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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Construction de membranes lipidiques modèles incorporant des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)

Published: February 5, 2022 doi: 10.3791/62830
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole utilise le gonflement de l’agarose comme une technique puissante et généralisable pour incorporer des protéines membranaires intégrales (PIM) dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (GUV), comme décrit ici pour la reconstitution de la protéine réceptrice de la sérotonine 1A humaine (5-HT1AR), l’une des classes de récepteurs couplés à la protéine G pharmacologiquement importants.

Abstract

Des recherches in vitro robustes sur la structure et la fonction des protéines membranaires intégrales ont été un défi en raison de la complexité de la membrane plasmique et des nombreux facteurs qui influencent le comportement des protéines dans les cellules vivantes. Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont un système de modèle in vitro biomimétique et hautement accordable pour étudier les interactions protéine-membrane et sonder le comportement des protéines d’une manière précise et dépendante du stimulus. Dans ce protocole, nous présentons une méthode peu coûteuse et efficace pour fabriquer des GUV avec le récepteur humain de la sérotonine 1A (5-HT1AR) intégré de manière stable dans la membrane. Nous fabriquons des GUV en utilisant une méthode de gonflement d’hydrogel modifiée; en déposant un film lipidique sur un mélange d’agarose et de 5-HT1AR puis en hydratant l’ensemble du système, des vésicules peuvent être formées avec du 5-HT1AR correctement orienté et fonctionnel incorporé dans la membrane. Ces GUV peuvent ensuite être utilisés pour examiner les interactions protéine-membrane et le comportement de localisation par microscopie. En fin de compte, ce protocole peut faire progresser notre compréhension de la fonctionnalité des protéines membranaires intégrales, fournissant un aperçu physiologique profond.

Introduction

Les membranes modèles synthétiques sont des outils puissants dans l’étude des propriétés et des fonctions fondamentales des biomembranes. Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont l’une des plates-formes les plus importantes pour étudier une variété de propriétés de la membrane plasmique et peuvent être conçues pour imiter différentes conditions physiologiques1,2,3,4,5,6,7,8. Il est bien établi que la membrane plasmique et son organisation jouent un rôle clé dans une multitude de processus cellulaires, tels que la transduction du signal, l’adhésion, l’endocytose et le transport9,10,11,12,13,14,15.

Les GUV ont été fabriqués à l’aide de diverses méthodes, notamment l’hydratation douce16, le gonflement de l’hydrogel17, l’électroformation18, les techniques microfluidiques19,20,21,22, le jet23 et l’échange de solvant24,25,26. En raison des difficultés rencontrées dans la manipulation des protéines membranaires intégrales (PIM), les plateformes in vitro pour les étudier ont été limitées. Les GUV présentent une plate-forme simplifiée pour étudier les PIM dans un environnement qui imite leur environnement natif. Bien qu’il y ait eu plusieurs approches pour la reconstitution des protéines dans les GUV, l’incorporation de protéines avec l’orientation correcte et le maintien de la fonctionnalité des protéines27 posent des défis.

La reconstitution protéique la plus réussie dans les GUV nécessite la méthode d’échange de détergent; qui consiste à solubiliser les protéines de leur environnement natif par des détergents, puis à les purifier, puis à remplacer les molécules de détergent par des lipides par diverses méthodes28. Alors que les détergents servent à stabiliser la structure tertiaire des PIM lors de la purification, les micelles de détergent sont un environnement relativement peu naturel pour ces protéines, qui sont mieux stabilisées, en particulier pour les études fonctionnelles, dans les bicouches lipidiques28,29,30. De plus, l’incorporation de protéines transmembranaires fonctionnelles dans la bicouche lipidique à l’aide des techniques traditionnelles de fabrication guV a été difficile en raison de la taille, de la délicatesse de ces protéines et des étapes supplémentaires d’échange de détergent qui seraient nécessaires27,31,32,33. L’utilisation de solvant organique pour éliminer les détergents provoque l’agrégation et la dénaturation des protéines34. Une méthode améliorée médiée par un détergent a été prometteuse, mais la prudence est nécessaire pour l’étape d’élimination du détergent et une optimisation pourrait être nécessaire pour des protéines spécifiques31,35. De plus, les méthodes qui utilisent l’électroformation pourraient restreindre le choix des protéines et peuvent ne pas convenir à toutes les compositions lipidiques, en particulier les lipides chargés31,36,37. Une autre technique qui a été utilisée est la fusion induite par les peptides de grandes vésicules unilamellaires (LUV) contenant la protéine souhaitée avec des GUV, bien qu’elle se soit avérée laborieuse et puisse conduire à l’insertion de molécules étrangères - les peptides fusogéniques33,38,39. Les vésicules géantes de la membrane plasmique (GPMV), qui sont dérivées de cellules vivantes, peuvent être utilisées pour surmonter certains de ces problèmes, mais elles permettent un contrôle minimal de la composition lipidique et protéique résultante14,40,41. Par conséquent, l’intégration des PIM dans la couche bilipidique des GUV à l’aide de notre méthode de gonflement de l’agarose modifiée présente une méthode fiable pour examiner plus en détail ces protéines dans l’environnement membranaire42,43,44,45.

La signalisation et la communication cellulaires impliquent une famille de protéines connues sous le nom de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG); Les RCPG font partie de la plus grande famille de protéines et sont associés à la modulation de l’humeur, de l’appétit, de la pression artérielle, de la fonction cardiovasculaire, de la respiration et du sommeil parmi de nombreuses autres fonctions physiologiques46. Dans cette étude, nous avons utilisé le récepteur humain de la sérotonine 1A (5-HT1AR) qui est un membre prototypique de la famille gpCR. 5-HT1AR peut être trouvé dans le système nerveux central (SNC) et les vaisseaux sanguins; il influence de nombreuses fonctions telles que les fonctions cardiovasculaires, gastro-intestinales, endocriniennes, ainsi que la participation à la régulation de l’humeur47. Un obstacle important à la recherche sur les RCPG découle de leur structure amphiphile complexe, et les GUV représentent une plate-forme prometteuse pour l’étude de diverses propriétés d’intérêt, allant de la fonctionnalité des protéines, des interactions lipides-protéines et des interactions protéine-protéine. Diverses approches ont été utilisées pour étudier les interactions lipides-protéines telles que la résonance plasmonique de surface (SPR)48,49, la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)50,51, le test de superposition de protéines lipidiques (PLO)51,52,53,54, la spectrométrie de masse native55, la calorimétrie de titrage isotherme (ITC)56,57 et le liposome essai de sédimentation58,59. Notre laboratoire a utilisé l’approche GUV simplifiée pour étudier l’effet des interactions lipides-protéines sur la fonctionnalité des protéines en incapsulant BODIPY-GTPγS, qui se lie à la sous-unité Giα à l’état actif du récepteur. Leur liaison désenclenche le fluorophore produisant un signal de fluorescence qui pourrait être détecté au fil du temps45. De plus, diverses études ont étudié les interactions lipides-protéines et le rôle des protéines dans la détection ou la stabilisation de la courbure de la membrane60,61, et l’utilisation d’une approche GUV réalisable pourrait être un avantage clé.

Ce protocole démontre une méthode simple pour incorporer des RCPG dans la membrane des GUV à l’aide d’un système d’hydrogel d’agarose modifié17,42. De plus, sur la base de nos travaux antérieurs, notre méthode pourrait convenir aux PIM qui peuvent supporter une exposition à court terme à 30-40 ° C. En bref, nous étalons un mince film d’agarose combiné à des fragments de membrane contenant le RCPG d’intérêt. Suite à la gélification de cette couche, nous déposons une solution lipidique sur l’agarose et permettons au solvant de s’évaporer. La réhydratation du système a ensuite été réalisée avec un tampon aqueux, entraînant la formation de GUV avec des protéines incorporées dans la bicouche lipidique.

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Protocol

1. Marquage des protéines

  1. Laissez le NHS-Rhodamine, les fragments de membrane 5-HT1A et une colonne de dessalement de spin de 7 K MWCO s’équilibrer à température ambiante.
  2. Dissoudre 1 mg de NHS-rhodamine dans 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
  3. Ajouter 5 μL de solution de bicarbonate de sodium 1 M pour augmenter le pH de la solution 5-HT1AR à pH 8.
  4. Ajouter 3,66 μL de la solution de NHS-rhodamine à 50 μL de la solution 5-HT1AR et pipeter doucement de haut en bas dans un tube de microcentrifugation.
    REMARQUE: Assurez-vous d’avoir au moins 10x l’excès molaire de NHS-rhodamine.
  5. Gardez le mélange à l’abri de la lumière et mettez le rotateur à température ambiante pendant 1 h.
  6. Lavez une colonne de spin MWCO de 7 k avec 200 μL de solution saline tampon phosphate 1x (1x PBS) trois fois pendant 1,5 min à 1,5 RCF pour chaque lavage.
  7. Ajouter la protéine marquée à une colonne et équilibrer la quantité dans un autre tube de microcentrifugation.
  8. Faites tourner la protéine marquée une fois pendant 5 minutes à 1,5 FCR.
  9. Prenez un spectre UV-vis à l’aide d’un spectrophotomètre nanodrop à 280 nm et 554 nm et calculez l’efficacité d’étiquetage en suivant le manuel du fabricant.
  10. Conserver la protéine étiquetée couverte à 5 °C jusqu’à une utilisation ultérieure. La solution est stable pendant environ une semaine après l’étiquetage.

2. GUV avec membrane incorporée 5-HT 1A

  1. Préparation des matériaux et des réactifs
    1. Laissez la protéine, les lipides et la BSA (albumine sérique bovine) s’équilibrer à la température ambiante.
    2. Pendant ce temps, nettoyez les couvercles en les plaçant dans du méthanol et en les sonifiant pendant 30 min à 40 °C. Assurez-vous que le méthanol recouvre complètement les couvercles et que le niveau d’eau dans le bain-marie est supérieur au niveau du méthanol dans le récipient.
      REMARQUE: Le méthanol est toxique et doit être manipulé dans une hotte chimique appropriée.
    3. Séchez l’excès de méthanol sur les couvercles avec un léger courant d’air. Placez la grille à couvercle recouvert d’un four à 40 °C pendant 15 min pour vous assurer que les couvercles excédentaires sèchent.
    4. Commencez le processus de nettoyage au plasma. Tout d’abord, placez les couvercles dans le nettoyeur plasma et fermez la soupape d’admission d’air pour évacuer tout l’air à l’intérieur de la chambre.
    5. Une fois que la chambre est sous vide, nettoyez les couvercles pendant 5 minutes en utilisant un réglage de puissance RF élevé et un vide presque complet, avec seulement une légère entrée d’air dans la chambre à vide. Pour assurer le bon niveau de plasma, ajustez l’ouverture de la chambre à vide de manière à ce que la couleur résultante du plasma soit d’un rose vif et stable.
      REMARQUE: Il est crucial lors de l’utilisation de l’air que le plasma reste de couleur rose vif pendant toute la durée de l’étape de traitement au plasma, car une couleur violette plus foncée indique qu’il y a une quantité incorrecte d’air dans la chambre et entraînera un traitement au plasma sous-optimal.
    6. Une fois les 5 minutes écoulées, coupez l’alimentation RF et relâchez le vide.
      REMARQUE: Lors du retrait de la chambre à plasma, veuillez vous assurer que les couvercles restent couverts.
  2. Préparation d’hydrogel
    1. Combiner 6 mg d’agarose à très basse température de fusion avec 300 μL d’eau ultrapure (c.-à-d. 2 % (p/v) d’agarose).
      REMARQUE: 2% d’agarose sera utilisé pour fabriquer des GUV sans protéines. La solution d’agarose peut être conservée à 45 °C pendant deux jours.
    2. Mélanger 9 mg d’agarose à ultra-basse température avec 300 μL d’eau ultrapure pour 3 p/v% d’agarose par préparation à l’étape 3.1. 3% d’agarose sera utilisé pour fabriquer des GUV incorporés aux protéines.
    3. Vortex la solution brièvement avant de la placer sur le bloc thermique de 90 °C pendant 10 min. Ensuite, vortexez à nouveau le tube avant de le transférer dans un bloc thermique de 45 ° C pour le maintenir sous forme fondue jusqu’à une utilisation ultérieure.
  3. Agarose et mélange de protéines
    1. Mélanger 21 μL d’agarose à 3 % avec les 7 μL de fragments de membrane 5-HT1AR. Pipettez lentement de haut en bas plusieurs fois pour assurer un mélange adéquat. Ensuite, incuber à 45 °C pendant 1 min.
  4. Hydrogel et dépôt lipidique
    1. Pour les GUV sans protéines : Faites un film mince sur des couvercles fraîchement nettoyés au plasma en utilisant 20 μL d’agarose à 2 %. Déposez rapidement un autre couvercle sur le dessus de la gouttelette d’agarose et faites glisser doucement les couvercles pour former un film mince sur les deux couvercles.
      REMARQUE: Cette étape est délicate en ce sens que le glissement de la gouttelette doit se produire alors que l’agarose est encore sous forme fondue.
    2. Pour les GUV incorporés aux protéines : Pipettez le mélange protéine/agarose de haut en bas une fois de plus, puis déposez 20 μL de l’agarose à 2 % sur un couvercle nettoyé au plasma. Suivez les instructions de coulée par glissement décrites ci-dessus.
    3. Laisser l’agarose geler à l’abri de la lumière pendant 30 min à température ambiante.
    4. Déposez les lipides goutte à goutte sur le dessus de la couche d’agarose. Utiliser un total de 10 μL de 2 mg/mL de 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) avec 0,4 Mol% de 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine (DPPE) marqué avec ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (ou mélange lipidique d’intérêt) dans le chloroforme sur le film d’agarose. Déposez les gouttelettes à l’aide d’une aiguille de chromatographie en phase gazeuse et étalez une gouttelette à la fois via un flux d’air doux.
      REMARQUE: La prudence est nécessaire avec cette étape pour faire une couche relativement uniforme de lipides sur le dessus de l’hydrogel. En outre, le chloroforme est toxique et doit être manipulé dans une hotte chimique appropriée.
    5. Assemblez les chambres Sykes-Moore (S-M) en plaçant un joint torique sur le dessus du couvercle, puis en plaçant le composant supérieur de la chambre sur le joint torique. Utilisez la clé fournie par le fabricant pour assembler la chambre en vissant les composants de la chambre ensemble pour sceller la chambre et éviter toute fuite.
      REMARQUE: Le haut de la chambre doit être serré sur le joint torique, mais la prudence est nécessaire pour s’assurer que le couvercle reste intact car le couvercle peut se fissurer si le joint torique ne s’assoit pas correctement dans la chambre. Assurez-vous également que la chambre est suffisamment étanche pour que la chambre ne fuie pas lorsque la solution de gonflement est ajoutée. Si vous ne serrez pas suffisamment la chambre, vous risquez de fuir et de perdre l’échantillon.
  5. Gonflement et récolte des vésicules
    1. Hydrater l’ensemble du système en pipetant doucement 450 μL de saccharose de 200 mM dans 1x PBS et en tapotant doucement les chambres pour assurer une couverture tampon adéquate des couches hydrogel-lipidiques.
      REMARQUE: La solution de saccharose peut être remplacée par un tampon de réhydratation contenant des sondes biologiques d’intérêt.
    2. Placez les chambres à 45 °C et recouvrez la partie supérieure de la chambre d’un couvercle pour éviter l’évaporation. Laisser gonfler l’échantillon, à l’abri des débris et de la lumière pendant 1 h.
    3. Ajouter 100 μL de 1 mg/mL de BSA dans de l’eau ultrapure dans chaque puits d’une plaque de 96 puits destinée à être utilisée. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
    4. Laver trois fois avec de l’eau ultra-pure et une fois avec 200 mM de saccharose dans 1x PBS.
    5. Enfin, ajouter 200 mM de glucose dans 1x PBS jusqu’à l’ajout de la solution d’échantillon DE GUV.
      REMARQUE: BSA a été utilisé pour bloquer l’adsorption de GUV.
    6. Après avoir laissé gonfler l’hydrogel, secouez doucement et tapotez la chambre pour déloger les GUV qui peuvent rester attachés à la surface de l’hydrogel. Ensuite, pipetez soigneusement la solution de saccharose GUV.
      REMARQUE: En option pour vous assurer que toutes les vésicules sont détachées de la surface, pipettez doucement une partie de la suspension de saccharose sur la surface de l’hydrogel.
    7. Déplacez la suspension dans un tube de microcentrifugation préalablement préparé contenant 700 μL de glucose 200 mM dans 1x PBS.
      REMARQUE: Le gradient de densité entraînera la décantation des vésicules au fond du tube de centrifugeuse.
    8. Laissez les vésicules se déposer pendant une autre heure pour vous assurer que les vésicules peuvent couler au fond du tube de microcentrifugation, ce qui permet une collecte optimale.
    9. Après la décantation des GUV dans le glucose, transférer 300 μL du fond du tube de centrifugeuse (les vésicules décantées) dans la plaque de 96 puits préalablement préparée et traitée au BSA pour examiner les vésicules au microscope confocal.
      REMARQUE: Assurez-vous d’éviter le fond du tube de microcentrifugation pour minimiser la quantité de débris recueillis dans l’échantillon final.
  6. Vérifiez les échantillons au microscope.
    1. Faire briller un laser de 488 nm sur l’échantillon (ce qui nous permet de visualiser la membrane, car la bicouche a été étiquetée ATTO-488-DPPE).
    2. Faites briller un laser de 561 nm sur l’échantillon (ce qui nous permet de visualiser la protéine, puisqu’elle a été marquée avec NHS-Rhodamine).
      REMARQUE: La prudence est nécessaire lors de l’imagerie de l’échantillon car la photooxydation peut déstabiliser les vésicules. Des vésicules ont été observées le même jour.

Figure 1
Figure 1 : Illustration des étapes détaillées du protocole. Créé avec BioRender.com Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

La concentration de protéines a été mesurée et le degré de marquage a été calculé comme le rapport molaire entre le colorant et la protéine étant de 1:1. En examinant les GUV à l’aide de la microscopie confocale, nous avons pu confirmer la formation réussie et l’intégration protéique des vésicules. Les lipides ont été marqués avec 0,4 mol% d’ATTO 488-DPPE, et la protéine a été marquée de manière covalente via la modification de l’ester NHS de rhodamine des amines primaires. La figure 2a et la figure 2b montrent une vésicule incorporée à des protéines dans les canaux ATTO 488 et rhodamine, respectivement. Toutes les micrographies ont été corrigées du courant sombre et du champ plat. La figure 2c et la figure 2d montrent un GUV témoin négatif sans protéine incorporée. La figure 3a et la figure 3b montrent une protéine incorporée GUV avec des profils d’intensité de ligne donnés par la ligne blanche pointillée de la même vésicule dans les deux canaux. Le profil d’intensité de la ligne montre un tracé bidimensionnel des intensités des pixels le long de la ligne blanche dessinée dans l’image. L’axe des x est la distance le long de la ligne et l’axe des y est l’intensité des pixels. Le logiciel ImageJ a été utilisé pour tracer l’intensité du profil de la ligne indiquée.

Figure 2
Figure 2 : Micrographies comparant les GUV incorporés aux protéines et les GUV sans protéine (témoin). Les micrographies (a) et (b) montrent la fluorescence GUV incorporée aux protéines avec les canaux ATTO 488 et rhodamine respectifs, respectivement. Les micrographies (c) et (d) montrent une protéine OMIS GUV lorsqu’elle est excitée avec les canaux ATTO 488 et rhodamine, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : La rangée du haut montre des micrographies de GUV incorporés aux protéines dans les canaux ATTO 488 (a) et rhodamine (b). Les profils d’intensité des lignes pour les lignes en pointillés blancs indiquées sont ci-dessous. L’analyse a été réalisée à l’aide du logiciel ImageJ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous avons identifié deux étapes essentielles au succès du protocole global: le traitement au plasma et le dépôt de lipides. Le nettoyage au plasma des couvercles est essentiel pour assurer une couverture et une adhérence adéquates de l’hydrogel d’agarose sur le couvercle en verre. Le nettoyage au plasma accomplit deux choses: premièrement, il élimine les traces de matière organique de la surface du verre; deuxièmement, il active la surface du couvercle, ce qui permet une augmentation de la mouillabilité à mesure que l’hydrophilie de la surface du verre augmente62,63. Toucher la surface du couvercle après le nettoyage au plasma inactivera et contaminera la surface ultrapropre et est fortement déconseillé. Notre recommandation est de ne toucher que les bords et le dessous mêmes du couvercle lors de la manipulation des glissements de couvercle pour l’étape de coulée de glissement d’agarose. La deuxième étape critique est le dépôt de lipides sur la surface sèche de l’hydrogel. Cette méthode utilise un dépôt lipidique goutte à goutte, qui nécessite une aiguille de chromatographie en phase gazeuse (GC) et un flux d’air pour déposer quelques microlitres de solution lipidique à la fois, permettant un contrôle précis de la quantité de lipides ajoutée et du placement du film lipidique sur la surface de l’hydrogel. L’inconvénient de cette méthode est que, si elle n’est pas effectuée avec soin, elle peut entraîner quelques zones sélectionnées avec un film lipidique plus épais, ce qui entraîne une réduction des rendements en GUV. Il est donc essentiel de s’assurer qu’il y a une couche lipidique aussi uniformément mince que possible à la surface de l’agarose.

L’un des avantages les plus importants de ce protocole est la flexibilité de la plate-forme elle-même; cette méthode se prête très bien aux changements dans la composition des protéines et des lipides, ainsi qu’à l’encapsulation et aux modifications du tampon. Ce protocole peut, en principe, inclure n’importe quelle protéine transmembranaire, car nous avons pu incorporer avec succès un certain nombre de protéines transmembranaires différentes, allant du récepteur de l’adénosine (A2AR) aux aquaporines végétales sans sacrifier la fonctionnalité42,45,64. Traditionnellement, les protéines ont été incorporées dans les GUV après solubilisation par des détergents ou incorporation dans des protéo-liposomes ou de petites vésicules unilamellaires qui peuvent ensuite être intégrées dans un GUV65 préformé. L’avantage de notre méthode de gonflement d’hydrogel modifié est qu’elle élimine la dépendance aux détergents ou aux vésicules intermédiaires et fournit un échafaudage hydraté intermédiaire. Les avantages sont doubles : nous pouvons incorporer de manière stable des RCPG fonctionnels dans la membrane dans un tampon physiologiquement plus pertinent sans compter sur des méthodes d’échange de détergent qui nécessitent plus de préparation et de soin quant à la concentration desdits détergents, et que le processus par lequel les GUV bourgeonnent à la surface de l’hydrogel permet l’orientation correcte des protéines dans la bicouche66 . Nous avons montré que le processus de bourgeonnement du GUV implique la coalescence de nombreuses vésicules plus petites à l’échelle nanométrique en vésicules plus grandes à l’échelle du micron, ce qui favorise l’orientation correcte des protéines dès le début. Nous l’avons montré dans nos travaux précédents; en bref, nous avons marqué de manière covalente un anticorps ciblant une boucle cytosolique spécifique du récepteur de l’adénosine et incubé l’anticorps marqué avec la protéine, puis incorporé la protéine marquée dans des GUV marqués par un colorant lipidique en utilisant la méthode de gonflement de l’hydrogel modifié. Nous avons ensuite exposé les vésicules incorporées aux protéines à un quencher chargé, qui est incapable de traverser la bicouche. Nous constatons par la suite une réduction de 50 % de la fluorescence du colorant lipidique, mais la fluorescence de la protéine marquée n’est pas affectée par le quencher, démontrant une orientation correcte44.

Des travaux antérieurs de notre laboratoire ont étudié le rôle dans lequel la charge du groupe de tête lipidique, les lipides chargés zwittérioniques et net-ioniques, ainsi que les propriétés tampons et hydrogel telles que le pH, la force ionique, l’osmolarité et la concentration d’hydrogel ont sur la dynamique de la formation de GUV67. En bref, la charge lipidique n’affecte pas en grande partie la formation de GUV, tandis que les propriétés tampons telles que l’augmentation de la concentration de saccharose (par exemple, 500 mM de saccharose dans un tampon PBS de force ionique de 185 mM) affectent négativement la formation de GUV, ce qui entraîne des vésicules de forme irrégulière qui ne se prêteront probablement pas facilement à la récolte. Les solutions acides (pH = 3) augmentent le taux de formation, tandis qu’une solution plus basique (pH = 8) supprime le taux de formation de GUV. Les GUV se forment encore au niveau des tampons acides et basiques, avec seulement des différences marginales dans la taille des vésicules. De faibles concentrations d’agarose (~0,1-1 p / v%) affectent également négativement la formation de GUV en raison d’un manque de couverture de surface homogène et d’une diminution du gonflement de l’hydrogel, une force nécessaire dans la coalescence et le bourgeonnement des GUV sur la surface de l’hydrogel. Ainsi, nous avons déterminé qu’une concentration finale d’agarose de 2 p / v% avec une solution de saccharose / glucose de 100-200 mM, combinée à une force ionique tampon de 185 mM PBS à pH 7,4 atteint un bon équilibre entre le gonflement de l’agarose, le taux de formation de GUV et la taille ultérieure des vésicules. Pour les vésicules qui contiennent des protéines, l’augmentation de la concentration initiale d’agarose à 3 p/v% permet d’obtenir une concentration finale d’agarose de 2 p/v% après l’ajout de la solution protéique. En plus de la dynamique de formation, le système tampon saccharose/glucose facilite également la sédimentation et la collecte ultérieure des GUV formés, ainsi que la visualisation en microscopie à contraste de phase65,68.

Il y a quelques points de prudence concernant ce protocole, en particulier en ce qui concerne l’agarose et la sélection des vésicules. Par exemple, alors que nous utilisons une agarose à température de fusion ultra-basse, la suspension agarose-eau doit atteindre au moins 60 ° C pour être fondue, et le mélange agarose-protéine est incubé à 45 ° C.  D’après notre expérience, cette température n’élimine pas l’activité du 5-HT1AR, mais la prudence est de mise pour d’autres protéines. En général, l’agarose que nous utilisons commence à geler à 20 ° C et donc la réaction de gonflement peut avoir lieu à des températures supérieures à 20 ° C, mais ce processus ne peut pas fonctionner en dessous de cette température. Il convient également de noter que plus la température se rapproche de 20 °C, moins l’étape de gonflement devient efficace, ce qui entraîne une diminution ultérieure des rendements en GUV. L’agarose peut également présenter un problème lors des étapes de décantation et de visualisation, car elle peut persister au fond du tube de décantation/collecte sous forme de débris. Ainsi, la prudence est de mise quant à la température requise pour maintenir l’agarose fondue et s’assurer que ladite température ne dénaturera pas la protéine d’intérêt ainsi que pour aspirer la solution de décantation afin d’éviter que tout excès d’agarose en suspension ne soit inclus dans l’échantillon final. Cette méthode dans son état actuel aboutit également à une taille de population GUV hétérogène, avec certaines vésicules présentant une multilamellité et d’autres phénomènes de vésicules défectueux tels que les vésicules dans les vésicules. Ceci est typique des méthodes courantes de formation de GUV et nécessite de la vigilance et de la discrétion lors de la sélection des vésicules pour la microscopie et l’analyse. Les GUV qui présentent des niveaux de fluorescence anormalement élevés ne sont pas non plus recommandés pour l’analyse, car l’agarose peut être trouvée à l’intérieur de certaines de ces vésicules. Des travaux non publiés de notre laboratoire ont permis de mener des expériences d’aspiration de micropipettes à l’aide de vésicules fabriquées à l’aide de cette technique, illustrant que la méthode de l’agarose produit des vésicules sans agarose altérant la mécanique dans la lumière.

Mis à part les limites, ce protocole présente une méthode robuste et simple pour générer des GUV incorporés aux protéines. Il peut générer des rendements élevés de GUV dans des conditions physiologiquement pertinentes qui incorporent des protéines transmembranaires correctement orientées dans la bicouche sans compromettre leur fonctionnalité. Il s’agit d’une rupture par rapport aux autres méthodes de formation de vésicules, qui impliquent des courants électriques ou une hydratation douce, qui endommageraient considérablement la structure de la protéine et la rendraient non fonctionnelle ou nécessiteraient d’autres étapes de solubilisation et d’élimination du détergent. Étant donné que les RCPG représentent plus d’un tiers de toutes les cibles pharmaceutiques, il existe un intérêt important à pouvoir étudier cette famille de protéines dans une plate-forme biomimétique hautement accordable et à haut débit. Plus précisément, les applications de ce travail vont de l’étude des interactions protéine-lipide, de la façon dont le microenvironnement lipidique influence la fonctionnalité et la localisation des protéines, et d’autres questions biophysiques de base qui peuvent éclairer le développement et la découverte de médicaments pharmaceutiques. Un exemple de ceci peut être trouvé dans le travail effectué au sein de notre laboratoire, qui a été en mesure de discerner des variances dans la fonctionnalité des récepteurs à la suite de l’oxydation des lipides.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Matthew Blosser pour ses précieux échanges et conseils. Ce travail a été soutenu par l’Office of Naval Research (N00014-16-1-2382) et la National Science Foundation (PHY-1915017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882

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Bioingénierie numéro 180
Construction de membranes lipidiques modèles incorporant des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)
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Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C.,… More

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).

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