Method Article

Messung der Zusammensetzung von CD95 Death-Inducing Signaling Complex und Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex

DOI:

10.3791/62842

⸱

August 2nd, 2021

 , 
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird ein experimenteller Workflow vorgestellt, der den Nachweis der Caspase-8-Verarbeitung direkt am todesinduzierenden Signalkomplex (DISC) ermöglicht und die Zusammensetzung dieses Komplexes bestimmt. Diese Methodik hat breite Anwendungen, von der Entschlüsselung der molekularen Mechanismen von Zelltodwegen bis hin zur dynamischen Modellierung von Apoptose-Netzwerken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die extrinsische Apoptose wird durch die Aktivierung von Todesrezeptoren (DRs) wie CD95/Fas/APO-1 oder Tumornekrosefaktor-bedingtem Apoptose-induzierendem Liganden (TRAIL)-Rezeptor 1/Rezeptor 2 (TRAIL-R1/R2) vermittelt. Die Stimulation dieser Rezeptoren mit ihren verwandten Liganden führt zum Aufbau des todinduzierenden Signalkomplexes (DISC). DISC umfasst DR, das Adapterprotein Fas-assoziiertes Protein mit Todesdomäne (FADD), Procaspasen-8/-10 und zelluläre FADD-ähnliche Interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs). Die DISC dient als Plattform für die Procaspase-8-Verarbeitung und -Aktivierung. Letzteres geschieht durch seine Dimerisierung / Oligomerisierung in den an der DISC zusammengesetzten Filamenten der Death Effector Domain (DED).

Auf die Aktivierung von Procaspase-8 folgt seine Verarbeitung, die in mehreren Schritten erfolgt. In dieser Arbeit wird ein etablierter experimenteller Workflow beschrieben, der die Messung der DISC-Bildung und die Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex ermöglicht. Der Workflow basiert auf Immunpräzipitationstechniken, die durch die Western-Blot-Analyse unterstützt werden. Dieser Workflow ermöglicht eine sorgfältige Überwachung verschiedener Schritte der Procaspase-8-Rekrutierung in die DISC und ihrer Verarbeitung und ist für die Untersuchung molekularer Mechanismen der extrinsischen Apoptose von hoher Relevanz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Einer der am besten untersuchten Todesrezeptoren (DRs) ist CD95 (Fas, APO-1). Der extrinsische apoptotische Signalweg beginnt mit der Interaktion des DR mit seinem verwandten Liganden, d.h. CD95L interagiert mit CD95 oder TRAIL bindet an TRAIL-Rs. Dies führt zur Bildung der DISC an der entsprechenden DR. DISC besteht aus CD95, FADD, Procaspase-8/-10 und c-FLIP Proteinen1,2. Darüber hinaus wird die DISC durch Wechselwirkungen zwischen Death Domain (DD)-haltigen Proteinen wie CD95 und FADD und DED-haltigen Proteinen wie FADD, Procaspase-8/-10 und c-FLIP zusammengesetzt (Abbildung 1). Procaspase-8 wird durch Assoziation seiner DEDs oligomerisiert, was zur Bildung von DED-Filamenten führt, gefolgt von procaspase-8-Aktivierung und -Verarbeitung. Dies löst eine Caspase-Kaskade aus, die zum Zelltod führt (Abbildung 1)3,4. Somit ist Procaspase-8 eine zentrale Initiator-Caspase des extrinsischen Apoptoseweges, vermittelt durch CD95 oder den TRAIL-Rs, aktiviert an der entsprechenden makromolekularen Plattform, DISC.

Es ist bekannt, dass zwei Isoformen von Procaspase-8, nämlich Procaspase-8a (p55) und -8b (p53), für die DISC5rekrutiert wurden. Beide Isoformen bestehen aus zwei DEDs. DED1 und DED2 befinden sich im N-terminalen Teil der Procaspase-8a/b, gefolgt von den katalytischen Domänen p18 und p10. Eine detaillierte Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) Analyse von Procaspase-8-DEDs ergab die Assemblierung von Procaspase-8-Proteinen zu fadenförmigen Strukturen, den sogenannten DED-Filamenten4,6. Bemerkenswerterweise wurde zunächst vorgeschlagen, dass die linearen Procaspase-8-Ketten an der Dimerisierung beteiligt sind, gefolgt von der Procaspase-8-Aktivierung an der DISC. Nun ist bekannt, dass diese Ketten nur eine Unterkonstruktion des Procaspase-8-DED-Filaments sind, das aus drei Ketten besteht, die zu einer Dreifachhelix3, 4,6,7zusammengesetzt sind.

Bei der Dimerisierung am DED-Filament führen Konformationsänderungen in der Procaspase-8a/b zur Bildung des aktiven Zentrums von Procaspase-8 und seiner Aktivierung3,8. Es folgt die Procaspase-8-Verarbeitung, die über zwei Wege vermittelt wird: Der erste geht über die Erzeugung eines p43/p41-Spaltprodukts und der zweite über die initiale Erzeugung eines p30-Spaltprodukts. Der p43/p41-Signalweg wird durch die Spaltung von Procaspase-8a/b an Asp374 eingeleitet, was zu p43/p41- und p12-Spaltprodukten führt (Abbildung 2). Ferner werden diese Fragmente bei Asp384 und Asp210/216 automatisch katalytisch gespalten, was zur Bildung des aktiven Caspase-8-Heterotetramers, p102/p1829, 10,11führt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass parallel zum p43/p41-Verarbeitungsweg auch procaspase-8a/b an Asp216 gespalten wird, was zur Bildung des C-terminalen Spaltprodukts p30 führt, gefolgt von dessen Proteolyse zu p10 und p1810 (Abbildung 2).

Die Procaspase-8a/b-Aktivierung am DED-Filament wird streng durch Proteine namens c-FLIPs12reguliert. Die c-FLIP Proteine kommen in drei Isoformen vor: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS) und c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle drei Isoformen enthalten zwei DEDs in ihrem N-terminalen Bereich. c-FLIPL hat auch eine C-terminale katalytisch inaktive Caspase-ähnliche Domäne12,13. Beide kurzen Isoformen von c-FLIP-c-FLIPS und c-FLIPRwirken anti-apoptotisch, indem sie die Bildung von DED-Filamenten an der DISC 6,14,15stören. Darüber hinaus kann c-FLIPL die Caspase-8-Aktivierung konzentrationsabhängig regulieren. Dies kann sowohl zu pro- als auch zu anti-apoptotischen Wirkungen führen16,17,18. Durch die Bildung des katalytisch aktiven Procaspase-8/c-FLIPL Heterodimers führt c-FLIPL zur Stabilisierung des aktiven Zentrums von Procaspase-8 und dessen Aktivierung. Die pro- oder anti-apoptotische Funktion von c-FLIPL ist direkt abhängig von seiner Menge an den DED-Filamenten und der anschließenden Menge an zusammengesetzten Procaspase-8/c-FLIPL Heterodimeren19. Niedrige oder mittlere Konzentrationen von c-FLIPL an der DISC führen zu ausreichenden Mengen an Procaspase-8/c-FLIP L-Heterodimeren am DED-Filament, was die Aktivierung von Caspase-8 unterstützt. Im Gegensatz dazu führen erhöhte Mengen an c-FLIPL direkt zu seiner anti-apoptotischen Wirkung an der DISC20.

Zusammengenommen ist die Aktivierung und Verarbeitung von Procaspase-8a/b am DISC ein stark regulierter Prozess, der mehrere Schritte umfasst. Dieser Beitrag diskutiert die Messung der Procaspase-8-Verarbeitung direkt am DISC sowie die Analyse der Zusammensetzung dieses Komplexes. Dies wird anhand der CD95 DISC als exemplarischem DR-Komplex präsentiert.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T-Zell-Experimente wurden gemäß der ethischen Vereinbarung 42502-2-1273 Uni MD durchgeführt.

1. Zellen für das Experiment vorbereiten

HINWEIS: Die durchschnittliche Anzahl der Zellen für diese Immunpräzipitation beträgt 1 × 107. Adhärente Zellen müssen einen Tag vor dem Experiment ausgesät werden, so dass es am Tag des Experiments 1 ×10 7 Zellen gibt.

  1. Adhärenzzellen für das Experiment vorbereiten
    1. Samen Sie 5-8 × 106 adhärente Zellen in 20 ml Medium (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) für jede Bedingung in 14,5 cm Schalen einen Tag vor Beginn des Experiments.
    2. Stellen Sie am Tag des Experiments sicher, dass die Zellen zu 80-90% konfluent sind und an der Schale haften. Verwerfen Sie das Medium und fügen Sie den adhärenten Zellen frisches Medium hinzu.
  2. Vorbereitung von Suspensionszellen für das Experiment
    1. 1 × 107 Suspensionszellen vorsichtig in 10 mL Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien für die Zusammensetzung) pro Zustand unmittelbar vor Beginn des Experiments in 14,5 cm Schalen geben.
    2. Wenn Primärzellen verwendet werden, isolieren Sie primäre T-Zellen gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren21. Behandeln Sie primäre T-Zellen mit 1 μg / ml Phytohämagglutinin für 24 h, gefolgt von einer 25 U / ml IL2-Behandlung für 6 Tage.
    3. 1 × 108 primäre T-Zellen vorsichtig in 10 ml Kulturmedium (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) pro Bedingung unmittelbar vor Beginn des Experiments in 14,5 cm Schalen geben.
      HINWEIS: Diese höhere Anzahl von primären T-Zellen wird empfohlen, da diese Zellen kleiner sind.

2. CD95L Stimulation

  1. Stimulieren Sie die Zellen mit CD95L (hergestellt wie zuvorbeschrieben 20 oder kommerziell erhältlich (siehe Tabelle der Materialien)).
    ANMERKUNG: Die Konzentration des CD95L und der Zeitpunkt der Stimulation sind zelltypabhängig13,15,22,23,24,25. Bereiten Sie eine Stimulationsbedingung zweimal vor, um parallel eine "Perlenkontrollprobe" zu erzeugen.
    1. Stimulieren Sie adhärente Zellen mit der ausgewählten Konzentration von CD95L. Halten Sie die Platte in einem Winkel und pipettieren Sie den Liganden in das Medium, ohne die adhäsiven Zellen zu berühren.
    2. Stimulieren Sie Die Suspensionszellen mit CD95L, indem Sie die Ligandenlösung in die Zellsuspension pipettieren.

3. Zellernte und Lyse

  1. Stellen Sie das Zellgeschirr auf Eis.
    HINWEIS: Entsorgen Sie das Medium nicht. Sterbende Zellen schweben im Medium und sind wichtig für die Analyse.
  2. 10 ml kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Zellsuspension geben und die angeschlossenen Zellen von der Platte abkratzen. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-ml-Röhrchen.
  3. Waschen Sie die Zellschale zweimal mit 10 ml kaltem PBS und geben Sie die Waschlösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 × g für 5 min, 4 °C.
  4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml kaltem PBS. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Röhrchen.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 × g für 5 min, 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml kaltem PBS.
  6. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 × g für 5 min, 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet mit 1 ml Lysepuffer (mit 4% Protease-Inhibitor-Cocktail). Inkubieren Sie es für 30 min auf Eis.
  7. Zentrifugieren Sie das Lysat mit maximaler Geschwindigkeit (~17.000 × g) für 15 min, 4 °C.
  8. Den Überstand (Lysat) in ein sauberes Röhrchen geben. Entsorgen Sie das Pellet. Nehmen Sie 50 μL des Lysats in einem anderen Röhrchen. Analysieren Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay und nehmen Sie die Menge an Lysat, die 25 μg Protein entspricht, in eine Durchstechflasche. Fügen Sie der Durchstechflasche Ladepuffer (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) hinzu. Lagern Sie es bei -20 °C als Lysatkontrolle.

4. Immunpräzipitation (IP)

  1. Dem Lysat werden 2 μL Anti-APO-1-Antikörper und 10 μL Protein-A-Sepharoseperlen (wie vom Hersteller empfohlen hergestellt) zugegeben. Geben Sie nur 10 μL der Kügelchen in ein separates Röhrchen, das Lysat enthält (stimulierte Probe), um eine "Perlenkontrolle" zu erzeugen.
    HINWEIS: Verwenden Sie Pipettenspitzen mit breiten Öffnungen, indem Sie entweder die Spitzen schneiden oder spezielle Spitzen für IP kaufen, während Sie mit den Protein-A-Sepharose-Perlen umgehen.
  2. Inkubieren Sie die Mischung aus Lysat mit Antikörpern/Eiweiß A-Sepharoseperlen mit sanftem Mischen über Nacht bei 4 °C. Zentrifugieren Sie die Lysate mit Antikörpern/Protein A Sepharoseperlen bei 500 × g für 4 min, 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 1 ml kaltes PBS zu den Kügelchen und wiederholen Sie diesen Schritt mindestens dreimal.
  3. Verwerfen Sie den Überstand. Die Kügelchen vorzugsweise mit einer 50 μL Hamilton Spritze absaugen.

5. Western Blot

  1. 20 μL 4x Ladepuffer (siehe Tabelle der Materialien für die Zusammensetzung) zu den Kügelchen geben und bei 95 °C für 10 min erhitzen. Erhitzen Sie die Lysatsteuerungen bei 95 °C für 5 min.
  2. Laden Sie die Lysate, IPs und einen Proteinstandard auf ein 12,5% iges Natriumdodecylsulfat (SDS) -Gel (siehe Materialtabelle für die Gelvorbereitung) und laufen Sie mit einer konstanten Spannung von 80 V.
  3. Übertragen Sie die Proteine aus dem SDS-Gel auf eine Nitrocellulosemembran.
    HINWEIS: Hier wurde die für die interessierenden Proteine optimierte Halbtrockentechnik für den Transfer über 12 min (25 V; 2,5 A= konstante) verwendet. Weichen Sie die Nitrocellulosemembran und zwei Mini-Transferstapel in Elektrophoresepuffer (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung, bereiten Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers vor) für einige Minuten vor dem Western Blotting ein.
  4. Legen Sie die abgefleckte Membran in eine Box und blockieren Sie sie für 1 h in Blocklösung (0,1% Tween-20 in PBS (PBST) + 5% Milch). Inkubieren Sie die Membran mit der Blockierlösung unter sanfter Bewegung.
  5. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für 5 min pro Wäsche.

6. Erkennung von Western Blot

  1. Der erste Primärantikörper in der angegebenen Verdünnung (siehe Materialtabelle)wird in die Membran gegeben und über Nacht bei 4 °C unter sanfter Bewegung inkubiert.
  2. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für 5 min pro Wäsche.
  3. Inkubieren Sie die Membran mit 20 ml sekundärem Antikörper (verdünnt 1:10.000 in PBST + 5% Milch) mit sanftem Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
  4. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für 5 min pro Wäsche.
  5. Entsorgen Sie PBST und geben Sie etwa 1 ml Meerrettichperoxidase-Substrat zur Membran.
  6. Erkennen Sie das chemolumineszente Signal (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Die Belichtungszeit und die Anzahl der aufgenommenen Bilder hängen von der Proteinmenge in der Zelle und der Spezifität der verwendeten Antikörper ab. Sie muss für jeden zum Nachweis verwendeten Antikörper empirisch ermittelt werden.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um die Caspase-8-Rekrutierung auf die DISC und deren Verarbeitung an der CD95 DISC zu analysieren, beschreibt dieses Papier einen klassischen Workflow, der IP der CD95 DISC mit Western-Blot-Analyse kombiniert. Dies ermöglicht den Nachweis mehrerer Schlüsselmerkmale der Caspase-8-Aktivierung an der DISC: die Montage der Caspase-8-aktivierenden makromolekularen Plattform, die Rekrutierung von Procaspase-8 in die DISC und die Verarbeitung dieser Initiator-Caspase (Abbildung 1 und

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Ansatz wurde erstmals von Kischkel et al.27 beschrieben und seitdem von mehreren Gruppen erfolgreich entwickelt. Für eine effiziente DISC-Immunpräzipitation und überwachung der Caspase-8-Verarbeitung in diesem Komplex müssen mehrere wichtige Aspekte berücksichtigt werden.

Erstens ist es wichtig, alle Waschschritte während der Immunpräzipitation zu befolgen. Besonders wichtig sind die letzten Waschschritte der Sepharoseperlen und das Trocknen der Sepharoseperlen. ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken der Wilhelm Sander-Stiftung (2017.008.02), dem Center of Dynamic Systems (CDS), gefördert durch das EU-Programm EFRE (Europäischer Fonds für regionale Entwicklung) und der DFG (LA 2386) für die Unterstützung unserer Arbeit. Wir danken Karina Guttek für die Unterstützung unserer Experimente. Wir danken Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) für die Bereitstellung von primären T-Zellen.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12,5% SDS-Gelselbst hergestelltfür zwei Trenngele:
3,28 mL destilliertes H2O
2,5 mL Tris; pH 8,8; 1,5 M
4,06 mL Acrylamid
100 µ L 10% SDS
100 & Mikro; L 10% APS
7,5 & Mikro; L TEMED

für zwei Sammelgele:
3,1 mL destilliertes H2O
1,25 mL Tris; pH-Wert 6,8; 1,5 M
0,5 mL Acrylamid
50 & Mikro; L 10% SDS
25 & Mikro; L 10% APS
7,5 & Mikro; L TEMED
14,5 cm ZellschalenGreiner639160
AcrylamidCarl RothA124.1
Aerosolfilter Pipettenspitzen mit Filter mit hoher Rückgewinnung und breiter ÖffnungVWR46620-664 (Nordamerika) oder 732-0559 (Europa)Wird zum Pipettieren von Kügelchen auf das Lysat
Anti-Aktin AbSigma AldrichA2103Verdünnung: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Abwird in diesen Experimenten von Prof. P. Krammer zur Verfügung gestellt oder kann von Enzo erworben werdenALX-805-038-C100wird nur für die Immunpräzipitation verwendet
Anti-Caspase-10 AbBiozolMBL-M059-3Verdünnung: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
3 AbZellsignalisierung9662 SVerdünnung: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-Caspase-8 Ab C15in diesen Experimenten von Prof. P. Krammer zur Verfügung gestellt oder kann von ENZOerworben werden ALX-804-242-C100Verdünnung: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3-
CD95 AbCruzsc-715Verdünnung: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 AbProf. P. Krammer zur Verfügung gestellt werden oder kann von ENZOALX-804-961-0100erworben werdenVerdünnung: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Abbereitgestellt in diesen Experimenten von Prof. P. Krammer oder käuflich erworbenADI-AAM-212-EVerdünnung: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP AbZellsignalisierung9542Verdünnung: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APSCarl Roth9592.3
β-mercaptoethanolCarl Roth4227.2
Bradford solution
Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml		Bio Rad500-0006verwendet gemäß Herstelleranweisungen
CD95Lin diesen Experimenten von Prof. P. Krammer zur Verfügung gestellt oder kann von ENZO erworben werdenALX-522-020-C005
Chemolumineszenzdetektor
Chem Doc XRS+		Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)Sigma Aldrich11 836 145 001hergestellt nach Herstellerangaben
DPBS (10x) ohne Ca, MgPAN BiotechP04-53500Verdünnung 1:10 mit H2O, Lagerung im Kühlschrank
EletrophoresePuffer selbst hergestellt10x Elektrophoresepuffer:
60,6 g Tris
288 g Glycin
20 g SDS
ad 2 L H2O
1:10 Verdünnung vor Gebrauch
GlycinCarl Roth3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05Verdünnung 1:10.000 in PBST + 5% Milch
Goat Anti-Mouse IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05Verdünnung 1:10.000 in PBST + 5% Milch
Ziege Anti-Kaninchen IgG-HRPSouthernBiotech4030-05Verdünnung 1:10.000 in PBST + 5% Milch
Interleukin-2 Human(hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001zur Aktivierung von T-Zellen
KClCarl Roth6781.2
KH2PO4Carl Roth3904.1
Ladepuffer
4x Laemmli Probenpuffer, 10 mL		Bio Rad161-0747hergestellt nach Herstellerangaben Luminata
Forte Western HRP SubstratMilliporeWBLUFO500
Lysepufferselbst hergestellt13,3 mL Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M
27,5 mL NaCl; 5 M
10 mL EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
960 mL H2O-Medium
für adhärente Zellen DMEM F12 (1:1) mit stabilem Glutamin,   2.438 g/LPAN BiotechP04-41154unter Zugabe von 10 % FCS, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,0001 % Puromycin zum Medium
Medium für primäre T-Zellengibco von Life Technologie21875034Zugabe von 10 % FCS und 1 % Penicillin-Streptomycin zum Medium
MilchpulverCarl RothT145.4
Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTselfmade 20x PBST:
230 g NaCl
8 g KCl
56,8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 mL Tween-20
ad 2 L H2O
Verdünnung 1:20 vor Gebrauch
PBST + 5% Milchselbst hergestellt50 g Milchpulver + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801zur Aktivierung der T-Zellen
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373Verwendung zwischen 3-5 & Mikro; L
Protein A Sepharose CL-4B KügelchenNovodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01Affinitätsharzkügelchen hergestellt nach Herstellerangaben
SchaberVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
SchüttlerHeidolph
NatriumazidCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo Mini-Size-TransferstacksBio Rad170-4270gemäß Herstellerangaben verwendet
TransBlot Turbo 5x TransferpufferBio Rad10026938nach Herstellerangaben hergestellt
TransBlot Turbo Mini-Size-NikotrozellulosemembranBio Rad170-4270Verwendung gemäß Herstellerangaben
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000
Santa von ,

References

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