Summary
Dit protocol beschrijft hoe menselijke intestinale organoïden kunnen worden geïnfecteerd vanaf hun apicale of basolaterale kant om gastheer / pathogeeninteracties op eencellig niveau te karakteriseren met behulp van eencellige RNA-sequencing (scRNAseq) -technologie.
Abstract
Menselijke intestinale organoïden vormen het beste cellulaire model om pathogene infecties van het maagdarmkanaal te bestuderen. Deze organoïden kunnen worden afgeleid uit alle delen van het maagdarmkanaal (maag, jejunum, twaalfvingerige darm, ileum, colon, rectum) en bevatten, bij differentiatie, de meeste celtypen die van nature in elke afzonderlijke sectie voorkomen. Intestinale organoïden bevatten bijvoorbeeld voedingsstofabsorberende enterocyten, secretoire cellen (Goblet, Paneth en entero-endocriene), stamcellen, evenals alle afstammingsspecifieke differentiatie-intermediairen (bijv. Vroege of onrijpe celtypen). Het grootste voordeel bij het gebruik van van het maagdarmkanaal afgeleide organoïden om infectieziekten te bestuderen, is de mogelijkheid om nauwkeurig te identificeren welk celtype het doelwit is van de enterische ziekteverwekker en om aan te pakken of de verschillende delen van het maagdarmkanaal en hun specifieke celtypen op dezelfde manier reageren op pathogene uitdagingen. In de afgelopen jaren zijn gastro-intestinale modellen, evenals organoïden uit andere weefsels, gebruikt om viraal tropisme en de mechanismen van pathogenese te bestuderen. Het gebruik van alle voordelen van het gebruik van organoïden bij het gebruik van hoogpathogene virussen vormt echter een technische uitdaging en vereist strikte bioveiligheidsoverwegingen. Bovendien, omdat organoïden vaak in drie dimensies worden gekweekt, is de basolaterale kant van de cellen naar de buitenkant van de organoïde gericht, terwijl hun apicale kant naar de binnenkant (lumen) van de organoïden is gericht. Deze organisatie vormt een uitdaging voor enterische pathogenen, omdat veel enterische infecties ontstaan vanuit de apicale / luminale kant van de cellen na inname. Het volgende manuscript zal een uitgebreid protocol bieden om menselijke intestinale organoïden voor te bereiden op infectie met enterische pathogenen door rekening te houden met de infectiezijde (apicale versus basolaterale) om eencellige RNA-sequencing uit te voeren om celtype-specifieke gastheer / pathogeen interacties te karakteriseren. Deze methode beschrijft de voorbereiding van de organoïden en de overwegingen die nodig zijn om dit werk uit te voeren onder bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3) inperkingsomstandigheden.
Introduction
Het bestuderen van het celtypespecifieke tropisme en de celtypespecifieke immuunrespons op menselijke enterische virussen is historisch uitdagend geweest vanwege het gebrek aan primaire menselijke cellulaire modellen. Deze beperking is nu gedeeltelijk uitgeroeid met de ontwikkeling van organoïden1. In het geval van het maagdarmkanaal zijn maag- en darmorganoïde modellen ontwikkeld voor mensen en verschillende andere soorten(bijv. Murine, runderen, katten, vleermuizen)2,3,4,5,6. Intestinale organoïden reproduceren de structurele architectuur van het menselijke darmepitheel en bevatten crypte- en villi-achtige structuren, functionele darmlijnen en zijn zelfs gebruikt om voorheen onbekende cellijnen te identificeren. Twee verschillende benaderingen kunnen worden gebruikt om intestinale organoïden te laten groeien. Ten eerste worden darmstammencellen die crypten bevatten geïsoleerd uit weefselresecties of biopsieën en gekweekt onder specifieke kweekomstandigheden (bijv. Wnt3A, R-spondin, Noggin en EGF) om uit te breiden, en vervolgens differentiëren de stamcellen naar de meeste darmcellijnen(bijv. Enterocyten, Paneth-cellen, Goblet-cellen, entero-endocriene cellen)7. Deze methode zorgt voor de isolatie van organoïden uit alle delen van het maagdarmkanaal(bijv., maag, twaalfvingerige darm, jejunum, ileum en dikke darm). De tweede methode is gebaseerd op door de mens geïnduceerde pluripotente of embryonale stamcellen, die vervolgens in een stapsgewijs proces worden gedifferentieerd tot darmepitheelcellen8. Deze geïnduceerde op stamcellen gebaseerde organoïden worden vaak beschreven als meer embryonaal van aard in vergelijking met van de patiënt afgeleide organoïden. Hoewel al deze organoïde modellen van cruciaal belang zijn geweest voor het ontrafelen van ontwikkelingssignalen die nodig zijn om het darmkanaal te vormen, staat het gebruik ervan in onderzoek naar infectieziekten nog in de kinderschoenen.
Enterisch virus is een brede term die alle virussen omvat die via het maagdarmkanaal infecteren, zoals picornavirussen(bijv., EV-71), reovirussen (bijv. Rotavirus) en calicivirussen (bijv. Norovirus)9. Enterische virussen initiëren hun infectieuze levenscyclus door de inname van besmet voedsel en water, waardoor mensen in ontwikkelingslanden een hoog risico lopen als gevolg van de lozing van onbehandeld afval in het milieu en gebrek aan medische zorg na het begin van de infectie10. Afhankelijk van het type pathogeen kan de infectie leiden tot gastro-enteritis, braken en / of waterige diarree als gevolg van lekkage van de darmwand. Menselijke norovirussen zijn een veel voorkomende en zeer besmettelijke enterische ziekteverwekker, die wereldwijd leidt tot meer dan 600 miljoen infecties en 15 miljoen ziekenhuisopnames11. Organoïden zijn de sleutel geweest tot norovirusonderzoek omdat ze de infectie en replicatie van humaan norovirus ondersteunen, dat voorheen niet kon worden gekweekt in standaard celkweekmodellen12.
In de afgelopen twee decennia zijn coronavirussen naar voren gekomen als belangrijke menselijke pathogenen13. Deze familie omvat de hoogpathogene MERS, SARS-CoV-1 en SARS-CoV-2, die strikte veiligheidsniveaus vereisen bij het uitvoeren van onderzoek naar deze virussen. Interessant is dat, hoewel alle drie deze pathogenen meestal worden erkend voor hun geïnduceerde ademhalingssymptomen en nood, het nu duidelijk is dat deze virussen niet alleen de luchtwegen infecteren, maar ook andere organen. Een belangrijke pathologie geïnduceerd bij SARS-CoV-2 geïnfecteerde patiënten naast de ademnood is de aanwezigheid van gastro-intestinale symptomen14. Een fractie van de met SARS-CoV-2 geïnfecteerde patiënten vertoont dergelijke symptomen, variërend van zeer milde tot ernstige diarree. Bovendien kunnen SARS-CoV-2-genomen worden gedetecteerd in ontlastings- en maagdarmkanaalbiopten van geïnfecteerde patiënten15. Belangrijk is dat de aanwezigheid van gastro-intestinale symptomen niet beperkt is tot SARS-CoV-2, omdat ze ook werden waargenomen bij mers- en SARS-CoV-1-geïnfecteerde patiënten. Om te begrijpen hoe SARS-CoV-2 gastro-intestinale nood induceert en het tropisme van SARS-CoV-2 in het maagdarmkanaal nauwkeurig identificeert, zijn menselijke darmorganoïden een belangrijk hulpmiddel geweest en worden ze nu gebruikt om celtypespecifieke reacties op deze ziekteverwekker te ontrafelen16,17.
Transcriptionele profilering van een celpopulatie (bulk RNA-sequencing) is standaardpraktijk bij het evalueren van pathogene infecties van zowel onsterfelijke cellijnen als met organoïden. Hoewel dit ons in staat stelt om wereldwijde veranderingen te bepalen in reactie op pathogenen (bijv. Upregulatie van cytokines), stelt bulk RNAseq ons niet in staat om te bepalen waarom specifieke cellen in een populatie vatbaarder zijn voor infecties dan andere. Single-cell RNA sequencing (scRNAseq) is een krachtig hulpmiddel geworden om cellijn-specifieke transcriptionele programma's te ontrafelen en kan worden gebruikt om te bepalen hoe deze programma's virusinfectie ondersteunen of onderdrukken18,19. De eerste beschrijving van scRNAseq was in 2009 en werd gebruikt om de transcriptieprofielen van de verschillende cellen in een muisblastoomer20te evalueren. Deze technologieën zijn nu uitgebreid en kunnen via verschillende platforms worden geïmplementeerd. Vroege versies van deze technologie pasten fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS) toe om individuele cellen te scheiden voor sequencing, wat vaak beperkt was tot 96- of 384-well platen, waardoor 300 individuele cellen per monster werden geanalyseerd21. Deze methoden zijn nu ontwikkeld door de single-cell sequencing platforms, die een microfluïdisch apparaat gebruiken om afzonderlijke cellen in te kapselen in individuele druppels met barcode die kralen bevatten. Met deze technologie kunnen tot 10.000 cellen per monsterconditie worden gevangen.
Door organoïdentechnologie te combineren met scRNAseq kunnen we bestuderen hoe enterische pathogenen het maagdarmkanaal op een celtypespecifieke manier beïnvloeden. Er moeten echter verschillende technische en bioveiligheidsoverwegingen worden genomen. Eerst en vooral stellen klassieke organoïdenkweekmethoden (3-dimensionale (3D) organoïden, ingebed in een extracellulaire matrix (ECM)) de basolaterale kant van de epitheelcellen bloot aan de buitenkant van de organoïde. Omdat enterische pathogenen hun infectie initiëren door inname van besmet voedsel / water, begint de infectie meestal vanaf de apicale kant van de cellen, die niet toegankelijk is in deze 3D-darmorganoïden. Daarom moeten organoïden worden voorbereid om de apicale kant toegankelijk te maken voor pathogene infectie, hetzij door 2D-zaaien, waardoor de apicale kant van de cellen direct wordt blootgesteld, of door micro-injectie22,23. Ten tweede, om scRNAseq van geïnfecteerde biologische monsters uit te voeren, is het belangrijk om rekening te houden met hun infectieuze aard. Hoewel methoden zijn voorgesteld om cellen te fixeren en pathogenen te inactiveren voorafgaand aan eencellige isolatie voor volgende RNAseq, leiden deze methoden vaak tot een afname van de sequencingkwaliteit18. Het onderstaande protocol beschrijft verschillende benaderingen om intestinale organoïden te infecteren met enterische virussen, rekening houdend met de infectiezijde (apicale versus basolaterale infectie) (figuur 1). Daarnaast zal het protocol een workflow bevatten om afzonderlijke cellen te dissociëren en te isoleren van organoïden die zijn geïnfecteerd met hoogpathogene virussen voor scRNAseq. Het protocol zal de belangrijkste stappen benadrukken die moeten worden geïmplementeerd bij het werken onder bioveiligheidsniveau-3 (BSL-3) inperkingsomstandigheden om het ontstaan van aerosolen en mogelijke besmetting te voorkomen.
Protocol
Menselijk weefsel werd ontvangen van colonresectie of ileumbiopten van het Universitair Ziekenhuis Heidelberg voor het volgende protocol. Deze studie werd uitgevoerd onder de aanbevelingen van het Universitair Ziekenhuis Heidelberg met geïnformeerde schriftelijke toestemming van alle proefpersonen in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Alle monsters werden op geanonimiseerde wijze ontvangen en bijgehouden. Het protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Ziekenhuis Heidelberg onder protocol S-443/2017.
1. Onderhoud en passageing van intestinale en colonorganoïden
LET OP: Menselijke intestinale organoïden zijn afgeleid van menselijk weefsel of van geïnduceerde pluripotente / embryonale stamcellen, en als zodanig is ethische goedkeuring vereist. Landspecifieke voorschriften moeten worden gevolgd. Menselijk materiaal wordt over het algemeen niet getest en wordt daarom vaak beschouwd als BSL-2 materiaal. De juiste inperkingsvoorwaarden moeten worden bevestigd in het land waar het experiment plaatsvindt.
- Bereid intestinale en colonorganoïden uit geïsoleerde weefsels en/of biopten met behulp van eerder beschreven methoden2. Bovendien zijn meer technische details over het bereiden van organoïden uit patiënt-afgeleid materiaal of van iPSC's te vinden in Lees et al. en Mahe et al.24,25.
- Zodra organoïde culturen zijn vastgesteld, volgt u de hieronder beschreven splitsingsroutine om organoïden voor te bereiden op het uitvoeren van infecties met enterische pathogenen.
- Zaad 20-100 organoïden in 50 μL 100% ECM-oplossing in 24-well niet-weefselkweekbehandelde platen. Voeg 500 μL groeimedia(tabel 1)per put toe.
- Vervang de media om de 2 dagen door 250 μL van de oude media te verwijderen en 250 μL van de verse groeimedia aan elke put toe te voegen. Verwarm de media tot kamertemperatuur voordat u de media verwisselt.
LET OP: Koude media zullen de ECM-oplossing die organoïden bevat vloeibaar maken. - Passeer de organoïden eenmaal per week wanneer het binnenste donker begint te worden als gevolg van de opeenhoping van dode cellen. Een voorbeeld hiervan is te vinden in figuur 2.
- Verwijder op de dag van het splitsen de ECM-oplossing van -20 °C en ontdooi op ijs.
- Plaats de nieuwe lege celkweekplaat die zal worden gebruikt om de organoïden na het splitsen bij 37 °C te zaaien (dit vereist minimaal 1 uur om warm te zijn en kan een nacht worden opgewarmd). Verwarm de kweekmedia tot kamertemperatuur.
- Verwijder de groeimedia met een P1000-pipet en voeg gedurende 3 minuten 500 μL koude 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan elke put om de ECM-oplossing gedeeltelijk vloeibaar te maken en los te maken van de plaat.
- Om volledige verstoring van de ECM-oplossing te garanderen, gebruikt u een P1000-pipet (ingesteld op 450 μL). Pipetteer 10 keer op en neer om de PBS, ECM-oplossing en organoïden opnieuw op te schorten, breng de geresuspendeerde organoïden over in een conische buis van 15 ml en plaats ze op ijs.
- Verzamel meerdere putten van dezelfde organoïden in dezelfde conische buis.
- Als meerdere verschillende organoïden (verschillende donoren, verschillende secties, verschillende voorbehandeling, enz.) tegelijkertijd worden gesplitst, verzamel ze dan in verschillende conische buizen. Onderhoud tijdens het verzamelen de conische buizen op ijs.
- Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C. Verwijder de PBS voorzichtig met een pipet om de organoïde pellet aan de onderkant te behouden.
- Vermijd het gebruik van een vacuümafvalsysteem met een gemonteerde pipet, omdat de pellet van organoïden erg los zit en gemakkelijk kan worden aangezogen wanneer de PBS te snel wordt verwijderd.
- Voeg 1 ml 0,05% trypsine toe aan de conische buis en resuspend organoïden door 10 keer op en neer te pipetten met een P1000 pipet. Incubeer de conische buis met organoïden bij 37 °C gedurende 3 min.
- Voeg 2 ml DMEM/F12-media toe die 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine bevatten om de spijsvertering te stoppen en resuspend om de organoïden te verstoren door 10 keer op en neer te pipetteren met een P1000-pipet.
- Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C. Verwijder conische buisjes uit de centrifuge en bewaar ze op ijs.
- Verwijder media/trypsine voorzichtig met een wegwerppipet van 5 ml om de organoïde pellet aan de onderkant te behouden. Laat ongeveer 500 μL media staan en verwijder dit met een P1000 pipet.
- Zodra media/trypsine uit alle conische buizen is verwijderd, verwijdert u de met 24-putjes niet-celkweek behandelde plaat uit de incubator van 37 °C en plaatst u deze onder de celkweekkap.
- Voeg 100% ECM-oplossing (bewaard op ijs) toe aan de conische buis met de gesplitste organoïden in een verhouding van 1:3 tot 1:5, afhankelijk van de groeigewoonten van de individuele donororganoïden. (Als bijvoorbeeld een put met 20-100 organoïden in een druppel ECM-oplossing van 50 μL werd gepasseerd, resuspendeert u de organoïdekorrel in 150-250 μL ijskoude ECM-oplossing.)
- Zaad 50 μL ECM-oplossing/organoïdemengsel per putje van de 24-well niet-celkweekbehandelde plaat voorverwarmd tot 37 °C.
OPMERKING: ECM-oplossing zal zeer snel polymeriseren zodra deze is opgewarmd. Houd de ECM-oplossing te allen tijde koud (opgeslagen op ijs) tijdens gebruik. Wanneer organoïden opnieuw zijn opgehangen, zaai dan onmiddellijk op een nieuwe plaat. Voor beginners wordt aanbevolen om een doos pipetpunten bij -20 °C te bewaren om extra tijd voor het zaaien te hebben. - Incubeer de 24-well plaat bij 37 °C gedurende 10-15 minuten om de ECM-oplossing te laten polymeriseren.
- Voeg na polymerisatie 500 μL groeimedia(tabel 1)26 toe aan elke put en incubeer de organoïden bij 37 °C. Controleer de organoïden dagelijks door middel van microscopie. Vervang de media om de 2 dagen zoals in stap 1.4.
2. Voorbereiding van organoïden in twee dimensies (2D) voor apicale infectie
OPMERKING: Het volgende protocol beschrijft hoe darmorganoïden als een monolaag van cellen in een celkweekplaat kunnen worden gezaaid om darmepitheelcellen van hun apicale kant te infecteren. Gebruik de 48-well plaat voor de sequencing-experimenten en de 8-well glazen bodemkamerschuif om infectie te beheersen met behulp van immunofluorescentiebenaderingen.
- Kweek en onderhoud organoïden zoals beschreven in rubriek 1.
- Voordat organoïden in 2D worden gezaaid, bedekt u de 48-putplaten en 8-wells glasbodemkamerschuif met 200 μL 2,5% menselijk collageen in water per put gedurende 1 uur bij 37 °C.
OPMERKING: Intestinale organoïden kunnen het beste worden gezaaid in 48-well platen en in 8-well glazen-bodem kamer dia. De ervaring leert dat ze niet goed infecteren in 96-putplaten. Transwell-inserts kunnen ook worden gebruikt om zowel apicale als basolaterale infectie in 2D mogelijk te maken. Als transwells worden gebruikt, controleer dan de transepitheel elektrische weerstand (TEER) voorafgaand aan de infectie om een confluent monolaag te bevestigen. Normaal gesproken hebben darmorganoïden een strakke barrière met een TEER van 450-600 Ohm/cm2. - Zaad 100-150 organoïden in elke put van een 48-well plaat of voor een put van een 8-well glazen bodem kamer schuif.
- Om het aantal organoïden te schatten, telt u het aantal organoïden dat aanwezig is in de 50 μL ECM-oplossingsdruppel van de 24-putplaat die in sectie 1 is bereid. Gemiddeld zijn 1-2 putten nodig, die ongeveer 15.000-30.000 cellen zullen geven.
- Om de ECM-oplossing te verstoren en de organoïden te trypsiniseren, volgt u stappen 1.8-1.17.
- Verwijder menselijk collageen van de 48-well platen en de 8-well glazen-bodem kamer schuif.
- Resuspend de organoïde pellet in de conische buis in 250 μL groeimedia/put en voeg het mengsel toe aan de met collageen beklede putten. Plaats de plaat in een incubator van 37 °C.
OPMERKING: Bij het uitvoeren van de experimenten worden meerdere aandoeningen vergeleken (mock vs. geïnfecteerde +/- behandeling van belang). Om de variabiliteit tussen elke put van 2D-gezaaide organoïden te minimaliseren, verzamelt u het totale aantal noodzakelijke organoïden in dezelfde conische buis. Het verzamelen van organoïden uit maximaal 12 putten van een 24-putplaat kan 1 ml trypsine en 2 ml neutraliserende media gebruiken. Bij gebruik van 12-24 putten, verhoog dit tot 2 ml trypsine en 4 ml neutraliserende media. - Verwijder na 48 uur de plaat uit de couveuse en plaats deze in de celkweekkap. Verwijder de groeimedia en vervang deze door 250 μL per putje differentiatiemedia (tabel 1). Herhaal deze mediawissel 48 uur later.
- Bevestig na 48 uur differentiatie (vier dagen na overschakeling naar differentiatiemedia) door RNA te extraheren, cDNA te maken met 250 ng RNA en SYBR-groene qPCR uit te voeren met behulp van primers voor stamcellen (OLFM4 en / of SMOC2), bekercellen (MUC2), entero-endocriene cellen (CHGA) en enterocyten (SI en / of CYP3A4) (figuur 3).
OPMERKING: Bij het overschakelen van groeimedia naar differentiatiemedia zullen organoïden hun expressie van stamcelmarkers (OLFM4 en/of SMOC2) verminderen en de expressie van bekercellen (MUC2), entero-endocriene cellen (CHGA) en enterocyten (SI en/of CYP3A4) markers verhogen met qPCR. Bereid een extra goed voor en onderhoud met groeimedia om het expressieniveau van elke celtypespecifieke marker in groei versus differentiatiemedia te vergelijken. - Na bevestiging van differentiatie zijn organoïden klaar voor apicale infectie. Verplaats de organoïden naar het bioveiligheidsniveau dat vereist is voor de ziekteverwekker van keuze.
LET OP: Raadpleeg de lokale voorschriften en standaard operationele procedures van het instituut bij het hanteren van pathogenen onder BSL-2 of BSL-3 containment. - Om de in 2D gekweekte darmorganoïden vanaf hun apicale kant te infecteren, verwijdert u media met een P1000-pipet en voegt u pathogeen verdund toe bij de veelheid van infectie die nodig is voor het experiment in differentiatiemedia (minimaal volume pathogene / mediamix is 50 μL per put en maximaal volume is 250 μL per put).
- Laat de infectie gedurende 2 uur bij 37 °C doorgaan met een rockertafel in de celkweekincubator of door de plaat elke 15-20 minuten handmatig te schommelen. Optimaliseer deze tijd op basis van de ziekteverwekker van keuze.
- Verwijder na 2 uur het medium met een P1000-pipet en vervang het door 250 μL per putje verse differentiatiemedia. Incubateer cellen bij 37 °C tot het tijdstip van de single-cell sequencing.
- Om cellen voor te bereiden op single-cell sequencing, gaat u verder met rubriek 4.
3. Voorbereiding van organoïden in drie dimensies (3D) voor apicale en basolaterale infectie
- Kweek organoïden zoals beschreven in sectie 1 in een 24 put, niet-cel cultuur behandelde plaat.
- Twee dagen na het passeren, verwijder de plaat uit de couveuse en plaats in een celkweekkap.
- Verwijder de groeimedia met een P1000-pipet, vervang deze door 500 μL/put differentiatiemedia die voorverwarmd zijn tot kamertemperatuur en plaats de plaat in de incubator van 37 °C.
- Vervang na 48 uur door verse differentiatiemedia (500 μL/putje).
OPMERKING: Organoïden worden in totaal 4 dagen voorafgaand aan de infectie in differentiatiemedia gehouden. - Bevestig differentiatie zoals beschreven in stap 2.9.
- Na bevestiging dat differentiatie heeft plaatsgevonden, zijn organoïden klaar voor infectie.
- Ontdooi ECM op ijs. Verwarm de differentiatiemedia tot kamertemperatuur en verwarm een 24-putplaat op 37 °C.
- Om infecties uit te voeren, verwijdert u de organoïden uit de ECM-oplossing.
OPMERKING: Verwijder zoveel mogelijk ECM-oplossing omdat virussen liever aan de ECM-oplossing blijven plakken dan aan cellen. Als er te veel ECM-oplossing rond de organoïden overblijft, zal de infectiviteit ernstig worden beïnvloed. - Verstoor de ECU door 500 μL koude 1x PBS toe te voegen en gedurende 3 minuten te broeden. Gebruik een P1000 om 10x op en neer te pipetten. Combineer organoïden in een buis en centrifugeer gedurende 5 min bij 500 x g. Verwijder PBS met een P1000.
OPMERKING: Om de variabiliteit tussen elke infectietoestand te minimaliseren, combineert u de organoïden die uit verschillende putten van een 24-putplaat komen in dezelfde conische buis. Als er bijvoorbeeld acht infectievoorwaarden nodig zijn, worden acht putten van een plaat met 24 putten (met elk ~ 100 organoïden) gecombineerd en vervolgens verdeeld in acht putten van een nieuwe 24-putplaat na verstoring van de naald (zie stap 3.12). - Resuspend de organoïden in 1 ml differentiatiemedia. Voor apicale en basolaterale infectie volgt u stap 3.10.1 en voor basolaterale infectie volgt u alleen stap 3.10.2.
- Bevestig een naald van 27 G aan een spuit van 1 ml en resuspend de pellet zes keer om verstoring van organoïden mogelijk te maken en infectie op te laten treden aan zowel de apicale als de basolaterale zijde. Ga verder met stap 3.11.
OPMERKING: De organoïden moeten de klassieke cyste-uitziende en octopus-budded organoïden zijn met een donker centrum wanneer ze worden waargenomen voorafgaand aan naaldverstoring. Na de verstoring zullen deze organoïden kleiner lijken met minder tot geen donker interieur. Bij het uitvoeren van infectie zullen er altijd minimaal twee aandoeningen zijn (mock en infectie), minimaal twee putten van een 24-well plaat zullen in eerste instantie worden gecombineerd in een conische buis van 15 ml voor op naald gebaseerde verstoring (wat verklaart waarom een minimum van 1 ml wordt gebruikt voor resuspensie). Combineer bij het uitvoeren van meer dan twee omstandigheden maximaal 10 putten van een 24-putplaat in een enkele conische buis van 15 ml en resuspend in 1 ml differentiatiemedia voor naaldverstoring. Voeg na de verstoring 500 μL differentiatiemedia per n + 1 toe (bijvoorbeeld als u 10 putten gebruikt, vul dan bij met 4,5 ml om een totaal van 5,5 ml te hebben). Als er meer dan 10 omstandigheden nodig zijn, gebruik dan verschillende conische buizen. Een spuit van 1 ml wordt aanbevolen omdat organoïden beter worden verstoord met dit volume van de spuit. Een alternatief voor een spuit is het gebruik van een goed afgeplatte P1000-tip. - Resuspend de organoïden in 500 μL differentiatiemedia per put. Pas op dat u de organoïden niet verstoort en zorg ervoor dat de apicale kant niet toegankelijk is. Ga verder met stap 3.11.
- Bevestig een naald van 27 G aan een spuit van 1 ml en resuspend de pellet zes keer om verstoring van organoïden mogelijk te maken en infectie op te laten treden aan zowel de apicale als de basolaterale zijde. Ga verder met stap 3.11.
- Breng 500 μL organoïde suspensies per put over naar een 24-well celkweekplaat met behulp van een P1000-pipet en verplaats de plaat naar het bioveiligheidsniveau dat vereist is voor de ziekteverwekker van keuze.
LET OP: Raadpleeg de lokale voorschriften en de standaard operationele procedures van het instituut bij het hanteren van pathogenen onder BSL-2 of BSL-3 containment. Voer altijd de naaldverstoring van de organoïden buiten de BSL-3 uit om mogelijke ongelukken met de naald te voorkomen. Lokale regelgeving kan ook het gebruik van naalden in de BSL-3 voorkomen. - Voeg het pathogeen verdund in differentiatiemedia toe om de veelheid van infectie te bereiken die nodig is voor het experiment. Overschrijd een totaal volume van 500 μL niet (om 1 ml totaal in de 24-well plaat te hebben).
- Laat de infectie 2 uur duren (deze keer moet deze worden aangepast aan de ziekteverwekker van keuze) bij 37 ° C met een rockertafel in de celkweekincubator of door de plaat elke 15-20 minuten handmatig te schommelen.
- Verzamel na de incubatietijd van 2 uur de organoïden in één buis van 1,5 ml per conditie en draai gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 500 x g.
- Verwijder de media die pathogeen bevatten met een P1000-pipet en bewaar deze op ijs. Was de organoïdenkorrel eenmaal met PBS.
- Resuspend de organoïden in 50 μL 100% ECM-oplossing (die eerder op ijs was ontdooid), plaat in een 24-well niet-cel cultuur behandelde plaat voorverwarmd tot 37 °C en incubeer de 24-well plaat bij 37 °C gedurende 10-15 minuten om de ECM-oplossing te laten polymeriseren.
- Voeg na polymerisatie 500 μL differentiatiemedia bij kamertemperatuur toe aan elke put en incubeer bij 37 °C tot de oogst voor eencellige sequencing.
OPMERKING: Als het oogsten meer dan 48 uur na het zaaien moet plaatsvinden, vervang de media dan om de 2 dagen door de oude media te verwijderen en te vervangen door 500 μL verse differentiatiemedia. De ervaring heeft echter geleerd dat, aangezien organoïden onder differentiatiemedia worden gekweekt, ze niet veel langer dan 48 uur zullen overleven.
4. Bereiding van eencellige oplossing en bereiding van gelparels-in-emulsie (GEMs) in bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3) omstandigheden
OPMERKING: Het voltooien van de volgende stappen vereist dat de single cell sequencing-apparatuur(Tabel van materialen)en een PCR-machine die 100 μL-reacties kan verwerken, aanwezig zijn in een BSL-3-faciliteit. Organoïden worden gekweekt zoals beschreven in rubriek 1 en geïnfecteerd zoals beschreven in rubrieken 2-3, afhankelijk van de ziekteverwekker en de toegangsroute. Op een vooraf bepaald tijdstip na infectie worden organoïden geoogst. Hieronder wordt de methode beschreven die wordt gebruikt om intestinale organoïden te oogsten.
- Voordat u geïnfecteerde organoïden oogst, verwijdert u de Single Cell Gel-kralen(Table of Materials) van-80 °C en warmt u op tot kamertemperatuur (ten minste 30 minuten eerder).
- Breng bovendien het RT-reagens, reductiemiddel B en RT-enzym C (allemaal bewaard bij -20 °C) in evenwicht met kamertemperatuur. Resuspend de sjabloonschakelaar oligo zoals beschreven in de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd met betrekking tot de lokale bioveiligheidsvoorschriften volgens de vastgestelde standaardwerkwijze voor de beschouwde ziekteverwekker. Als vuistregel voor BSL-3-werk moet ervoor worden gezorgd dat de buitenkant van alle vaten (platen, buizen, enz.) die een celkweekkap verlaten, goed worden gedesinfecteerd. Hetzelfde geldt voor de handen/handschoenen van de persoon die de experimenten uitvoert. - Om infecties uit te voeren op organoïden die in 2D zijn gezaaid (sectie 2), gaat u verder met stap 4.4. Om infecties op 3D-organoïden uit te voeren (sectie 3) gaat u naar sectie 4.5.
- Breng voor infecties van 2D-organoïden de celkweekplaat in de kap en verwijder de differentiatiemedia met een P1000-pipet.
- Voeg 250 μL 1x PBS bij kamertemperatuur toe aan elke put.
- Verwijder de PBS met een P1000 pipet en voeg 250 μL dissociatie-enzym bij kamertemperatuur (bijv. TrypLE Express) toe aan elke put van een 48-well plaat. Vervang de handschoenen, maak de plaat schoon en plaats de plaat met het dissociatie-enzym in de incubator van 37 °C.
- Observeer de celdissociatie door microscopie elke 5 minuten.
OPMERKING: Ongeveer duurt het 15 minuten om intestinale organoïden gekweekt in 2D in enkele cellen te dissociëren. Deze tijd zal moeten worden aangepast, omdat het zal afhangen van het aantal organoïden dat in eerste instantie werd gezaaid en geïnfecteerd, evenals van de ziekteverwekker, omdat sommige pathogenen meer cytopathisch zijn en ervoor zorgen dat organoïden veel sneller dissociëren dan andere. - Breng na bevestiging van een schijnbare eencellige suspensie de plaat terug in de celkweekkap en stop de vertering door toevoeging van 250 μL DMEM/F12-media met 10% FBS per put van een 48-well plaat.
- Verzamel de cellen in een conische buis van 15 ml met behulp van een P1000-pipet.
- Vervang de handschoenen, maak de buis schoon en draai de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C op 500 x g.
- Verwijder voorzichtig het media/dissociatie-enzym met een P1000 om de celkorrel aan de onderkant te behouden. Resuspend enkele cellen in een minimaal volume PBS met 0,1% BSA. Voor intestinale organoïden, resuspend in 250 μL voor elke put van de 48-well plaat.
- Breng de celsuspensies in een FACS-buis met een filter om eventuele grote klonten te verwijderen en plaats de FACS-buis met cellen op ijs.
- Ga verder met stap 4.6 om door te gaan met het tellen van cellen en het bereiden van de mastermix.
- Voor infecties van 3D-organoïden, verwijder de plaat uit de incubator en plaats deze in de celkweekkap.
- Verwijder de differentiatiemedia uit elke put van de 24-putplaat met een P1000-pipet. Voeg 500 μL ijskoude 1x PBS toe aan elke put en incubeer gedurende 3 minuten op ijs.
- Om volledige verstoring van de ECM-oplossing te garanderen, gebruikt u een P1000-pipet (ingesteld op 450 μL). Pipetteer 10 keer op en neer om de PBS, ECM-oplossing en organoïden opnieuw te suspenderen; breng de geresuspendeerde organoïden over in een conische buis van 15 ml en plaats ze op ijs. Verzamel elke infectietoestand in zijn eigen conische buis van 15 ml.
OPMERKING: Het gebruik van een conische buis van 15 ml geeft een betere, meer onderscheidende celkorrel dan een conische buis van 50 ml of een buis van 1,5 ml. - Vervang de handschoenen en verwijder de buis van de celkweekkap. Maak de buitenkant van de buis schoon.
- Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C.
- Verplaats de buis terug in de celkweekkap en verwijder PBS met een P1000-pipet om te voorkomen dat de organoïdenkorrel van de bodem van de buis wordt geresuspendeerd.
- Resuspend de pellet in 1 ml dissociatie-enzym (bijv. TrypLE Express). Vervang de handschoenen, maak de buis schoon en incubeer de monsters bij 37 °C.
- Beweeg elke 10 minuten gedurende 30 minuten de buis terug in de celkweekkap en resuspend de organoïden door 10 keer op en neer te pipetteren met een P1000-pipet.
OPMERKING: Normaal gesproken hebben intestinale organoïden ongeveer 30 minuten nodig om een eencellige suspensie te vormen wanneer ze in 3D zijn geïnfecteerd. - Om te bepalen wanneer organoïden worden gedissocieerd naar afzonderlijke cellen, neemt u 10 μL van de organoïde suspensie met behulp van een p10-pipet.
- Plaats de suspensie in een plastic wegwerpkijker. Sluit de sample-ingangspoort af met doorzichtige tape.
- Vervang handschoenen en maak de buitenkant van de celteller schoon. Gebruik een brightfield microscoop om te bepalen of een enkele cel suspensie is gemaakt.
- Na bevestiging van een eencellige suspensie stopt u de vertering door 1 ml DMEM/F12-media met 10% FBS toe te voegen en pipetteer 10 keer op en neer met een P1000-pipet.
- Vervang de handschoenen, maak de buis schoon en draai de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C op 500 x g.
- Verwijder het media-/dissociatie-enzym voorzichtig met een P1000-pipet om te voorkomen dat de celkorrel opnieuw wordt opgehangen vanaf de bodem van de buis.
- Resuspend de afzonderlijke cellen in een minimaal volume PBS met 0,1% BSA. Voor intestinale organoïden resuspend in 250 μL.
- Breng de celsuspensies in een FACS-buis met een filter om eventuele grote klonten te verwijderen en plaats de FACS-buis met cellen op ijs.
- Ga verder met stap 4.6 om door te gaan met het tellen van cellen en het bereiden van de mastermix.
- Bepaal het aantal cellen per μL door 10 μL van de celsuspensie toe te voegen aan een plastic wegwerpceltelkamer.
- Sluit de monsterinvoerpoort af met doorzichtige tape voordat u het monster van de celkweekkap verwijdert, omdat de celsuspensie in dit stadium nog steeds infectieus is.
- Verander handschoenen, maak de celtelkamer schoon en tel het celnummer met een brightfield-microscoop.
- Bereid in de celkweekkap een hoofdmix van RT-reagens, Template Switch Oligo, Reducing Agent B en RT-enzym C in een buis van 1,5 ml volgens de instructies van de fabrikant, afhankelijk van het aantal monsters in het experiment. Voor elk monster wordt 33,4 μL mastermengsel in een PCR-buis gemengd en op ijs bewaard.
- Voeg de cellen en het water toe aan de hoofdmix volgens het doelcelnummer zoals beschreven in de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: 50% -60% van de cellen wordt normaal gesproken teruggewonnen (d.w.z. bij het laden van 10.000 cellen op de chip worden 5.000-6.000 cellen gebruikt voor analyse). Laad daarom altijd 10.000 cellen. Als de celdichtheid dit niet toelaat, centrifugeer dan de cellen en resuspend in een lager volume. Zorg ervoor dat u de chip niet overbelast, omdat dit zal resulteren in verstopping van de chip. Bovendien, als cellen niet goed worden gedissocieerd, zal er een verhoogd risico zijn op het krijgen van meerdere cellen per kraal, die moeten worden verwijderd in de downstream bio-informaticaverwerking. - Vervang de handschoenen, verplaats de eencellige controller in de celkweekkap en bereid de chip voor, omdat de chip alleen bedekt is met een pakking die niet is afgedicht.
OPMERKING: De machine moet zich in de motorkap bevinden om blootstelling aan geïnfecteerde celsuspensies en mogelijke aerosolen te voorkomen. - Voeg de eencellige chip toe aan de chiphouder en vul de ongebruikte banen met 50% glycerol.
- Voeg de hoofdmix, kralen en scheidingsolie toe aan de rijstroken die worden gebruikt voor monsters volgens de instructies van de fabrikant.
- Bedek de chip met de pakking, laad de chip in de controller en start het programma.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om slechts zes van de acht rijstroken te laden. Problemen met onjuiste emulsies komen vaak voor in rijstrook één en acht. Het bedrijf zegt dat alle rijstroken onafhankelijk zijn en dat dit niet mag gebeuren; vermijd echter indien mogelijk deze twee rijstroken en voer twee chips uit als er acht monsters nodig zijn. - Verwijder na voltooiing van het programma de chip en de pakking.
- Gebruik een meerkanaalspipet en breng 100 μL van de emulsies over op een schone PCR-buis. Zorg ervoor dat elke put een uniforme witte kleur heeft die aangeeft dat er een volledige emulsie heeft plaatsgevonden.
- Vervang handschoenen, reinig de buizen en breng de PCR-buis over naar een PCR-machine die 100 μL-reacties kan ondersteunen. Voer het programma uit: 53 ° C gedurende 45 minuten; 85 °C gedurende 5 min.
- Bewaar de monsters na voltooiing bij 4 °C. Verwerk de reactie op dit punt volgens de instructies van de fabrikant of bewaar bij 4 °C gedurende 3 dagen of -20 °C gedurende 1 week.
- Na 5 minuten bij 85 °C worden de meeste omhulde virussen geïnactiveerd, verwijderen ze het cDNA uit de BSL-3 volgens de normale werkwijze en voeren ze de bibliotheekvoorbereidingen uit in een BSL-1 laboratorium.
OPMERKING: Dit experiment moet worden uitgevoerd als drie biologische replicaties (bijvoorbeeld op drie verschillende dagen) omdat de mate van differentiatie van elk celtype enigszins kan variëren tussen elk experiment. De resulterende sequencingbibliotheken kunnen verschillend worden geïndexeerd en samen in één sequencingrun worden gesequenced.
Representative Results
Bereiding van organoïden voor eencellige sequencing
Single-cell sequencing resultaten zijn sterk afhankelijk van het gebruik van cellen van goede kwaliteit. Om ervoor te zorgen dat organoïden van goede kwaliteit zijn, moeten ze goed worden onderhouden en dagelijks worden geobserveerd om te bepalen wanneer ze klaar zijn om te worden gesplitst(figuur 2). De timing van het splitsen van organoïden is donorafhankelijk; sommige donoren groeien sneller en moeten om de 5 dagen worden gesplitst, terwijl andere langzamer zijn en om de 10 dagen moeten worden gesplitst. Gemiddeld worden organoïden één keer per week gesplitst wanneer de centra donker worden(figuur 2B). Als organoïden te groot worden en te veel dode cellen in het midden verzamelen, zal de organoïde sterven.
Organoïden worden onderhouden in een medium dat grote hoeveelheden Wnt3A bevat. Dit ondersteunt de stamcelniche en bevordert de organoïden om te blijven groeien en prolifereren. Onder deze groeiomstandigheden bevatten de organoïden grote hoeveelheden stamcellen en transitversterkende cellen en een lagere hoeveelheid gedifferentieerde celpopulaties zoals volwassen enterocyten, gobletcellen en entero-endocriene cellen. Om echter de cellulaire complexiteit in de menselijke darm na te bootsen, is het belangrijk om celdifferentiatie te stimuleren en meer van deze cellen te produceren. Dit wordt bereikt door de mediacondities te veranderen en Wnt3A te verwijderen en R-Spondin en Noggin te verminderen(tabel 1). Normaal gesproken vereist cellulaire differentiatie naar enterocyten, bekercellen en entero-endocriene cellen 4 dagen differentiatiemedia(figuur 3). Het is belangrijk om een goede differentiatie te verkrijgen; anders zal het evalueren van pathogeen tropisme en celtypespecifieke reacties moeilijk worden.
Bevestiging van BSL-3 pathogene inactivatie
Volledige inactivatie moet worden bevestigd met de ziekteverwekker van keuze en gevalideerd dat het veilig is om het cDNA uit de BSL-3 te verwijderen. Voor SARS-CoV-2 werd volledige inactivatie van het virus gevalideerd door 100 μL SARS-CoV-2 te nemen en het gedurende 5 minuten bij 85 °C in een PCR-machine te incuberen. Het virus werd vervolgens weer toegevoegd aan naïeve Vero-cellen en virusinfectie werd vergeleken met niet-warmtebehandeld virus door immunofluorescentie en plaquetests op 24 uur, 48 uur en 72 uur na infectie om ervoor te zorgen dat alle deeltjes niet langer besmettelijk waren. Deze resultaten werden naar de lokale regelgevende instantie gestuurd en na hun goedkeuring werd het eencellige experiment en de cDNA-verwerking uitgevoerd.
Resultaten van eencellige sequencing
Om te evalueren hoe SARS-CoV-2 menselijke colon- en ileumorganoïden infecteert, werd eencellige sequencing uitgevoerd. Organoïden werden bereid zoals hierboven beschreven en geïnfecteerd in een 2D-formaat om apicale infectie door SARS-CoV-2 mogelijk te maken. Geïnfecteerde cellen werden geoogst op 12 uur en 24 uur na infectie en werden verwerkt voor eencellige sequencing zoals hierboven beschreven. Analyse van de eencellige sequencinggegevens stelde ons in staat om te bepalen dat alleen een subpopulatie (onrijpe enterocyt 2) van menselijke darmepitheelcellen de infectie van SARS-CoV-2 ondersteunde (figuur 4). Bovendien, omdat niet alle cellen in een populatie waren geïnfecteerd, werden zowel geïnfecteerde cellen als niet-geïnfecteerde omstandercellen geanalyseerd(figuur 5). Deze resultaten toonden aan dat SARS-CoV-2 een pro-inflammatoire signaalcascade veroorzaakte in geïnfecteerde cellen, terwijl niet-geïnfecteerde omstandercellen een interferon-gemedieerde immuunrespons vertoonden. Bovendien toonde scRNA-Seq aan dat geïnfecteerde cellen niet in staat waren om interferonen te detecteren als gevolg van virusgemedieerde blokkering van de route(figuur 5). Het was niet mogelijk om deze informatie te verkrijgen bij gebruik van bulk RNA-sequencing.
Figuur 1: Schema van de drie verschillende methoden om menselijke intestinale organoïden voor te bereiden op infectie met enterische pathogenen. Apicale infectie kan worden bereikt door darmorganoïden in 2D te zaaien. Een apicale en basolaterale infectie kan worden uitgevoerd door de 3D-organoïde te verstoren. Ten slotte kan een basolaterale infectie alleen worden uitgevoerd door intacte 3D-darmorganoïden te infecteren. Elk van deze methoden kan worden gebruikt om monsters te genereren voor single cell sequencing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Organoïde onderhoudsschema en representatieve brightfield beelden. (A) Schema voor onderhoud en passageing van menselijke intestinale organoïden. (B). Representatieve brightfield beelden van dag 1, 3, 5 en 7 na het splitsen. Op dag 7 worden de organoïden groot en donker door de opeenhoping van dode cellen en zijn ze klaar om gesplitst te worden. Schaalbalk geeft 25 μm aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve qPCR van menselijke intestinale organoïden 4 dagen na het overschakelen naar differentiatiemedia. Intestinale organoïden werden gedurende 4 dagen in groeimedia gehouden of overgeschakeld op differentiatiemedia. RNA werd geoogst en qPCR werd uitgevoerd voor markers van stamcellen (OLFM4), Paneth-cellen (LYZ), Goblet-cellen (MUC2) en enterocyten (SI). N = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Identificatie van de celpopulatie geïnfecteerd met SARS-CoV-2. Van menselijke dikke darm en ileum afgeleide organoïden waren geïnfecteerd met SARS-CoV-2. Na 12 en 24 uur na infectie werden cellen geoogst en onderworpen aan eencellige RNA-sequencing om te identificeren welke celpopulaties SARS-CoV-2-infectie ondersteunden. Virusinfectie bleek in de loop van de tijd toe te nemen en voornamelijk onrijpe enterocyt 2 te infecteren. Dit cijfer is gewijzigd van Triana et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Bepaling van de intrinsieke aangeboren immuunrespons. Van de menselijke dikke darm afgeleide organoïden waren geïnfecteerd met SARS-CoV-2. Na 12 en 24 uur na infectie werden cellen geoogst en onderworpen aan eencellige RNA-sequencing om de intrinsieke aangeboren immuunrespons in zowel viraal geïnfecteerde als niet-geïnfecteerde omstandercellen te bepalen. SARS-CoV-2 geïnfecteerde cellen vertoonden een sterke pro-inflammatoire respons, terwijl niet-geïnfecteerde omstandercellen een interferon-gemedieerde respons vertoonden. Figuur gewijzigd van Triana et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Groeimedia | |
| Verbinding | Eindconcentratie |
| Ad DMEM/F12 | GlutaMAX (1x) |
| + GlutaMAX | Hepes 1mm |
| +HEPES | Pen 10 U/mL |
| +P/S | Streptokokken 10 μg/ml |
| L-WRN | 50% van het volume |
| B27 | 01:50 |
| N-acetyl-cysteïne | 1mm |
| EFG | 50 ng/ml |
| A83-01 | 500 nM |
| IGF-1 | 100 ng/ml |
| FGF basis | 50 ng/ml |
| Gastrin | 10 meter |
| Differentiatie Media | |
| Verbinding | Eindconcentratie |
| Ad DMEM/F12 | GlutaMAX (1x) |
| + GlutaMAX | Hepes 1mm |
| +HEPES | Pen 10 U/mL |
| +P/S | Streptokokken 10 μg/ml |
| B27 | 01:50 |
| N-acetyl-cysteïne | 1mm |
| R-spondin | 5% van het volume |
| Noggin | 50 ng/ml |
| EFG | 50 ng/ml |
| Gastrin | 10 meter |
| A83-01 | 500 nM |
Tabel 1: Mediasamenstelling voor groei- en differentiatiemedia.
Discussion
Enterische pathogenen initiëren meestal hun levenscyclus door darmepitheelcellen te infecteren vanaf hun apicale kant naar het lumen van de darm. Hoewel organoïden algemeen worden erkend als een goed model om de cellulaire complexiteit en organisatie van het darmepitheel te reproduceren, maken hun organisatie als driedimensionale, gesloten structuren hun apicale membraan ontoegankelijk voor de ziekteverwekker. Dit protocol beschreef methoden voor het infecteren van intestinale organoïden vanaf hun apicale kant, hun basolaterale kant of beide met BLS-3 pathogenen. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast om elke enterische ziekteverwekker onder BSL-2- of BLS-3-insluiting of een ander organoïdemodel te bestuderen door een paar kritieke stappen te volgen die hieronder worden gemarkeerd. De hierboven beschreven methode is voor de isolatie en bereiding van eencellige druppels in overeenstemming met de voorschriften in Duitsland. Als disclaimer beschrijft dit protocol niet de bioveiligheidsmaatregelen (standaard operationele procedures) die moeten worden genomen tijdens het werken onder BSL-3-omstandigheden. Het is ook belangrijk om erop aan te dringen dat de voorschriften in andere landen kunnen verschillen en dat de lokale autoriteiten moeten worden gecontacteerd om ervoor te zorgen dat alle lokale voorschriften worden nageleefd.
Een van de kritieke stappen bij het zaaien van organoïden in twee dimensies voor apicale infectie is het controleren dat cellen op dezelfde manier zullen differentiëren in vergelijking met wanneer ze worden gekweekt als klassieke driedimensionale organoïden. Afhankelijk van de enterische ziekteverwekker kan tropisme worden beperkt tot zeer zeldzame cellen of tot cellen die sterk gedifferentieerd moeten zijn. In dit geval zou het gebruik van een tweedimensionale organoïde die niet volledig differentieert, kunnen resulteren in de verkeerde conclusie dat deze enterische ziekteverwekker geen intestinale organoïden kan infecteren. Er wordt voorgesteld om, indien mogelijk, infecties uit te voeren met behulp van de drie configuraties van dit protocol: 2D-organoïde alleen voor apicale infectie (sectie 2), opengebroken 3D-organoïden voor apicale en basolaterale infectie (sectie 3) en volledige 3D-organoïden voor basolaterale infectie alleen (sectie 3). Deze aanpak zal helpen om de toegangsroute van de ziekteverwekker (apicale versus basolaterale) te onderscheiden en zal ook controleren dat een vergelijkbaar niveau van differentiatie is bereikt. Een alternatief voor 2D-apicale infectie is micro-injectie, waarbij een 3D-organoïde wordt gebruikt, maar de ziekteverwekker rechtstreeks in de apicale kant wordt afgeleverd (zie Bartfeld et al.27 voor details). Deze methode vereist een bekwame injector om ervoor te zorgen dat de ziekteverwekker op de juiste manier wordt geplaatst en dat de organoïden intact blijven. Micro-injectie wordt vaak gebruikt in BSL-2 containment en is mogelijk niet geschikt voor BSL-3 containment.
Een extra belangrijke overweging bij het uitvoeren van infectie-experimenten in 2D-gezaaide organoïden is de uiteindelijke celdichtheid. Zoals vermeld in stap 2.3, worden 100-150 organoïden gezaaid in een put van een 48-well plaat of een put van een 8-well glazen bodem kamer schuif. Afhankelijk van de organoïdelijn en van de persoon die de organoïden hanteert, kan de grootte van deze organoïden aanzienlijk verschillen. Dit kan resulteren in zeer verschillende celdichtheden in de 48-well plaat of 8-well glazen-bodem kamer schuif. Afhankelijk van het enterische virus geven sommige virussen de voorkeur aan meer schaarse cellen, terwijl anderen ook confluente cellen kunnen infecteren. De moleculaire oorsprong van dergelijke verschillen in infectiviteit voor verschillende celconfluenties is niet duidelijk; daarom moeten proefexperimenten worden uitgevoerd die gericht zijn op het vinden van de beste celdichtheid voor het enterische pathogeen van keuze voordat verdere downstream-karakterisering wordt uitgevoerd.
Vaak wordt FACS-sortering uitgevoerd voorafgaand aan het uitvoeren van de eencellige druppelemulsie. Deze stap wordt vaak gebruikt om doden van levende cellen en enkele cellen van doubletten te scheiden. Bij het werken met BSL-3-pathogenen vereist het dat de faciliteit is uitgerust met een geschikte FACS-sorteerder, wat niet vaak het geval is. Verder hebben niet alle cellen in een organoïde dezelfde grootte en is het vaak moeilijk om onderscheid te maken tussen een doublet of een grotere cel, waardoor het risico bestaat dat er negatief wordt geselecteerd op een specifiek celtype. Ook is er nog steeds discussie in het veld of de tijd die nodig is voor het sorteren tussen 5.000-10.000 voor elk monster zou kunnen resulteren in een significante wijziging van het transcriptprofiel van de individuele cellen. Hoewel celfixatiemethoden die compatibel zijn met single-cell sequencing (bijv. Methanol en RNAassist) zijn beschreven, werd waargenomen dat dit leidt tot een afname van de kwaliteit van sequencing18. Ten slotte wordt vermoed dat het sorteren van cellen met behulp van celdoodmarkers ook tot een bias kan leiden. Gezien de directionele proliferatie en differentiatie van de cellen door de crypt-villi-as, bevinden de meest gedifferentieerde cellen, die zullen worden afgestoten en vrijgegeven, zich aan de punt van de villi. Deze cellen zijn vaak positief voor verschillende markers van celdoodroutes(bijv. Apoptose, necrose en necroptose); echter, wanneer wordt gekeken naar rotavirusinfectie van de darm van muizen, is de punt van de villi het meest geïnfecteerde gebied28. Het filteren van cellen die er positief uitzien voor doodsmarkers zou dus resulteren in een negatieve selectie van de geïnfecteerde cellen die de fysiologische infectie kunnen vertegenwoordigen. Momenteel is er geen goede oplossing voor het sorteren en fixeren van organoïden voorafgaand aan single-cell sequencing. Het gebruik van levende, ongesorteerde cellen wordt aanbevolen omdat verdere studies nodig zijn om geschikte alternatieve protocollen te vinden.
Single-cell sequencing heeft een revolutie teweeggebracht in de manier waarop cellulaire reacties kunnen worden geëvalueerd. Deze techniek maakt het mogelijk om cellijnspecifieke reacties te identificeren, zowel in basale omstandigheden als onder pathogene infecties. Deze methode heeft deuren geopend op veel gebieden die voorheen werden beperkt door bulkuitlezingen. Hoewel deze methode zeer krachtig is, heeft het zijn beperkingen. Een belangrijke beperking is de uitgebreide bioinformatische analyse die stroomafwaarts van de sequencing vereist is. Dit is vooral belangrijk bij het analyseren van weefsels en het toewijzen van celtypen waar momenteel geen annotatie is. Het hebben van een bekwame bio-informaticus is vereist om alle eencellige studies te ondersteunen.
Dit protocol beschrijft hoe menselijke darmorganoïden te zaaien en te hanteren, ze te infecteren met enterische pathogenen en scRNAseq uit te voeren. Aanpassing van deze benadering aan andere organen is nu mogelijk, omdat voor de meeste organen organoïde modelsystemen zijn ontwikkeld. Long- en leverorganoïden zijn op dezelfde manier georganiseerd in vergelijking met intestinale organoïden en als zodanig kunnen met behulp van een analoge benadering naar deze organoïden worden getransponeerd. De kritische controle zal zijn om te valideren dat wanneer ze in twee dimensies worden gekweekt of opengebroken, deze organoïden een vergelijkbare differentiatie bereiken als hun 3D-organoïde tegenhangers. De specifieke kenmerken en genen die een gedifferentieerde status definiëren, zijn specifiek voor elk orgaanmodel. Andere organoïde modellen zoals nier- en vasculaire organoïden, grote dichte structuren, zullen aanvullende methoden nodig hebben om deze structuren serieel te dissociëren in enkele cellen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Megan Stanifer en Steeve Boulant werden ondersteund door onderzoekssubsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Projectnummer 240245660, 278001972, 415089553, en 272983813 aan Steeve Boulant en 416072091 aan Megan Stanifer), de deelstaat Baden-Wuerttemberg en het Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B aan MS en 01KI20198A en (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) aan SB. Schematiek werd gemaakt in BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
| 24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
| 8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
| A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
| B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
| CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
| CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
| DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
| Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
| Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
| GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
| HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
| L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
| MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
| MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
| MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
| N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
| OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
| OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
| Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
| Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
| Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
| SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
| SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
| TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
| Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |
References
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tekes, G., Ehmann, R., Boulant, S., Stanifer, M. L. Development of feline ileum- and colon-derived organoids and their potential use to support feline coronavirus infection. Cells. 9, (2020).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375, 409-424 (2019).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26, 1077-1083 (2020).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- de Graaf, M., van Beek, J., Koopmans, M. P. Human norovirus transmission and evolution in a changing world. Nature Reviews Microbiology. 14, 421-433 (2016).
- Leshem, E., et al. Real-world effectiveness of pentavalent rotavirus vaccine among bedouin and jewish children in southern Israel. Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society Of America. 62, Suppl 2 155-160 (2016).
- Karst, S. M. The influence of commensal bacteria on infection with enteric viruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 197-204 (2016).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353, 1387-1393 (2016).
- de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D., Munster, V. J. SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 523-534 (2016).
- Scaldaferri, F., et al. The thrilling journey of SARS-CoV-2 into the intestine: From pathogenesis to future clinical implications. Inflammatory Bowel Diseases. 26, 1306-1314 (2020).
- Kipkorir, V., Cheruiyot, I., Ngure, B., Misiani, M., Munguti, J. Prolonged SARS-CoV-2 RNA detection in anal/rectal swabs and stool specimens in COVID-19 patients after negative conversion in nasopharyngeal RT-PCR test. Journal of Medical Virology. 92, 2328-2331 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369, 50-54 (2020).
- Stanifer, M. L., et al. Critical role of type III interferon in controlling SARS-CoV-2 Infection in human intestinal epithelial cells. Cell Reports. 32, 107863 (2020).
- Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. bioRxiv. , (2020).
- Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Molecular Systems Biology. 17, 10232 (2021).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 1-14 (2018).
- García-Rodríguez, I., Sridhar, A., Pajkrt, D., Wolthers, K. C. Put some guts into it: Intestinal organoid models to study viral infection. Viruses. 12, 1288 (2020).
- Stanifer, M. L., et al. Asymmetric distribution of TLR3 leads to a polarized immune response in human intestinal epithelial cells. Nature Microbiology. 5, 181-191 (2020).
- Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478 (2019).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52483 (2015).
- Fujii, M., et al. Human Intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: Culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter Pylori. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53359 (2015).
- Hernandez, P. P., et al. Interferon-lambda and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection. Nature Immunology. 16, 698-707 (2015).
