit verdünntem HCl auf 7,2 ein und machen Sie ihn auf ein Endvolumen von 1,5 l auf.
   ANMERKUNG: Pro Probe werden ca. 200 ml Waschpuffer benötigt (50-300 mg). Sechs Gewebeproben können an einem Tag verarbeitet werden. Verwenden Sie den verbleibenden Waschpuffer, um einen Isolationspuffer zu erstellen.
2. Bereiten Sie den Isolationspuffer aus dem zuvor in Schritt 1.1 beschriebenen Waschpuffer vor, indem Sie 210 mg BSA in 210 ml Waschpuffer zugeben. Stellen Sie den pH-Wert mit verdünnter NaOH-Lösung auf 7,4 ein.
   HINWEIS: Pro Gewebeprobe werden ca. 35 ml Isolationspuffer benötigt; Daher werden für sechs Proben 210 ml Isolationspuffer benötigt. Bereiten Sie diesen Puffer vor, indem Sie am Tag der Zubereitung frische BSA-Lösung (1 mg / ml endgültig) hinzufügen. BSA wird verwendet, um Mitochondrien zu isolieren, da es die mitochondrialen Eigenschaften verbessert, indem es natürliche Entkoppler wie freie Fettsäuren entfernt. Es wurde festgestellt, dass BSA eine antioxidative Aktivität hat, indem es die Oxidationsrate von Substraten, insbesondere Succinat, in den Mitochondrien des Gehirns ^erhöht7. Alternativ kann Rinderserumalbumin durch kostengünstigere säurefreie Analoga wie Ovalbumin ersetzt werden.
3. Bereiten Sie 150 ml Resuspensionspuffer vor, indem Sie 0,011 g EDTA (Endkonzentration von 0,2 mM EDTA) kombinieren oder 150 μL 200 mM EDTA-Stamm-EDTA-Lösung für 150 ml Resuspensionspuffer), 12,836 g Saccharose (0,25 M Saccharose-Endkonzentration) und 0,236 g Tris (10 mM Tris-HCl final) verwenden. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,8 mit 0,1 N NaOH ein. Fügen Sie 60 μL des Protease-Inhibitor-Cocktails kurz vor Gebrauch hinzu.
4. Bereiten Sie die Trypsinlösung vor, indem Sie 7,5 mg Trypsin in 3,0 ml 1 mM HCl (2,5 mg Trypsin/ ml final) auflösen. Diese Menge reicht für eine Probe aus.
   HINWEIS: Bereiten Sie die Trypsin-Lösung basierend auf der Anzahl der Gewebeproben vor, die verarbeitet werden sollen.
5. Bereiten Sie die Trypsin-Inhibitor-Lösung aus Sojabohnen vor, indem Sie 13,0 mg Trypsin-Inhibitor in 20 ml Isolationspuffer mit BSA (0,65 mg/ml Trypsin-Inhibitor final) kombinieren.
   HINWEIS: Bereiten Sie eine frische Trypsin-Inhibitor-Lösung vor.
6. Bereiten Sie das Ammoniumpersulfatreagenz unter Zugabe von 0,1 g Ammoniumpersulfat in 1 ml Wasser (10% Ammoniumpersulfat end) vor.
   HINWEIS: Das Ammoniumpersulfat-Reagenz sollte entweder frisch zubereitet werden oder ein großes Volumen kann aliquoted und in einem -20 °C Gefrierschrank aufbewahrt werden.
7. Bereiten Sie die Aminocapronsäurelösung (ACA) vor, indem Sie 0,131 g 6-Aminocapronsäure in 1,0 ml ultragereinigtem Wasser mischen und in 4 °C (1 M 6-Aminocapronsäure endgültig) lagern.
8. Bereiten Sie die Coomassie Brillantblau-Farbstofflösung vor, indem Sie 1 g Coomassie G-250 in 0,5 ml Wasser und 0,5 ml 1 M Aminocapronsäure (Endkonzentration von 10% Farbstofflösung) auflösen.
9. Bereiten Sie 5% Digitonin für Blue native-PAGE (BN-PAGE) vor. Berechnen Sie ungefähr, wie viel Digitonin in der Probenvorbereitung benötigt wird, plus etwas zusätzliches Volumen, um die Pipettierfehler auszugleichen (Überschätzung um 10 mg). Für 15 mg: Verdünnen Sie zuerst 15 mg Digitonin in 30 μL 100% DMSO. Vortex, um dem Digitonin zu helfen, in die Lösung zu gelangen. Als nächstes fügen Sie die restlichen 90% _ddH2O (270 μL) hinzu. Erhitzen Sie die Lösung vorsichtig, um die Lösung zu mischen (Wirbel), und kühlen Sie sie dann auf Eis ab.
10. Bereiten Sie den systemeigenen PAGE-Anodenpuffer vor. Fügen Sie 50 ml 20x nativen PAGE-Laufpuffer zu 950 ml Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 1 L zu erhalten. Verwenden Sie dies als 1x laufenden Puffer.
11. Bereiten Sie einen dunkelblauen Kathodenpuffer vor. 0,0160 g Coomassie brilliant blue G-250 in 80 mL nativem PAGE-Anodenpuffer auflösen; gut mischen.
    HINWEIS: Bereiten Sie frischen Kathodenpuffer für den sofortigen Gebrauch vor. Es werden nur 60 ml benötigt, aber im Falle von Leckagen werden zusätzliche 20 ml benötigt.
12. Bereiten Sie den hellblauen Kathodenpuffer vor. Fügen Sie 20 ml dunkelblauen Kathodenpuffer in 180 ml nativen PAGE-Anodenpuffer hinzu und mischen Sie gut.
    HINWEIS: Dieser Puffer kann nur einmal verwendet werden.
13. Bereiten Sie 5% Coomassie G-250 als Probenzusatz vor. Verdünnen Sie 200 μL 10% bereits hergestellten Coomassie-Bestand (Schritt 1.8) mit 200 μL 1 M ACA und lagern Sie ihn bei 4 °C.
14. Bereiten Sie 4x nativen PAGE-Probenpuffer vor, indem Sie 40% Glycerin, 0,04% Ponceau S, 25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 192 mM Glycin in 10 mL Endvolumen kombinieren. Aliquotieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 °C im Gefrierschrank.

2. Mitochondria-Isolierung aus gefrorenem Herzgewebe

HINWEIS: Führen Sie die Mitochondrien-Isolierung in einem 4 °C heißen Kühlraum durch. Im Falle der Nichtverfügbarkeit des Kühlraums verwenden Sie jedoch ein großes Eisbad, um das Verfahren durchzuführen.

1. Entnehmen Sie zuvor gefrorene Herzgewebeproben aus dem -80 °C Gefrierschrank.
   HINWEIS: Maximal vier Gewebeproben können an einem bestimmten Tag bequem zur Isolierung der Mitochondrien verarbeitet werden.
2. Wiegen Sie das Röhrchen mit der Herzgewebeprobe und notieren Sie das Gewicht. Bereiten Sie drei Bechergläser (je 50 ml) mit 40 ml Waschpuffer vor. Kühlen Sie jedes Becherglas im Eissalzbad mit gleichen Mengen Eis und Salz für 3-5 min ab, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Setzen Sie magnetische Rührstäbe in jedes Becherglas und stellen Sie den Rührer auf mittlere Geschwindigkeit.
   HINWEIS: Frieren Sie die Bechergläser nicht über und verwenden Sie sie sofort, kurz nachdem Wolken von Eiskristallen auftauchen.
3. Geben Sie das gefrorene Herzgewebe direkt in die eiskalte Lösung im ersten Becherglas. Warten Sie ca. 5 Minuten, während Sie rühren und mit einer Pinzette leichten Druck auf das Gewebe ausüben, um so viel Blut wie möglich herauszuholen.
4. Wiegen Sie den leeren Schlauch und subtrahieren Sie vom ursprünglichen Gewicht (Schritt 2.2), um ein Nettogewicht des Herzgewebes zu erhalten.
5. Nehmen Sie das Gewebe mit einer Pinzette heraus und drücken Sie das Herz mit einem sauberen Papiertuch aus Filterpapier zusammen, um Blut zu entfernen. Legen Sie dann das Gewebe in das zweite Becherglas. Warten Sie etwa 5 Minuten unter Rühren, um überschüssiges Blut zu entfernen.
6. Trocknen Sie das Taschentuch vorsichtig auf einem Papiertuch ab. Entfernen Sie alles Fett, geronnenes Blut, Ohrmuscheln und Faszien (weißes Gewebe). Dann poolen Sie das ventrikuläre Gewebe.
7. Zerkleinern Sie die Gewebeproben mit dem Aktenvernichter, indem Sie die Schritte 2.7.1-2.7.9 ausführen.
   1. Legen Sie das Herzgewebe (~ 50-300 mg) von der Widderseite in die Gewebezerkleinerkammer.

Abbildung 1: Gewebezerkleinererkammer (Röhrchen) zur Verwendung mit dem Aktenvernichter. Die Gewebehomogenisierung im Shredderschlauch erfordert ca. 10-12 s pro Gewebeprobe. Die Gewebehomogenisierung ist abgeschlossen, sobald das homogenisierte Gewebe durch die perforierte Scheibe in die obere Kammer gelangt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Fügen Sie ~ 0,2-0,8 ml Waschpuffer auf die Kappenseite des Röhrchens hinzu.
   ANMERKUNG: Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen der Probe und des waschpuffers während der Zerkleinerung 0,7-0,8 ml nicht überschreitet.
3. Verwenden Sie das Rohrwerkzeug, um die Shredderkammer mit der Shredderkappe eng zu verschließen.
   HINWEIS: Ziehen Sie die Schredderkappe nicht zu fest an.
4. Legen Sie die Shredderkammer mit der Stößelseite nach unten in die Shredderhaltereinheit. Der Stößel schaltet eine Armatur in den Aktenvernichterhalter ein.
5. Fügen Sie das Bit des Aktenvernichtertreibers ein; Lassen Sie das Bit mit der Aktenvernichterkappe eingreifen. Stellen Sie sicher, dass das Bit fest verriegelt ist.
   HINWEIS: Verwenden Sie immer den voll aufgeladenen Aktenvernichtertreiber.
6. Üben Sie manuell Druck nach unten auf den Shreddertreiber und die Shredderkammer aus, bis die Druckanzeige am Shredderhalter eine Einstellung von ungefähr 2 auf dem Shredderhalter erreicht.
   HINWEIS: Die Einstellung kann auf einem höheren Niveau sein, wenn das Zerkleinerungsgewebe fibröser ist.
7. Führen Sie den Aktenvernichtertreiber für ca. 10-12 s aus, indem Sie den Auslöser des Aktenvernichtertreibers drücken, während Sie die Einstellung bei 2 beibehalten.
8. Schauen Sie sich das Röhrchen an, um zu überprüfen, ob die gesamte oder der größte Teil der festen Masse des Gewebes durch die Lysescheibe geschreddert und in die obere Kammer der Schredderkammer geleitet wird, indem Sie das Röhrchen betrachten.
   HINWEIS: Es kann notwendig sein, die Gewebeprobe über einen längeren Zeitraum zu zerkleinern. Geben Sie das Röhrchen einfach zum Aktenvernichter zurück und setzen Sie den Vorgang fort. Die meisten Arten von Gewebeproben erfordern nur 10-12 s Zerkleinerung. Während bei jeder Zerkleinerung aufgrund der Reibung etwas Wärme entsteht, erwärmt diese kurze Verarbeitungszeit die Probe nicht wesentlich.
9. Heben Sie nach dem Zerkleinern der Probe die Zerkleinerungskammer aus der Haltereinheit heraus. Entfernen Sie mit dem Röhrchenwerkzeug die Zerkleinererkappe und legen Sie sie zur späteren Verwendung auf eine saubere Oberfläche.
   HINWEIS: Die Zerkleinererkappe sollte als mit Probenextrakt kontaminiert betrachtet werden und kann je nach Probentyp mit infektiösem Material kontaminiert sein. Verwenden Sie nicht die gleiche Zerkleinererkappe für andere Gewebeproben, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.

8. Das zerkleinerte Herzgewebe in das dritte Becherglas mit 40 ml Waschpuffer und Rührstab geben und das Gewebe 5 min mit mittlerer Geschwindigkeit auf der Rührplatte umrühren.
9. Filtern Sie die Suspension durch ein Nylon-Mesh-Monofilament (74 μm Porengröße) und entsorgen Sie das Filtrat. Waschen Sie das zerkleinerte Gewebe auf dem Filter 3x mit 10 mL Waschpuffer.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Nylon-Mesh-Monofilament mit Wasser vorbenetzt ist.
10. Das gewaschene und geschredderte Gewebe in ein 50 ml Becherglas mit 20 mL Waschpuffer geben und das Becherglas in das Eisbad auf den Magnetrührer stellen. Fügen Sie 0,5 ml Trypsinlösung hinzu, während Sie 15 Minuten lang ständig umrühren. Ungefähr nach der Hälfte der Inkubation (nach ca. 7,5 min) wird die Gewebesuspension in einen locker sitzenden handgehaltenen Glas-auf-Glas-Homogenisator gegeben, der ein Volumen von 0-15 ml fasst.

Abbildung 1: Gewebezerkleinererkammer (Röhrchen) zur Verwendung mit dem Aktenvernichter. Die Gewebehomogenisierung im Shredderschlauch erfordert ca. 10-12 s pro Gewebeprobe. Die Gewebehomogenisierung ist abgeschlossen, sobald das homogenisierte Gewebe durch die perforierte Scheibe in die obere Kammer gelangt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

11. Vorsichtig mit 4-5 Schlägen homogenisieren, um die Suspension zu dispergieren, ohne Schaum zu erzeugen. Das Homogenat in ein 50 mL Becherglas geben und vorsichtig auf einer Rührplatte für 15 min bei 4 °C mischen.
12. Nach 15 min Inkubation werden 10 ml des Isolationspuffers, der den Trypsin-Inhibitor enthält, in das Becherglas mit dem Homogenat gegeben und 1 min bei 4 °C unter vorsichtigem Rühren inkubiert.
13. Filtern Sie die Suspension erneut durch einen Nylonfilter und bewahren Sie das Filtrat in einem 50 mL konischen Rohr auf.
14. Sammeln Sie die auf dem Nylonfilter verbliebene Partikelfraktion und legen Sie sie in den Glas-auf-Glas-Homogenisator. 15-20 ml des Waschpuffers zugeben und vorsichtig von Hand für 25-30 s homogenisieren.
    HINWEIS: Das Filtrat fließt bei diesem Schritt sehr langsam. Um den Filtratfluss zu erhöhen, platzieren Sie die Trichterspitze, die die Innenseite des konischen Rohres berührt.
15. Mischen Sie das Homogenat mit dem Filtrat, balancieren Sie die Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 600 x g für 15 min bei 4 °C.
16. Filtern Sie den resultierenden Überstand mit einem Nylonfilter in ein neues konisches Rohr, um eine Kontamination durch das Pellet zu vermeiden. Lassen Sie die Zentrifuge erneut bei 8.500 x g für 15 min bei 4 °C laufen.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um den Überstand zu entfernen, und opfern Sie 0,2 ml Überstand von der Oberseite des flauschigen Pellets.
17. Entsorgen Sie den Überstand und spülen Sie das Pellet 2-3 mal mit 1 ml des Isolationspuffers ab. Achten Sie darauf, die flauschige weiße äußere Randschicht jedes Mal zu entsorgen.
    HINWEIS: Waschen Sie das Pellet, indem Sie den Isolationspuffer mit einer Pipette mit 1 ml Spitze oder einer neuen Transferpipette hinzufügen. Fügen Sie den Puffer an der Seite des Rohres hinzu, nicht direkt über dem Pellet, um das Brechen des Pellets zu verhindern und die Kontamination des Überstandes zu verhindern. Als nächstes saugen Sie den Puffer mit einer Transferpipette ab und wiederholen Sie den Vorgang zwei weitere Male.
18. Fügen Sie jedem Rohr 5 ml des Isolationspuffers hinzu und brechen Sie das Pellet mit einer Pipette mit einer 1 ml-Spitze oder einer neuen Transferpipette auf.
19. Verdünnen Sie die Suspension mit 20 mL zusätzlichem Isolationspuffer und lassen Sie die Zentrifuge erneut bei 8.500 x g für 15 min bei 4 °C laufen.
20. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Pellet in 5 ml des wiederverwendenden Puffers. Dann fügen Sie 15 ml mehr des Puffers für insgesamt 20 ml hinzu und zentrifugieren Sie bei 8.500 x g für 15 min. bei 4 ° C. Verwerfen Sie den Überstand. Das resultierende braune Pellet enthält gewaschene intakte Mitochondrien.
21. Resuspend das mit Mitochondrien angereicherte Pellet in 250 μL des resuspending Puffers, einschließlich Proteasehemmern. Aliquot in 25 μL, Schnellgefrierschrank in flüssigem Stickstoff und mehrjährige Lagerung in einem -80 °C Tiefkühlschrank.
    HINWEIS: Sparen Sie 5 μL mit Mitochondrien angereichertes Präparat für den Proteinanalyse-Assay. Für eine BN-PAGE-Studie (Blue native-PAGE) aliquotierte das resuspendierte Pellet in 50 μg mitochondriales Protein pro Röhrchen. Zentrifuge bei 8.500 x g für 15 min bei 4 °C. Den Überstand vorsichtig absaugen und das mitochondriale Pellet (50 μg Protein/Aliquot) mehrere Jahre in einem -80 °C Tiefenkühlschrank lagern.

3. Bewertung des mitochondrialen Elektronentransferkomplexes (ETC)

HINWEIS: Einzelne mitochondriale ETC-Proteine (d. h. Komplex-I, II, III, IV, V) können mit einem Standard-Immunoblotting-Assay bewertet werden. Aufgrund der Vielfalt der Proben (vier Zeitpunkte: 48 h, 3 Monate, 6 Monate, 9 Monate), zwei experimentelle Bedingungen (trainiert und sitzend) und einer Reihe von immunprobingen Antikörpern (fünf Antikörper) wird ein multiplexiertes Immunoblotting empfohlen. Führen Sie das multiplexierte Immunoblotting wie folgt durch.

1. Lösen Sie 50 μg der mit Mitochondrien angereicherten Proteinprobe / -vertiefung in 4% -20% Gradienten Polyacrylamid-Gelelektrophorese (100 V, 90 min) auf.
2. Übertragung der Proteine auf eine PVDF-Membran (75 V; 60 min)
3. Die Membran wird in einer blockierenden Pufferlösung für mindestens 1 h bei 4 °C blockiert.
   HINWEIS: Die Sperrzeit kann bis zur Übernachtung bei 4 °C verlängert werden. Der Blockierungspuffer (Materialtabelle) enthält Nicht-Säugetier-Inhaltsstoffe (d.h. Fischproteine), die weniger wahrscheinlich spezifische Bindungsinteraktionen mit Antikörpern sowie anderen Säugetierproteinen aufweisen, die in typischen Methoden vorhanden sind.
4. Untersuchen Sie die Membran mit dem Antikörpercocktail einschließlich Anti-Komplex-I-, II-, III-, IV-, V-Antikörpern und inkubieren Sie über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei 4 °C.
5. Am nächsten Tag waschen Sie die Membran und die Sonde mit IR-markiertem Sekundärantikörper für 2 h auf einem Orbitalschüttler bei RT (Raumtemperatur).
6. Fünfmal mit 1x TBS-T (TBS mit Tween 20) und einmal mit 1x TBS (Tris gepufferte Kochsalzlösung) waschen.
   HINWEIS: Legen Sie für die letzte Wäsche kein Reinigungsmittel in den TBS-Puffer ein.
7. Stellen Sie den Blot in einem Image Analyzer dar.

4. Die Mitochondria-Superkomplex-Bewertung durch Blue Native Poly Acrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE)

HINWEIS: Ein superkomplexes Profil von ETC kann auch mit der BN-PAGE-Technik bewertet werden.

1. Bereiten Sie den Probenpuffercocktail für 20 μL pro 50 μg mit Mitochondrien angereichertes Pelletprotein vor (7 μL Wasser + 5 μL 4x native Polyacrylamid-Gelelektrophorese Probenladepuffer + 8 μL 5% Digitonin + 2 μL Coomassie G-250).
   HINWEIS: Machen Sie einen Stammprobenpuffer-Cocktail in Abhängigkeit von der Anzahl der verfügbaren Proben (50 μg Protein/Probe). Wählen Sie geeignete Digitoninmengen basierend auf der Proteinkonzentration des mit Mitochondrien angereicherten Pellets (Tabelle 1)⁸.
2. Den Digitoninvorrat bei 95 °C für 3 min erhitzen, mischen und auf Eis abkühlen lassen, bevor die Mastermischung hergestellt wird.
3. Fügen Sie das Coomassie G-250 Probenadditiv hinzu, kurz bevor Sie die Proben in das Gel laden.
4. 20 μL des Probenpuffercocktails in ein Röhrchen geben, das 50 μg mitochondriales Proteinpellet enthält. Lösen Sie das Pellet auf/resuspendieren Sie es, indem Sie das Pellet vorsichtig mit einer Pipette mischen, ohne Schaum zu erzeugen.
5. Die Mischung 20 min auf Eis inkubieren, um eine maximale Löslichkeit des mit Mitochondrien angereicherten Pellets zu erreichen. Von Zeit zu Zeit streichen Sie vorsichtig über die Röhrchen, um die Solubilisierung zu verbessern.
6. Bereiten Sie während des Wartens auf die Inkubation den nativen PAGE-Anodenpuffer/1x-Laufpuffer und den dunkelblau gefärbten Kathodenpuffer vor.
7. Zentrifugieren Sie das gelöste mit Mitochondrien angereicherte Pellet bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C.
8. Nach der Zentrifugation werden 15 μL des Überstands in neue, auf Eis gelegte Röhrchen gesammelt.
9. Dem in Schritt 4.8 erhaltenen Überstand wird die entsprechende Menge von 5 % Coomassie G-250 Reagenz zugesetzt (siehe Tabelle 1).
   HINWEIS: Das Volumen von 5% Coomassie G-250 sollte so beschaffen sein, dass die Endkonzentration des Farbstoffs 1/4 der Detergenzienkonzentration beträgt. Führen Sie diesen Schritt kurz vor dem Laden der Proben in das Gel aus.

Protein	Digitonin/Protein	4x Probenpuffer	5% Digitonin	Wasser	Letzter Band	5% Coomassie G-250
	Verhältnis (g/g)					Probenadditiv
50 μg	8	5	8	7	20	2
50 μg	4	5	4	11	20	1

Tabelle 1: Probenpuffer-Cocktailzubereitung mit zwei verschiedenen Waschmittel/Protein-Verhältnissen. Um eine maximale Solubilisierung von Membranproteinen aus der mitochondrialen Suspension zu erreichen, sollte die Digitonin/mitochondriale Suspensionsproteinkonzentration auf 4-8 g Digitonin/g Protein eingestellt werden. Im Herzgewebe wurden 400 μg Digitonin für 50 μg mitochondriale Suspensionsproteine (d.h. 8 g Digitonin/g Mitochondrienprotein) verwendet, um die Löslichkeit der Superkomplexe aus der Mitochondriensuspension zu maximieren.

10. Gießen Sie ein 3% -8% Gradientengel, entfernen Sie den Kamm und waschen Sie die Vertiefungen des Gels dreimal mit 1x Laufpuffer aus.
    HINWEIS: Das Gel polymerisiert am besten, wenn es einen Tag vorher gegossen wird.
11. Richten Sie das Elektrophoresesystem ein und legen Sie das Gel in die Apparatur.
12. Füllen Sie die Probentöpfe mit dem dunkelblau gefärbten Kathodenpuffer.
13. Laden Sie 10 μL des ungefärbten Proteinstandards als nativen Molekulargewichtsmarker auf die erste und letzte Vertiefung des Gels.
14. Laden Sie die gesamte Menge des Probenüberstands + Coomassie-Probenadditivs, das in Schritt 4.9 oben vorbereitet wurde, mit einer Flachkopf-Gel-Ladespitze in die Vertiefungen.
15. Füllen Sie den Minizellpufferdamm vorsichtig mit ca. 60 ml dunkelblauem Kathodenpuffer, ohne die Proben in den Vertiefungen zu stören, und füllen Sie dann den Puffertank mit dem nativen PAGE 1x Laufpuffer.
16. Schalten Sie das Netzteil ein und elektrophorisieren Sie die Proben bei 150 V für ca. 30 min.
17. Entfernen Sie den dunkelblauen Kathodenpuffer mit einer Transferpipette aus dem Pufferdamm (innere Kammer) oder saugen Sie die Probenbohrungen ab. Füllen Sie die innere Kammer mit 150-200 ml hellblauem Kathodenpuffer und führen Sie die Elektrophorese bei 250 V für 60 min durch.
    HINWEIS: Die Elektrophoresezeit kann bestimmt werden, indem überprüft wird, wann die Farbstofffront nur 0,5 cm über den Boden der Gelkassette wandert.
18. Entfernen Sie das Gel von der Kassette und legen Sie es in einen sauberen Kunststoffbehälter. Waschen Sie das Gel mit hochwertigem destilliertem Wasser für 15 minuten auf einer Wippe / Orbitalschüttler.
    HINWEIS: Um das Verlaufsgel von der Kassette zu entfernen, behandeln Sie die Kassette von unten, die stärker ist, um die Wahrscheinlichkeit eines Bruchs zu minimieren.
19. Gießen Sie Wasser ab, tauchen Sie das Gel in eine ausreichende Menge Coomassie GelCode Blue Fleckenreagenz und inkubieren Sie für 1 h auf einem Orbital / Rocker bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Mischen Sie die Blue Stain Reagenz (Table of Materials) Lösung vor Gebrauch, indem Sie die Flasche mehrmals vorsichtig schwenken.
20. Dekantieren Sie die Farbstofflösung, fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, spülen Sie es mehrmals mit Wasser ab und legen Sie dann das Orbital / die Wippe zur Entfärbung auf.
    HINWEIS: Legen Sie ein Stück Schwamm (~ 3 cm x 0,5 cm) in den Gel-Entfärbungsbehälter und lassen Sie das Gel für die Entfärbung über Nacht stehen. Der Schwamm adsorbiert die Farbstoffpartikel, ohne dass mehrere Wasserwechsel erforderlich sind.
21. Analysieren Sie das Gel in einem Bildanalysator.

5. Mitochondria Superkomplex Bewertung durch Immunoblot Blot Analyse

1. Führen Sie einen neuen Satz BN-PAGE durch, ohne das Gel am Ende der Elektrophorese zu färben.
2. Befolgen Sie das gleiche Verfahren wie in Abschnitt 3 (Bewertung des mitochondrialen Elektronentransferkomplexes (ETC), um das Immunoblotting abzuschließen.

Ergebnisse

Nach dem Protokoll wurde eine gute Ausbeute an mit Mitochondrien angereicherter Proteinmischung aus Herzgewebe hergestellt. Etwa 15 mg/ml mit Mitochondrien angereicherte Proteinmischung wurden aus durchschnittlich 1,2 g gefrorenem Herzgewebe gewonnen, das von den Nachkommen der Sau geerntet wurde. Beobachtungen zeigten, dass weniger als 0,5 g gefrorenes Herzgewebe keine ausreichende Menge an mitochondrial angereicherter Proteinmischung ergaben, um einen BN-PAGE-Assay durchzuführen. Die Menge des mitochondrialen Präparats...

Diskussion

Die kritischen Schritte für dieses Protokoll sind hier angegeben. Erstens sollte die Gewebehomogenisierung sorgfältig gehandhabt werden, damit während des Gewebehomogenisierungsprozesses keine übermäßigen reinen Effekte angewendet werden. Es sollte ein Gewebezerkleinerer verwendet werden, der Teil der Druckzyklustechnologie (PCT) für die anfängliche Gewebehomogenisierung ^ist9. Dieser Schritt reduziert den übermäßigen Schlaganfallzyklus eines Glas-auf-Glas-Homogenisators (Abbil...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Amino-Capronsäure	Sigma/Aldrich	A2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos Komplex Kit	Invitrogen	458199
Anti-VDAC Antikörper	abcam	ab15895	verwenden 1 & micro; g/mL
Coomassie G-250	ThermoSientific	20279
Coomassie GelCode Blue	ThermoScientific	24592
Digitonin	Cabiochem	300410
Glas-Glas-Stößel-Homogenisator	VWR	KT885451-0020
Image Studio	LICOR
IR-Farbstoff konjugierter Anti-Kaninchen-Ab	LICOR	LC0725
Multiwell-Plattenleser	BioTek	Synergy HT
Nativer Molekulargewichtsmarker	ThermoFisher	BN2001
Nylon-Mesh-Monofilament	Small Part Inc	CMN-74
Orbitalschüttler	ThermoScientfic
PCT Shredder	Pressure Bioscience Inc
SEA BLOCK Blockierungspuffer	ThermoScienctific	37527
Aktenvernichter PULSE Tube	Pressure Bioscience Inc	FT500-PS
Tischzentrifuge	Eppendorf	5418
Trypsin	Amresco	M150-1G
Trypsin-Inhibitor	Amresco	M191-1G	Erfordert eine frische Zubereitung