Summary
Этот протокол использует набухание агарозы в качестве мощного и обобщаемого метода включения интегральных мембранных белков (ИМП) в гигантские одноламеллярные липидные везикулы (ГУВ), как описано здесь для восстановления человеческого белка рецептора серотонина 1А (5-HT1AR), одного из классов фармакологически важных рецепторов, связанных с G-белком.
Abstract
Надежные исследования in vitro структуры и функции интегральных мембранных белков были проблемой из-за сложности плазматической мембраны и многочисленных факторов, которые влияют на поведение белка в живых клетках. Гигантские одноламеллярные везикулы (ГУВ) представляют собой биомиметическую и высоко перестраиваемую модельную систему in vitro для исследования белково-мембранных взаимодействий и зондирования поведения белка точным, зависимым от стимула способом. В этом протоколе мы представляем недорогой и эффективный метод изготовления ГУВ с рецептором серотонина 1А человека (5-HT1AR), стабильно интегрированным в мембрану. Мы производим ГУВ с использованием модифицированного метода набухания гидрогеля; путем осаждения липидной пленки поверх смеси агарозы и 5-HT1AR, а затем гидратации всей системы, везикулы могут быть сформированы с правильно ориентированным и функциональным 5-HT1AR, включенным в мембрану. Эти ГУВ затем могут быть использованы для изучения белково-мембранных взаимодействий и поведения локализации с помощью микроскопии. В конечном счете, этот протокол может продвинуть наше понимание функциональности интегральных мембранных белков, обеспечивая глубокое физиологическое понимание.
Introduction
Синтетические модельные мембраны являются мощным инструментом в исследовании фундаментальных свойств и функций биомембран. Гигантские одногламеллярные везикулы (ГУВ) являются одной из наиболее заметных платформ для изучения различных свойств плазматической мембраны и могут быть спроектированы для имитации различных физиологических условий1,2,3,4,5,6,7,8. Хорошо известно, что плазматическая мембрана и ее организация играют ключевую роль во множестве клеточных процессов, таких как сигнальная трансдукция, адгезия, эндоцитоз и транспорт9,10,11,12,13,14,15.
ГУВ были изготовлены с использованием различных методов, включая щадящую гидратацию16, набухание гидрогеля17, электроформацию18, микрофлюидные методы19,20,21,22, струйную обработку23 и обмен растворителями24,25,26. Из-за проблем в обращении с интегральными мембранными белками (IMP) платформы in vitro для их изучения были ограничены. GUV представляют собой упрощенную платформу для изучения IMP в среде, имитирующей их родную среду. Хотя существует несколько подходов к восстановлению белка в ГУВ, проблемы возникают из-за включения белков с правильной ориентацией и поддержания функциональности белка27.
Наиболее успешное восстановление белка в ГУВ требует метода обмена моющих средств; которая включает в себя солюбилизацию белков из их родной среды моющими средствами с последующей очисткой белка, а затем замену молекул моющего средства липидами с помощью различных методов28. В то время как моющие средства служат для стабилизации третичной структуры ИМП во время очистки, моющие мицеллы являются относительно неестественной средой для этих белков, которые лучше стабилизируются, особенно для функциональных исследований, в липидных бислоях28,29,30. Кроме того, включение функциональных трансмембранных белков в липидный бислой с использованием традиционных методов изготовления GUV было затруднено из-за размера, деликатности этих белков и дополнительных этапов обмена моющих средств, которые потребовались бы27,31,32,33. Использование органического растворителя для удаления моющих средств вызывает агрегацию и денатурацию белка34. Улучшенный метод, опосредованный моющим средством, был многообещающим, однако для этапа удаления моющего средства необходима осторожность, и оптимизация может потребоваться для конкретных белков31,35. Кроме того, способы, использующие электроформацию, могут ограничивать выбор белка и могут не подходить для всех липидных композиций, особенно заряженных липидов31,36,37. Другим методом, который был использован, является пептид-индуцированное слияние больших одноцветных везикул (LUV), содержащих желаемый белок, с ГУВ, хотя было обнаружено, что оно трудоемко и может привести к вставке чужеродных молекул - фузогенных пептидов33,38,39. Гигантские везикулы плазматической мембраны (GPMV), которые получены из живых клеток, могут быть использованы для преодоления некоторых из этих проблем, однако они позволяют минимально контролировать полученный липидный и белковый состав14,40,41. Таким образом, интеграция ИМП в билипидный слой ГУВ с использованием нашего модифицированного метода набухания агарозы представляет собой надежный метод дальнейшего изучения этих белков в мембранной среде42,43,44,45.
Клеточная сигнализация и связь включает в себя семейство белков, известных как рецепторы, связанные с G-белком (GPCR); GPCR являются одним из крупнейших семейств белков и связаны с модуляцией настроения, аппетита, артериального давления, сердечно-сосудистой функции, дыхания и сна среди многих других физиологических функций46. В этом исследовании мы использовали рецептор серотонина 1А человека (5-HT1AR), который является прототипом семейства GPCR. 5-HT1AR может быть обнаружен в центральной нервной системе (ЦНС) и кровеносных сосудах; он влияет на многочисленные функции, такие как сердечно-сосудистая, желудочно-кишечная, эндокринная функции, а также участвует в регуляции настроения47. Большой барьер для исследований GPCR возникает из-за их сложной амфифильной структуры, и ГУВ представляют собой многообещающую платформу для исследования различных интересующих свойств, начиная от функциональности белка, липидно-белковых взаимодействий и белково-белковых взаимодействий. Для изучения липидно-белковых взаимодействий были использованы различные подходы, такие как поверхностный плазмонный резонанс (SPR)48,49, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)50,51, анализ наложения липидов на белок (PLO) 51,52,53,54, нативная масс-спектрометрия55, изотермическая титрационная калориметрия (ITC)56,57 и липосома осадочный анализ58,59. Наша лаборатория использовала упрощенный подход GUV для исследования влияния липидно-белковых взаимодействий на функциональность белка путем инкапсуляции BODIPY-GTPγS, которая связывается с субъединицей Giα в активном состоянии рецептора. Их связывание разглаживает флуорофор, производя флуоресцентный сигнал, который может быть обнаружен с течением времени45. Кроме того, в различных исследованиях изучались липидно-белковые взаимодействия и роль белков в обнаружении или стабилизации кривизны мембраны60,61, и использование осуществимого подхода GUV может быть ключевым преимуществом.
Этот протокол демонстрирует простой метод включения GPCR в мембрану ГУВ с использованием модифицированной системы гидрогеля агарозы17,42. Кроме того, основываясь на нашей предыдущей работе, наш метод может быть подходящим для IMP, которые могут выдерживать кратковременное воздействие 30-40 ° C. Вкратце, мы распространили тонкую пленку агарозы в сочетании с фрагментами мембраны, содержащими интересующий GPCR. После гелеобразования этого слоя мы наносим раствор липидов поверх агарозы и позволяем растворителю испариться. Затем регидратацию системы выполняли с помощью водного буфера, в результате чего образовывались ГУВ с белком, включенным в липидный бислой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Маркировка белка
- Позволяет NHS-родамину, фрагментам мембраны 5-HT1A и одной спиновой обессоливающей колонне MWCO 7 К уравновешиваться при комнатной температуре.
- Растворить 1 мг NHS-родамина в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
- Добавьте 5 мкл 1 М раствора бикарбоната натрия для повышения рН раствора 5-HT1AR до рН 8.
- Добавьте 3,66 мкл раствора NHS-родамина к 50 мкл раствора 5-HT1AR и пипетку осторожно вверх и вниз в микроцентрифужной пробирке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что у вас по крайней мере 10-кратный молярный избыток NHS-родамина. - Держите смесь защищенной от света и поставьте на ротатор при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Промывайте отжимную колонну MWCO 7 к с 200 мкл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (1x PBS) три раза в течение 1,5 мин при 1,5 RCF для каждой промывки.
- Добавьте меченый белок в один столбец и сбалансируйте его количество в другой микроцентрифужной трубке.
- Раскрутите меченый белок один раз в течение 5 мин при 1,5 RCF.
- Возьмите спектр UV-vis с помощью нанокапрульного спектрофотометра при 280 нм и 554 нм и рассчитайте эффективность маркировки в соответствии с руководством производителя.
- Хранить меченый белок при температуре 5 °C до дальнейшего использования. Раствор стабилен в течение примерно недели после маркировки.
2. ГУВ с мембранным включением 5-HT 1A
- Подготовка материалов и реагентов
- Позвольте белку, липидам и BSA (сывороточному альбумину крупного рогатого скота) уравновеситься до комнатной температуры.
- В течение этого времени очистите крышки, поместив их в метанол и обрабатывая ультразвуком в течение 30 мин при 40 °C. Убедитесь, что метанол полностью покрывает крышки, а уровень воды на водяной бане выше уровня метанола в контейнере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метанол токсичен и должен обрабатываться в соответствующей химической вытяжке. - Высушите избыток метанола на крышках легким потоком воздуха. Поместите крышку в духовку с температурой 40 °C на 15 минут, чтобы убедиться, что лишние крышки высохнут.
- Начните процесс плазменной очистки. Во-первых, поместите крышки в плазмоочиститель и закройте воздухозаборный клапан, чтобы откачать весь воздух внутри камеры.
- Как только камера окажется под вакуумом, очистите крышки в течение 5 минут, используя высокую радиочастотную настройку мощности и почти полный вакуум, с небольшим забором воздуха в вакуумную камеру. Чтобы обеспечить надлежащий уровень плазмы, отрегулируйте открытие вакуумной камеры таким образом, чтобы результирующий цвет плазмы был устойчивым, ярко-розовым.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании воздуха крайне важно, чтобы плазма оставалась ярко-розового цвета в течение всего этапа плазменной обработки, так как более темный фиолетовый цвет указывает на то, что в камере есть неправильное количество воздуха и приведет к неоптимальной обработке плазмой. - По прошествии 5 минут отключите радиочастотное питание и отпустите вакуум.
ПРИМЕЧАНИЕ: После извлечения из плазменной камеры, пожалуйста, убедитесь, что крышки остаются закрытыми.
- Гидрогельный препарат
- Смешайте 6 мг агарозы со сверхнизкой температурой плавления с 300 мкл сверхчистой воды (т.е. 2% (мас./об.) агарозы).
ПРИМЕЧАНИЕ: 2% агарозы будет использоваться для создания безбелковых ГУВ. Раствор агарозы можно хранить при 45 °C в течение двух дней. - Соединить 9 мг агарозы сверхнизкой температуры с 300 мкл сверхчистой воды для 3 мас./об.% агарозы, приготовленной на стадии 3.1. 3% агарозы будет использоваться для создания белковых инкорпорированных ГУВ.
- Вихрьте раствор ненадолго, прежде чем поместить их на тепловой блок 90 °C в течение 10 мин. Затем снова вихрьте трубку, прежде чем перенести ее в тепловой блок с температурой 45 °C, чтобы сохранить ее в расплавленном виде до дальнейшего использования.
- Смешайте 6 мг агарозы со сверхнизкой температурой плавления с 300 мкл сверхчистой воды (т.е. 2% (мас./об.) агарозы).
- Смешивание агарозы и белка
- Смешайте 21 мкл 3% агарозы с 7 мкл фрагментов мембраны 5-HT1AR. Пипетка вверх и вниз медленно много раз, чтобы обеспечить адекватное смешивание. Затем инкубируют при 45 °C в течение 1 мин.
- Осаждение гидрогелей и липидов
- Для безбелковых ГУВ: Сделайте тонкую пленку на свежеочищенных плазменной крышке, используя 20 мкл 2% агарозы. Быстро опустите еще одну крышку поверх капли агарозы и осторожно раздвиньте крышки, чтобы сделать тонкую пленку на обоих крышках.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг сложен тем, что скольжение капли должно происходить, пока агароза все еще находится в расплавленной форме. - Для белковых инкорпорированных ГУВ: Пипетка смесь белка/агарозы вверх и вниз еще раз, а затем кладет 20 мкл 2% агарозы на очищенный плазмой покров. Следуйте инструкциям по проскальзыванию, как описано выше.
- Дайте агарозе защитить гель от света в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Нанесите липиды по каплям поверх слоя агарозы. Используйте в общей сложности 10 мкл 2 мг/мл 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолина (POPC) с 0,4 мол% 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DPPE), меченый ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (или интересующей липидной смесью) в хлороформе поверх агароновой пленки. Нанесите капли с помощью газовой хроматографической иглы и распределите по одной капле за раз через мягкий воздушный поток.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе необходимо соблюдать осторожность, чтобы сделать относительно однородный слой липидов поверх гидрогеля. Кроме того, хлороформ токсичен и должен обрабатываться в соответствующей химической вытяжке. - Соберите камеры Сайкса-Мура (S-M), поместив уплотнительное кольцо поверх крышки, а затем поместив верхний компонент камеры поверх уплотнительного кольца. Используйте ключ, предоставленный производителем, для сборки камеры путем привинчивания компонентов камеры вместе, чтобы герметизировать камеру и предотвратить любую утечку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя часть камеры должна быть затянута на уплотнительном кольце, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы убедиться, что крышка остается неповрежденной, так как крышка может треснуть, если уплотнительное кольцо не находится должным образом в камере. Кроме того, убедитесь, что камера достаточно плотно закрыта, чтобы камера не протекала при добавлении набухающего раствора. Неспособность достаточно затянуть камеру приведет к утечкам и потере образца.
- Для безбелковых ГУВ: Сделайте тонкую пленку на свежеочищенных плазменной крышке, используя 20 мкл 2% агарозы. Быстро опустите еще одну крышку поверх капли агарозы и осторожно раздвиньте крышки, чтобы сделать тонкую пленку на обоих крышках.
- Набухание и сбор пузырьков
- Увлажняйте всю систему, осторожно пипетируя 450 мкл сахарозы 200 мМ в 1x PBS и осторожно постукивая по камерам, чтобы обеспечить адекватное буферное покрытие гидрогелево-липидных слоев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор сахарозы может быть заменен регидратационным буфером, содержащим интересующие биологические зонды. - Поместите камеры при температуре 45 °C и накройте верхнюю часть камеры крышкой, чтобы предотвратить испарение. Дайте образцу набухнуть, защищенным от мусора и света в течение 1 ч.
- Добавьте 100 мкл 1 мг/мл BSA в сверхчистой воде в каждую лунку пластины из 96 скважин, предназначенной для использования. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Промыть три раза сверхчистой водой и один раз 200 мМ сахарозы в 1x PBS.
- Наконец, добавьте 200 мМ глюкозы в 1x PBS до добавления раствора образца GUV.
ПРИМЕЧАНИЕ: BSA использовался для блокирования адсорбции GUV. - После того, как гидрогель набухнет, осторожно встряхните и постучите по камере, чтобы выбить любые ГУВ, которые могут оставаться прикрепленными к поверхности гидрогеля. Затем аккуратно добавьте раствор ГУВ-сахарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве дополнительного шага для обеспечения того, чтобы все везикулы были отделены от поверхности, осторожно выложите часть суспензии сахарозы обратно на поверхность гидрогеля. - Переместите суспензию в заранее подготовленную микроцентрифужную трубку, содержащую 700 мкл глюкозы 200 мМ в 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Градиент плотности приведет к оседанию везикул на дне трубки центрифуги. - Дайте везикулам осесть еще на час, чтобы убедиться, что везикулы могут опуститься на дно трубки микроцентрифуги, что позволит оптимально собрать.
- После оседания ГУВ в глюкозе переносят 300 мкл со дна трубки центрифуги (осевшие везикулы) в предварительно подготовленную и обработанную BSA 96-луночную пластину для исследования везикул под конфокальным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно избегайте самого дна микроцентрифужной трубки, чтобы свести к минимуму количество мусора, собранного в конечном образце.
- Увлажняйте всю систему, осторожно пипетируя 450 мкл сахарозы 200 мМ в 1x PBS и осторожно постукивая по камерам, чтобы обеспечить адекватное буферное покрытие гидрогелево-липидных слоев.
- Проверьте образцы под микроскопом.
- Покажите на образец лазером 488 нм (что позволяет нам визуализировать мембрану, так как бислой был помечен ATTO-488-DPPE).
- Покажите на образец лазером 561 нм (что позволяет нам визуализировать белок, поскольку он был помечен NHS-Rhodamine).
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность при визуализации образца, поскольку фотоокисление может дестабилизировать везикулы. Везикулы наблюдались в тот же день.
Рисунок 1: Иллюстрация подробных шагов протокола. Создано с помощью BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Измеряли концентрацию белка, а степень маркировки рассчитывали как молярное соотношение между красителем и белком 1:1. Изучив ГУВ с помощью конфокальной микроскопии, мы смогли подтвердить успешное образование и белковую интеграцию везикул. Липиды были помечены 0,4 моль% ATTO 488-DPPE, а белок был ковалентно помечен через модификацию эфира родамина NHS первичных аминов. На фиг.2а и фиг.2b показаны белково-инкорпорированные везикулы в каналах ATTO 488 и родамина соответственно. Все микроснимки были скорректированы темным током и плоским полем. На рисунке 2c и рисунке 2d показан отрицательный контроль GUV без включения белка. На рисунках 3a и 3b показан белок, интегрированный в ГУВ с профилями интенсивности линий, заданными пунктирной белой линией одного и того же пузырька в обоих каналах. Профиль интенсивности линии показывает двумерный график интенсивности пикселей вдоль белой нарисованной линии внутри изображения. Ось X — это расстояние вдоль линии, а ось Y — это интенсивность пикселей. Программное обеспечение ImageJ использовалось для построения профиля интенсивности указанной линии.
Рисунок 2: Микрофотографии, сравнивающие белковые инкорпорированные ГУВ и ГУВ без белка (контроль). Микроснимки (a) и (b) показывают флуоресценцию белка GUV с соответствующими каналами ATTO 488 и родамина соответственно. Микроснимки (c) и (d) показывают белок, опущенный GUV при возбуждении каналами ATTO 488 и родамина соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: В верхней строке показаны микроснимки белковых инкорпорированных ГУВ в каналах ATTO 488 (a) и родамин (b). Профили интенсивности линий для указанных линий с белым пунктиром приведены ниже. Анализ проводился с помощью программного обеспечения ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы определили два шага, которые имеют решающее значение для успеха общего протокола: плазменная обработка и осаждение липидов. Плазменная очистка покровов имеет важное значение для обеспечения адекватного покрытия и адгезии гидрогеля агарозы к стеклянному покрову. Плазменная очистка выполняет две вещи: во-первых, она удаляет следы органического вещества с поверхности стекла; во-вторых, он активирует поверхность покрова, что позволяет увеличить смачиваемость по мере увеличения гидрофильности поверхности стекла62,63. Прикосновение к поверхности крышки после очистки плазмы инактивирует и загрязняет ультрачистую поверхность и настоятельно не рекомендуется. Мы рекомендуем касаться только самых краев и нижних сторон крышки при обработке обтекателей для этапа литья агарозы. Вторым критическим этапом является осаждение липидов на сухую поверхность гидрогеля. Этот метод использует каплевидное осаждение липидов, которое требует иглы газовой хроматографии (GC) и воздушного потока для осаждения нескольких микролитров липидного раствора за раз, что позволяет точно контролировать количество добавленных липидов и размещение липидной пленки на поверхности гидрогеля. Недостатком этого метода является то, что если его не делать осторожно, это может привести к нескольким выделенным участкам с более толстой липидной пленкой, что приводит к снижению выходов ГУВ. Таким образом, крайне важно обеспечить, чтобы на поверхности агарозы был как можно более тонкий липидный слой.
Одним из наиболее существенных преимуществ этого протокола является гибкость самой платформы; этот метод очень хорошо поддается изменениям белкового и липидного состава, а также инкапсуляции и модификациям буфера. Этот протокол может, в принципе, включать любой трансмембранный белок, поскольку мы смогли успешно включить ряд различных трансмембранных белков, начиная от рецептора аденозина (A2AR) до растительных аквапоринов без ущерба для функциональности42,45,64. Традиционно белки были включены в ГУВ после солюбилизации моющими средствами или включения в протеолипосомы или небольшие одноламеллярные везикулы, которые впоследствии могут быть интегрированы в предварительно сформированный GUV65. Преимущество нашего модифицированного метода набухания гидрогеля заключается в том, что он устраняет зависимость моющих средств или промежуточных пузырьков и обеспечивает промежуточный гидратированный каркас. Преимущества этого двояки: мы можем стабильно включать функциональные GPCR в мембрану в более физиологически значимый буфер, не полагаясь на методы обмена моющими средствами, которые требуют большей подготовки и заботы о концентрации указанных моющих средств, и что процесс, посредством которого GUV отталкиваются от поверхности гидрогеля, позволяет правильно ориентировать белки в бислое66 . Мы показали, что процесс бутонирования GUV включает в себя слияние многих меньших везикул нанометрового масштаба в более крупные везикулы микронного масштаба, что способствует правильной ориентации белка с самого начала. Мы показали, что это имело место в нашей предыдущей работе; короче говоря, мы ковалентно маркировали антитело, нацеленное на специфическую цитозольную петлю аденозинового рецептора, и инкубировали меченое антитело с белком, а затем включили меченый белок в ГУВ, меченые липидным красителем, используя модифицированный метод гидрогелевого набухания. Затем мы подвергли везикулы, инкорпорированные белком, заряженному гасителю, который не может пересечь бислой. Впоследствии мы видим снижение флуоресценции липидного красителя на 50%, но флуоресценция меченого белка остается незатронутой quencher, демонстрируя правильную ориентацию44.
Предыдущая работа нашей лаборатории исследовала роль, в которой липидный заряд головной группы, цвиттерионные и нетто-ионные заряженные липиды, а также буферные и гидрогелевые свойства, такие как pH, ионная сила, осмолярность и концентрация гидрогеля, влияют на динамику образования ГУВ67. Короче говоря, липидный заряд в значительной степени не влияет на образование ГУВ, в то время как буферные свойства, такие как увеличение концентрации сахарозы (например, 500 мМ сахарозы в буфере PBS ионной силы 185 мМ), негативно влияют на образование ГУВ, что приводит к образованию везикул неправильной формы, которые, скорее всего, не будут легко поддаваться сбору. Кислые растворы (рН = 3) увеличивают скорость образования, в то время как более основной раствор (рН = 8) подавляет скорость образования ГУВ. ГУВ по-прежнему образуются как в кислом, так и в основном буферах, с незначительными различиями в размере пузырьков. Низкие концентрации агарозы (~0,1-1 мас./об.%) также негативно влияют на образование ГУВ из-за отсутствия однородного поверхностного покрытия и уменьшения набухания гидрогеля, необходимой силы в слиянии и бутонировании ГУВ с поверхности гидрогеля. Таким образом, мы определили, что конечная концентрация агарозы 2 мас./v% с раствором сахарозы/глюкозы 100-200 мМ в сочетании с буферной ионной силой 185 мМ PBS при рН 7,4 достигает хорошего баланса набухания агарозы, скорости образования ГУВ и последующего размера пузырьков. Для везикул, содержащих белок, увеличение начальной концентрации агарозы до 3 мас./об.% позволяет получить конечную концентрацию агарозы 2 мас./об.% после добавления белкового раствора. Помимо динамики формирования, буферная система сахарозы/глюкозы также облегчает осаждение и последующий сбор сформированных ГУВ, а также визуализацию при фазово-контрастной микроскопии65,68.
Есть некоторые предостережения в отношении этого протокола, в частности, в отношении агарозы и выбора везикул. Например, в то время как мы используем агарозу со сверхнизкой температурой плавления, суспензия агарозы-вода должна достигать, по крайней мере, 60 ° C, чтобы стать расплавленной, а смесь агароза-белок инкубируется при 45 ° C. По нашему опыту, эта температура не устраняет активность 5-HT1AR, но осторожность оправдана для других белков. В общем, агароза, которую мы используем, начинает гель при 20 ° C, и, таким образом, реакция набухания может происходить при температуре выше 20 ° C, но этот процесс не может функционировать ниже этой температуры. Следует также отметить, что чем ближе температура приближается к 20 °C, тем менее эффективной становится стадия набухания, что приводит к последующему снижению выходов ГУВ. Агароза также может представлять проблему на этапах оседания и визуализации, поскольку она может сохраняться на дне отстойной / сборной трубки в виде мусора. Таким образом, требуется осторожность в отношении температуры, необходимой для поддержания расплавленной агарозы и обеспечения того, чтобы указанная температура не денатурировала интересующий белок, а также аспирация оседающего раствора, чтобы избежать включения любого избытка взвешенной агарозы в конечный образец. Этот метод в его нынешнем состоянии также приводит к неоднородному размеру популяции ГУВ, при этом некоторые везикулы демонстрируют многоламелларность и другие дефектные везикулы, такие как везикулы внутри везикул. Это характерно для распространенных методов формирования ГУВ и требует бдительности и осмотрительности при выборе везикул для микроскопии и анализа. ГУВ, которые показывают необычно высокие уровни флуоресценции, также не рекомендуются для анализа, так как агароза может быть найдена внутри некоторых из этих везикул. Неопубликованная работа из нашей лаборатории позволила провести эксперименты по аспирации микропипеток с использованием везикул, сделанных с использованием этой техники, иллюстрируя, что метод агарозы производит везикулы без изменяющей механику агарозы в просвете.
Помимо ограничений, этот протокол представляет собой надежный и простой метод генерации белковых инкорпорированных ГУВ. Он может генерировать высокие выходы ГУВ в физиологически значимых условиях, которые включают правильно ориентированные трансмембранные белки в бислой без ущерба для их функциональности. Это отход от других методов образования пузырьков, которые включают электрические токи или мягкую гидратацию, которые значительно повредили бы структуру белка и сделали бы его нефункциональным или потребовали бы дальнейших этапов солюбилизации и удаления моющего средства. Учитывая, что GPCR составляют более трети всех фармацевтических мишеней, существует значительный интерес к возможности изучения этого семейства белков в высоконастраиваемой, высокопроизводительной, биомиметической платформе. Более конкретно, приложения этой работы варьируются от изучения белково-липидных взаимодействий, того, как липидная микросреда влияет на функциональность и локализацию белка, и других основных биофизических вопросов, которые могут информировать о разработке и открытии фармацевтических препаратов. Пример этого можно найти в работе, завершенной в нашей лаборатории, которая смогла различить различия в функциональности рецепторов в результате окисления липидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы благодарим Мэтью Блоссера за ценную дискуссию и советы. Эта работа была поддержана Управлением военно-морских исследований (N00014-16-1-2382) и Национальным научным фондом (PHY-1915017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850375C-25mg | |
| TI-Eclipse inverted microscope | Nikon, Melville, NY | Eclipse Ti | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850355C-25mg | |
| 13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings | Sterling Seal & Supply, Neptune, IN | 5-003-8770 | |
| 16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera | Photometrics, Huntington Beach, CA | Cascade II 512 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C-25mg | |
| 50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm | Coherent, Santa Clara, CA | 488/561-50-LS | |
| 5-HT1AR membrane fragments | Perkin Elmer, Waltham, MA | RBHS1AM400UA | |
| ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) | ATTO-TEC, Siegen, Germany | AD 488-155 | |
| Bench top plasma cleaner | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-32G | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
| chloroform (CHCl3) | Millipore Sigma, Burlington, MA | CX1055 | |
| Cholesterol (Chol) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | C8667-5G | |
| Corning 96-well Flat Clear Bottom | Corning, Corning, NY | 3904 | |
| Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic | Elma, Singen, Germany | [no longer sold on main website] | |
| glucose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G7528 | |
| methanol (MeOH) | Millipore Sigma, Burlington, MA | MX0485 | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ND-1000 | |
| NHS-Rhodamine | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 46406 | |
| phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) | Corning, Corning, NY | 21-040 | |
| spinning-disc CSUX confocal head | Yokogawa,Tokyo, Japan | CSU-X1 | |
| standard 25 mm no. 1 glass coverslips | ChemGlass, Vineland, NJ | CLS-1760 | |
| sucrose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S7903 | |
| Sykes-Moore chambers | Bellco, Vineland, NJ | 1943-11111 | |
| Ultra-low melting temperature agarose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5030 | |
| VWR Analog Heatblock | VWR International, Radnor, PA | [no longer sold on main website] | |
| VWR Tube Rotator | VWR International, Radnor, PA | 10136-084 | |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 89882 |
References
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
- Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
- Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
- Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
- Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
- Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
- Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
- Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
- Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
- Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S.
- Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
- Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
- Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
- Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
- le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
- Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
- Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
- Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
- Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
- Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
- Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
- López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
- Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
- Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
- Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
- Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Nichols, D. E., Nichols, C. D.
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
- Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
- Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
- Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
- Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
- Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
- Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
- Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
- Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
- Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
- Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
- Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
- Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
- Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
- Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
- Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
- Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
- Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
- Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
- Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).
