Method Article

Formulierung und akustische Modulation von optisch verdampften Perfluorcarbon-Nanotröpfchen

DOI:

10.3791/62814

⸱

July 16th, 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optisch aktivierte Perfluorcarbon-Nanotröpfchen sind vielversprechend in bildgebenden Anwendungen außerhalb des Gefäßsystems. Dieser Artikel zeigt, wie diese Partikel synthetisiert, Polyacrylamidphantome vernetzt und die Tröpfchen akustisch moduliert werden, um ihr Signal zu verstärken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobläschen sind das am häufigsten verwendete bildgebende Kontrastmittel im Ultraschall. Aufgrund ihrer Größe sind sie jedoch auf Gefäßkompartimente beschränkt. Diese Mikrobläschen können kondensiert oder als Perfluorkohlenstoff-Nanotröpfchen (PFCnDs) formuliert werden, die klein genug sind, um zu extravasieren und dann akustisch an der Zielstelle ausgelöst zu werden. Diese Nanopartikel können durch die Aufnahme eines optischen Absorbers wie organischer Farbstoff im nahen Infrarot oder Nanopartikel (z. B. Kupfersulfid-Nanopartikel oder Goldnanopartikel / Nanostäbchen) weiter verbessert werden. Optisch markierte PFCnDs können durch Laserbestrahlung in einem Prozess verdampft werden, der als optische Tröpfchenverdampfung (ODV) bekannt ist. Dieser Aktivierungsprozess ermöglicht die Verwendung von Perfluorkohlenstoffkernen mit hohem Siedepunkt, die unter der maximalen mechanischen Indexschwelle für die diagnostische Bildgebung nicht akustisch verdampft werden können. Kerne mit höherem Siedepunkt führen zu Tröpfchen, die nach der Verdampfung wieder kondensieren, was zu "blinkenden" PFCnDs führt, die nach der Verdampfung kurz Kontrast erzeugen, bevor sie wieder in Nanotröpfchenform kondensieren. Dieser Vorgang kann wiederholt werden, um bei Bedarf Kontrast zu erzeugen, was eine hintergrundfreie Bildgebung, Multiplexing, Superauflösung und Kontrastverstärkung durch optische und akustische Modulation ermöglicht. Dieser Artikel zeigt, wie optisch triggerbare PFCnDs mit Lipidhülle unter Verwendung von Sondenbeschallung synthetisiert, Polyacrylamidphantome zur Charakterisierung der Nanotröpfchen erzeugt und die PFCnDs nach ODV akustisch moduliert werden, um den Kontrast zu verbessern.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobläschen sind aufgrund ihrer Biokompatibilität und ausgezeichneten Echogenität im Vergleich zu Weichteilen das am weitesten verbreitete Ultraschallkontrastmittel. Dies macht sie zu wertvollen Werkzeugen zur Visualisierung des Blutflusses, der Organabgrenzung und anderer Anwendungen1. Ihre Größe (1-10 μm), die sie aufgrund ihrer Resonanzfrequenz für die Bildgebung außergewöhnlich macht, beschränkt ihre Anwendungen jedoch auf das Gefäßsystem2.

Diese Einschränkung hat zur Entwicklung von PFCnDs geführt, bei denen es sich um Nanoemulsionen handelt, die aus einem Tensid bestehen, das um einen flüssigen Perfluorkohlenstoffkern herum eingeschlossen ist. Diese Nanopartikel können in Größen von nur 200 nm synthetisiert werden und sind so konzipiert, dass sie "undichte" Gefäße oder Poren und offene Fensteröffnungen in Tumorgefäßen nutzen. Während diese Störungen tumorabhängig sind, ermöglicht diese Permeabilität eine Extravasation von Nanopartikeln von ~200 nm - 1,2 μm je nach Tumor 3,4. In ihrer Ausgangsform erzeugen diese Partikel wenig bis gar keinen Ultraschallkontrast. Nach der Verdampfung - akustisch oder optisch induziert - wechselt die Kernphase von flüssig zu gasförmig, wodurch eine zweieinhalb- bis fünffache Vergrößerung des Durchmessersum 5,6,7 induziert wird und ein photoakustischer und Ultraschallkontrast erzeugt wird. Während die akustische Verdampfung die gebräuchlichste Aktivierungsmethode ist, erzeugt dieser Ansatz akustische Artefakte, die die Abbildung der Verdampfung einschränken. Darüber hinaus benötigen die meisten Perfluorkohlenwasserstoffe fokussierten Ultraschall mit einem mechanischen Index jenseits der Sicherheitsschwelle, um zu verdampfen8. Dies hat zur Entwicklung von PFCnDs mit niedrigerem Siedepunkt geführt, die durch Kondensieren von Mikrobläschen zu Nanotröpfchen synthetisiert werden können9. Diese Tröpfchen sind jedoch flüchtiger und unterliegen einer spontanen Verdampfung10.

Die optische Tröpfchenverdampfung (ODV) hingegen erfordert die Zugabe eines optischen Triggers wie Nanopartikel 11,12,13 oder Farbstoff 6,14,15 und kann Perfluorkohlenwasserstoffe mit höherem Siedepunkt unter Verwendung von Fluenzen innerhalb der ANSI-Sicherheitsgrenze 11 verdampfen. PFCnDs, die mit Kernen mit höherem Siedepunkt synthetisiert werden, sind stabiler und kondensieren nach der Verdampfung wieder, was eine hintergrundfreie Bildgebung16, Multiplexing 17 und eine Superauflösung18 ermöglicht. Eine der Haupteinschränkungen dieser Techniken ist die Tatsache, dass PFCnDs mit hohem Siedepunkt nach der Verdampfung nur für einen kurzen Zeitraum auf der Skala vonMillisekunden 19 echogen sind und relativ schwach sind. Während dieses Problem durch wiederholte Verdampfungen und Mittelwertbildung gemildert werden kann, bleibt die Erkennung und Trennung des Tröpfchensignals eine Herausforderung.

Inspiriert von der Pulsinversion können Dauer und Kontrast durch Modifizierung der Phase des Ultraschallbildpulses19 erhöht werden. Durch den Start des Ultraschall-Bildgebungspulses mit einer Verdünnungsphase (n-Puls) erhöht sich sowohl die Dauer als auch der Kontrast der verdampften PFCnDs. Im Gegensatz dazu führt das Starten des Ultraschallbildpulses mit einer Kompressionsphase (p-Puls) zu einem reduzierten Kontrast und einer kürzeren Dauer. Dieser Artikel beschreibt, wie optisch triggerbare Perfluorcarbon-Nanotröpfchen, Polyacrylamid-Phantome, die üblicherweise in der Bildgebung verwendet werden, synthetisiert werden können, und demonstriert Kontrastverstärkung und verbesserte Signallanglebigkeit durch akustische Modulation.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Perfluorkohlenstoff-Nanotröpfchen-Formulierung

  1. Spülen Sie einen 10-ml-Rundkolben mit Chloroform aus und waschen Sie eine gasdichte 10-μL- und 1-ml-Glasspritze mit Chloroform aus, indem Sie das gesamte Spritzenvolumen wiederholt absaugen und insgesamt dreimal ausstoßen.
    ACHTUNG: Chloroform ist flüchtig und kann beim Einatmen giftig sein. Alle Arbeiten mit diesem Lösungsmittel sollten in einem Abzug durchgeführt werden.
  2. Mit den Spritzen werden 200 μL DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC, 25 mg/ml) und 1 ml IR 1048 (1 mg/ml in Chloroform) in den Rundkolben gegeben. Denken Sie daran, die Spritzen zwischen Lipiden / Farbstoffen zu reinigen, um eine Kontamination des Stoffes zu vermeiden.
    HINWEIS: Infrarotfarbstoffe sind lichtempfindlich und die Arbeit sollte unter schlechten Bedingungen durchgeführt werden oder Kolben sollten mit Aluminiumfolie bedeckt sein.
  3. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer. Stellen Sie sicher, dass das Vakuum langsam auf 332 mbar eingestellt wird, um Stöße zu vermeiden. Reduzieren Sie nach 5 Minuten den Druck auf 42 mbar, um eventuell in die Lösung eingedrungenes Wasser zu entfernen.
    HINWEIS: Der Lipidkuchen kann über Nacht in einem runden Bodenkolben gelagert werden, der mit Parafilm bedeckt ist, bei 4 °C.
  4. Suspendieren Sie den Lipidkuchen in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und beschallen oder wirbeln Sie bei Raumtemperatur für 5 min oder bis der gesamte Lipidkuchen suspendiert und in der Lösung gelöst wurde. Beschallen Sie für weitere 2 Minuten, um die Lösung zu homogenisieren.
  5. Die Lösung wird in eine Durchstechflasche aus 7-ml-Glas gegeben und die Durchstechflasche in eine mit Eis gefüllte Glasschale gegeben, damit die Lösung 5 Minuten lang abkühlen kann, bevor 50 μl Perfluorhexan mit einer gasdichten Glasspritze hinzugefügt werden. Denken Sie daran, die Spritze mit Perfluorhexan auszuspülen, bevor Sie sie in die Durchstechflasche geben.
  6. Legen Sie die Durchstechflasche aus Glas mit den Lipiden und dem Eisbad in das Sondenbeschallgehäuse und tauchen Sie die Sondenspitze unter den Miniskus. Stellen Sie sicher, dass die Seiten der Ultraschallsonde den Rand der Durchstechflasche aus Glas nicht berühren.
  7. Sonde beschallen Sie die Mischung mit den folgenden Einstellungen: Amplitude 1, Prozesszeit: 20 s, Pulse-On: 1s, Pulse-off: 5s. Dann beschallen Sie mit den folgenden Einstellungen: Amplitude: 50, Prozesszeit: 5 s, Pulse-on: 1 s, Pulse-off: 10 s.
  8. Die Nanotröpfchenlösung wird in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 3 min lang bei 300 x g zentrifugiert, um die größeren Tröpfchen (>1 μm) von kleineren Tröpfchen zu trennen.
  9. Entsorgen Sie das Pellet und geben Sie den Überstand in ein anderes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie den Überstand durch Zentrifugieren bei 3000 x g für 5 Minuten, um alle Tröpfchen in Lösung zu pelletieren. Resuspendieren Sie die PFCnDs in 1 ml PBS, indem Sie das Pellet auf und ab pipettieren und dann in einem Badesonikator für 1 Minute beschallen.
  10. Messen Sie die Größe der Tröpfchen mit dynamischer Lichtstreuung (DLS). Verdünnen Sie die PFCnD-Bestände um das 100-fache (10 μL PFCnD-Bestand in 990 μL PBS) und baden Sie Ultraschall, um die PFCnDs vor der Messung zu dispergieren. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt.
  11. Bestimmen Sie die Konzentration der PFCnDs mit dem Nanopartikel-Tracking-Analysator (siehe Materialtabelle). Verdünnen Sie die PFCnDs um das 100- bis 1000-fache, um eine genaue Messung der Konzentration zu gewährleisten. Das Protokoll liefert typischerweise Tröpfchen in einer Konzentration in der Größenordnung von 1010 Partikeln / ml.
  12. Bereiten Sie 10 ml Ultraschall-Kopplungsgel in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen vor und fügen Sie 1% (v / v) oder 100 μL PFCnDs hinzu, um eine Lösung von ~ 108 Partikeln / ml herzustellen. Wirbeln Sie die zu mischende Lösung. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 4000 x g für 3 min, um Blasen zu entfernen.

2. Polyacrylamid-Phantompräparation

  1. Entgasen Sie Wasser, indem Sie einen 500-ml-Isolierkolben mit 400 ml entionisiertem Wasser füllen, mit einem Gummikorken verschließen und den Kolben an die Vakuumleitung anschließen. Öffnen Sie die Vakuumleitung und tauchen Sie den Boden des Kolbens in den Badsonikator. 5 min beschallen oder bis keine Gasblasenbildung sichtbar ist.
  2. Bereiten Sie 10% ige Ammoniumpersulfat (APS) -Lösung durch Auflösen von 500 mg in 5 ml entgastem Wasser vor. Schwenken Sie die Lösung vorsichtig, wenn sich das Ammoniumpersulfat nicht vollständig auflöst.
  3. In einem 400-ml-Becherglas mit einem Rührbalken auf einer Rührplatte werden 150 ml entgastes Wasser und 50 ml 40% (w/v) Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung zu 200 mL 10%iger Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung gegeben. Rühren Sie die Mischung bei 200 U/min, um das richtige Mischen ohne Blasen zu ermöglichen.
    ACHTUNG: Acrylamid ist ein Karzinogen, und alle Arbeiten sollten in einem Abzug mit Handschuhen durchgeführt werden, insbesondere wenn mit Acrylamid in Pulverform gearbeitet wird.
  4. 400 mg Kieselsäure werden abgewogen und zu der 10%igen Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung aus Schritt 2.3 gegeben, um eine 0,2 %(w/v) Siliciumdioxid- und Acrylamidlösung zu bilden.
    VORSICHT: Kieselsäure kann beim Einatmen krebserregend sein. Alle Arbeiten, einschließlich des Wiegens, sollten in einem Abzug durchgeführt werden.
  5. Bereiten Sie eine 58 mm x 58 mm x 78 mm große quadratische Form mit zylindrischem Einschluss vor, indem Sie die Spitzen einer Kunststofftransferpipette abschneiden und mit Laborband in der Form abstützen. Siehe Abbildung 2.
  6. 2 ml 10%ige APS-Lösung in das Becherglas geben, um eine Endkonzentration von 0,1% APS zu erhalten, und 250 μL Tetramethylethylendiamin (TEMED) in die Phantomlösung geben. Lassen Sie die Lösung kurz umrühren (weniger als eine Minute).
  7. Gießen Sie die Lösung schnell in die Form und achten Sie darauf, keine Luftblasen in die Lösung einzuführen. Die Lösung sollte innerhalb von 10 min polymerisieren. Entfernen Sie das Phantom, indem Sie das flache Ende eines Laborspatels um den Rand der Form laufen lassen und die Form umkehren.
    HINWEIS: Diese Phantome können mehrfach wiederverwendet werden und sollten in Wasser getaucht und bei 4°C gelagert werden.

3. Perfluorkohlenstoff-Nanotröpfchen-Bildgebung

  1. Schalten Sie das gepulste Lasersystem ein und erwärmen Sie es für ~20 Minuten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie sicher, dass das faseroptische Bündel ordnungsgemäß mit dem Laserausgang verbunden ist und die beiden Beine ordnungsgemäß im Faserbündelhalter platziert sind.
  2. Schalten Sie das Ultraschallbildgebungssystem ein, schließen Sie den Array-Bildgebungswandler (L11-4v) an das System an und befestigen Sie den Schallkopf in der Halterung, um seine Bildebene mit dem Laserquerschnitt auszurichten.
  3. Stellen Sie die Pulswiederholfrequenz des Lasersystems auf 10 Hz ein und platzieren Sie ein Powermeter am Ende des Faserbündels, um die Energie zu messen. Stellen Sie die Q-Switch-Verzögerung ein, bis die geschätzte Fluenz 70 mJ/cm2 beträgt.
    ACHTUNG: Beim Abfeuern des Lasers muss eine geeignete Brille getragen werden und Laservorhänge müssen den Raum umschließen.
  4. Verfüllung eines der Kanäle im Polyacrylamidphantom mit dem Ultraschallgel/PFCnD-Gemisch mit einer 1-ml-Kunststoff-Sliptip-Spritze. Bedecken Sie die Oberseite des Kanals großzügig mit Ultraschallgel und entfernen Sie alle Blasen mit einer 1-ml-Kunststoffspritze. Platzieren Sie das Polyacrylamidphantom unter dem Wandler und dem Faserbündel, wie in Abbildung 3 dargestellt.
  5. Verwenden Sie die kombinierte Laserultraschall- und Elastizitätsplattform (CLUE), die auf der Software20 basiert, um PFCnD synchronisiert mit optischer Aktivierung abzubilden. Ändern Sie die allgemeinen benutzerdefinierten Parameter in der Param-Struktur für die Bildgebung: Stellen Sie die Start-/Endtiefe auf 0/40 mm, die Mittenfrequenz auf 6,9 MHz und den Wandlernamen auf "L11-4v" ein.
  6. Definieren Sie einen neuen RunCase und entwerfen Sie eine Modulsequenz für wiederholte optische Aktivierung/Rekondensation und US-Bildgebung von PFHnDs. Dies geschieht durch die Auflistung vordefinierter Module wie Ultrafast Imaging (mUF), externer Laser (mExtLaser) und Idle (mIdle).
    1. Wiederholen Sie den Sequenzsatz mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF zweimal, um sowohl n-Puls- als auch p-Puls-Bilddaten zu erfassen.
      HINWEIS: Das erste mExtLaser-Modul in jeder Sequenz wird als Scheinlaser eingestellt, indem ExtLaser.Enable auf 0 gesetzt wird, und der 'mIdle' ist enthalten, um die Zeit zwischen US-Hintergrundbildern und den n/p-Puls-US-Bildern nach Laseraktivierung zu minimieren.
  7. Legen Sie Modulparameter für jedes Modul fest, das in der Modulsequenz des aktuellen Ausführungsfalls platziert wird. Greifen Sie auf jeden Modulparameter über einen Index zu, der seiner Reihenfolge in der Modulreihenfolge entspricht. Module führen vordefinierte Operationen mit Modulparametern aus, die hier vom Benutzer festgelegt werden.
    1. Stellen Sie ExtLaser.QSdelay in externen Lasermodulen auf den Wert der in Schritt 3.3 abgestimmten Laser-Q-Switch-Verzögerung in Mikrosekunden ein. Dieses Modul wartet auf den Blitzlampenauslöser des Lasersystems und erzeugt den Q-Switch-Trigger nach der in QSdelay angegebenen Verzögerung.
    2. Legen Sie im ultraschnellen Bildgebungsmodul Resource.numFrame auf 100, SeqControl.PRI auf 200 (μs) und TW.polarity auf 1 für P-Puls und -1 für N-Puls fest (siehe Abbildung 4 für die entsprechende Pulsform). Dieses Modul sendet ultraschnelle 0-Grad-Planarwellen mit dem in TW.polarity angegebenen Pulstyp.
      1. Erfassen Sie ein Bildfenster mit voller Blende von 38,8 mm Breite für die Anzahl der Frames in Resource.numFrame, das Pulswiederholungsintervall von SeqControl.PRI und speichern Sie dann Daten für die Offline-Verarbeitung.
    3. Stellen Sie SeqControl.lastPRI_Module im Leerlaufmodul auf die Zeitspanne zwischen den Laserpulsen (100 ms) ein, subtrahiert durch Q-Switch-Verzögerung, Bilddatenerfassungszeit (20 ms) und einen Spielraum von 20 μs für die Übertragung des Signals. Dieses Modul hält das System für die Zeit im Zustand "Kein Betrieb", SeqControl.lastPRI_Module die Zeitlücke zwischen dem Ende der Bilddatenerfassung und der nächsten Laserpulsanregung zu schließen.

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Results

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Eine erfolgreiche Formulierung und zentrifugale Trennung der PFCnDs sollte Tröpfchen mit einem Durchmesser von 200-300 nm ergeben (Abbildung 1A). Unsachgemäß getrennte Tröpfchen können kleine Peaks um 1 μm aufweisen. Diese Lösungen können weiter beschallt werden, um die größeren Tröpfchen aufzubrechen. Die Größe der Tröpfchen nimmt im Laufe der Zeit aufgrund von Koaleszenz und/oder Diffusion in einem Prozess zu, der als Ostwaldreifung bekannt ist21,22

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Sondenbeschallung ist eine relativ einfache und leicht zu erlernende Methode zur Herstellung von PFCnDs. Es gibt ein paar Schritte, bei denen Vorsicht geboten ist. Beim Umgang mit Chloroform ist es unerlässlich, dass eine Verdrängerpipette oder Glasspritzen verwendet werden, da diese flüchtig ist und aus Standard-Luftverdrängerpipetten "ausläuft". Wenn Sie eine positive Verschiebung verwenden, stellen Sie außerdem sicher, dass eine geeignete Spitze verwendet wird, da Chloroform die meisten Kunststoffspitzen auflöst, ...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Die Arbeit wurde teilweise von der Breast Cancer Research Foundation im Rahmen des Zuschusses BCRF-20-043 unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ammoniumpersulfat (APS)VWR97064-592
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC)Avanti Polare Lipide850365CLipide, diese können in Chloroform oder in Pulverform suspendiert erworben werden. Für die Langzeitlagerung ist die Pulverform am besten, aber Chloroform ist praktischer.
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz) (DSPE-PEG)Avanti Polare Lipide880120CLipide, diese können in Chloroform oder in Pulverform suspendiert erworben werden. Für die Langzeitlagerung ist die Pulverform am besten, aber Chloroform ist praktischer.
Acrylamid : Bisacrylamid-Lösung (19:1) 40% (w/v), OmniPur®VWREM-1300Acrylamidlösung, niedrigere Konzentration/ Pulver
IR-1048Sigma405175Infrarotfarbstoff
L11-4vVerasonics-UltraschallLinearer Array-Wandler
Mikrospitze 1/8"Qsonica LLC4418Mikrospitze für Sonden-Ultraschallgerät
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylendiamin (TEMED)VWR97064-902Wird verwendet, um Polyacrylamid durch Bildung von freien Radikalen in Gegenwart von Ammoniumpersulfat zu polymerisieren
Nova IIOphir-Spiricon7Z01550Laserleistungsmesser
PerfluorhexanFluoromedAPF-60MPerfluorkohlenstoffflüssigkeit
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) TablettenVWR97062-732Tabletten zur Herstellung von PBS
Q500Qsonica LLCQ500-110Sonden-Ultraschallgerät
KieselgelSigma-Aldrich2885002-25 μ m Partikelgröße
Tempest 30New WaveResearch-Gepulstes Lasersystem
Vantage 128Verasonics-Forschungs-Ultraschallbildgebungssystem
Zetasizer Nano ZSMalvern Instruments Ltd-FührtGrößenmessungen auf der Grundlage dynamischer Lichtstreuung durch

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