Summary
Detta protokoll beskriver hur man infekterar mänskliga intestinala organoider från antingen deras apikala eller basolateral sida för att karakterisera värd/patogen interaktioner på encells nivå med hjälp av encelliga RNA sekvensering (scRNAseq) teknik.
Abstract
Mänskliga intestinala organoider utgör den bästa cellulära modellen för att studera patogeninfektioner i mag-tarmkanalen. Dessa organoider kan härledas från alla delar av mag-tarmkanalen (magsäck, jejunum, tolvfingertarms, ileum, kolon, ändtarm) och, vid differentiering, innehålla de flesta av de celltyper som finns naturligt i varje enskilt avsnitt. Till exempel innehåller intestinala organoider näringsabsorberande enterocyter, sekretoriska celler (bägare, Paneth och enteroendokrina), stamceller, liksom alla härstamningsspecifika differentieringsintermediärer (t.ex. tidiga eller omogna celltyper). Den största fördelen med att använda mag-tarmkanalen-härledda organoider för att studera infektionssjukdomar är möjligheten att exakt identifiera vilken celltyp som är inriktad på den enteriska patogenen och att ta itu med om de olika delarna av mag-tarmkanalen och deras specifika celltyper på samma sätt svarar på patogena utmaningar. Under de senaste åren har gastrointestinala modeller, liksom organoider från andra vävnader, använts för att studera viral tropism och mekanismerna för patogenes. Att utnyttja alla fördelar med att använda organoider vid användning av högpatogena virus utgör dock en teknisk utmaning och kräver strikta biosäkerhetsöverväganden. Dessutom, eftersom organoider ofta odlas i tre dimensioner, är cellernas basolaterala sida vänd mot utsidan av organoiden medan deras apikala sida är vänd mot insidan (lumen) av organoiderna. Denna organisation utgör en utmaning för enteriska patogener som många enteric infektioner initiera från den apikala/luminal sidan av cellerna efter intag. Följande manuskript kommer att ge ett omfattande protokoll för att förbereda mänskliga intestinala organoider för infektion med enteriska patogener genom att överväga infektionssidan (apical vs. basolateral) för att utföra encells RNA-sekvensering för att karakterisera celltypspecifika värd-/patogeninteraktioner. Denna metod beskriver beredningen av organoiderna samt de överväganden som behövs för att utföra detta arbete under biosäkerhet nivå 3 (BSL-3) inneslutning villkor.
Introduction
Att studera celltypspecifik tropism och celltypspecifikt immunsvar mot mänskliga enteriska virus har varit historiskt utmanande på grund av bristen på primära mänskliga cellulära modeller. Denna begränsning har nu delvis utrotats med utvecklingen av organoider1. När det gäller mag-tarmkanalen har mag- och tarmorganoidmodeller utvecklats för människor och flera andra arter (t.ex. murin, nötkreatur, kattdjur, fladdermus)2, 3,4,5,6. Intestinala organoider reproducerar den strukturella arkitekturen i den mänskliga intestinala epitel och innehåller krypta och villi-liknande strukturer, funktionella intestinala härstamningar och har även använts för att identifiera tidigare okända cell härstamningar. Två olika tillvägagångssätt kan användas för att odla intestinala organoider. För det första isoleras tarmstamceller som innehåller krypter från vävnadsresektioner eller tarmbiopsier och odlas under specifika odlingsförhållanden (t.ex. Wnt3A, R-spondin, Noggin och EGF) för att expandera och sedan differentiera stamcellerna till de flesta tarmcellsstammar (t.ex. enterocyter, Paneth-celler, Goblet-celler, enteroendokrina celler)7. Denna metod möjliggör isolering av organoider från alla delar av mag-tarmkanalen (t.ex.magsäck,tolvfingertarms, jejunum, ileum och tjocktarm). Den andra metoden bygger på humaninducerade pluripotenta eller embryonala stamceller, som sedan differentieras i en stegvis process i intestinala epitelceller8. Dessa inducerade stamcellsbaserade organoider beskrivs ofta som mer embryonala till sin natur jämfört med patient-härledda organoider. Medan alla dessa organoida modeller har varit avgörande för att riva upp utvecklingssignaler som behövs för att bilda tarmkanalen, är deras användning i infektionssjukdomsforskning fortfarande i sin linda.
Enteriskt virus är en bred term som täcker alla virus, som infekterar genom mag-tarmkanalen, såsom picornavirus (t.ex. , EV-71), reovirus (t.ex. rotavirus) och calicivirus (t.ex. norovirus)9. Enteriska virus initierar sin infektiösa livscykel genom intag av förorenad mat och vatten, vilket lämnar människor i utvecklingsländer i hög risk på grund av utsläpp av obehandlat avfall i miljön och brist på medicinsk vård efter infektionens början10. Beroende på typen av patogen kan infektionen leda till gastroenterit, kräkningar och/ eller vattnig diarré på grund av läckage av tarmfodret. Mänskliga norovirus är en mycket utbredd och mycket smittsam enterisk patogen, som leder till över 600 miljoner infektioner och 15 miljoner sjukhusvistelser över hela världen11. Organoider har varit nyckeln till norovirusforskning eftersom de stöder infektion och replikering av humant norovirus, som tidigare inte kunde odlas i standardcellkulturmodeller12.
Under de senaste två decennierna har coronavirus dykt upp som viktiga mänskliga patogener13. Denna familj inkluderar den högpatogena MERS, SARS-CoV-1 och SARS-CoV-2, som kräver strikta säkerhetsnivå inneslutningar när man utför forskning om dessa virus. Intressant, medan alla tre av dessa patogener är mestadels erkända för sina inducerade andningssymtom och ångest, är det nu uppenbart att dessa virus inte bara infekterar andningsorganen utan också andra organ. En viktig patologi inducerad hos SARS-CoV-2 infekterade patienter förutom andningsbesvär är närvaron av gastrointestinala symtom14. En bråkdel av SARS-CoV-2 infekterade patienter visar sådana symtom, allt från mycket mild till svår diarré. Dessutom kan SARS-CoV-2 genom detekteras i avföring och mag-tarmkanalen tarmbiopsier hos infekterade patienter15. Viktigt är att förekomsten av gastrointestinala symtom inte är begränsad till SARS- CoV-2 eftersom de också observerades hos MERS- och SARS- CoV- 1 infekterade patienter. För att förstå hur SARS-CoV-2 inducerar gastrointestinal nöd och exakt identifiera tropismen hos SARS-CoV-2 i mag-tarmkanalen, har mänskliga intestinala organoider varit ett viktigt verktyg och utnyttjas nu för att nysta upp celltypspecifika svar på denna patogen16,17.
Transkriptionell profilering av en cellpopulation (bulk RNA-sekvensering) har varit standardpraxis vid utvärdering av patogeninfektioner av både odödliga cellinjer samt med organoider. Även om detta gör det möjligt för oss att bestämma globala förändringar som svar på patogener (t.ex. uppreglering av cytokiner), tillåter bulk RNAseq oss inte att avgöra varför specifika celler i en population är mer benägna att infektion än andra. Encellig RNA-sekvensering (scRNAseq) har blivit ett kraftfullt verktyg för att nysta upp celllinjespecifika transkriptionsprogram och kan användas för att bestämma hur dessa program stöder eller undertrycker virusinfektion18,19. Den första beskrivningen av scRNAseq var 2009 och användes för att utvärdera transkriptionsprofilerna för de olika cellerna som finns i en mus blastomere20. Dessa tekniker har nu utökats och kan implementeras via flera olika plattformar. Tidiga versioner av denna teknik tillämpade fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS) för att separera enskilda celler för sekvensering, som ofta begränsades till 96- eller 384-brunnsplattor, vilket gav 300 enskilda celler att analysera per prov21. Dessa metoder har nu utvecklats av encellssekvenseringsplattformarna, som använder en mikrofluidisk enhet för att kapsla in enskilda celler i enskilda droppar med streckkod som innehåller pärlor. Denna teknik gör det möjligt att fånga upp till 10 000 celler per provtillstånd.
Genom att kombinera organoidteknik med scRNAseq kan vi studera hur enteriska patogener påverkar mag-tarmkanalen på ett celltypspecifikt sätt. Flera tekniska och biosäkerhetsmässiga överväganden måste dock beaktas. Först och främst exponerar klassiska organoider kulturmetoder (3-dimensionella (3D) organoider, inbäddade i en extracellulär matris (ECM)) den grundläggande sidan av epitelcellerna till utsidan av organoiden. Som enteriska patogener initierar sin infektion genom intag av förorenad mat / vatten, infektionen initierar oftast från den apikala sidan av cellerna, som inte är tillgänglig i dessa 3D intestinala organoider. Därför måste organoider vara beredda att göra den apikala sidan tillgänglig för patogeninfektion antingen genom 2D-sådd, vilket direkt exponerar cellernas apikala sida eller genom mikroinjektion22,23. För det andra, för att utföra scRNAseq av infekterade biologiska prover, är det viktigt att överväga deras smittsamma natur. Medan metoder för att fixa celler och inaktivera patogener före encellsisolering för efterföljande RNAseq har föreslagits, leder dessa metoder ofta till en minskning av sekvenseringskvaliteten18. Protokollet nedan kommer att beskriva flera metoder för att infektera intestinala organoider med enteriska virus med tanke på infektionssidan (apikal kontra basolateral infektion) (figur 1). Dessutom kommer protokollet att innehålla ett arbetsflöde för att dissociera och isolera enstaka celler från organoider infekterade med högpatogena virus för scRNAseq. Protokollet kommer att belysa de viktigaste stegen som måste genomföras vid arbete under biosäkerhetsnivå-3 (BSL-3) inneslutningsvillkor för att undvika generering av aerosoler och potentiell förorening.
Protocol
Mänsklig vävnad mottogs från kolon samband eller ileum tarmbiopsier från Universitetssjukhuset Heidelberg för följande protokoll. Denna studie genomfördes enligt universitetssjukhus heidelbergs rekommendationer med informerat skriftligt samtycke från alla försökspersoner i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Alla prover togs emot och underhålls på ett anonymiserat sätt. Protokollet godkändes av Universitetssjukhus heidelbergs etikkommission enligt protokoll S-443/2017.
1. Underhåll och passaging av tarm- och kolonorganoider
VARNING: Humana intestinala organoider härrör från mänsklig vävnad eller från inducerade pluripotenta/embryonala stamceller, och som sådan krävs etiskt godkännande. Landsspecifika bestämmelser måste följas. Mänskligt material testas i allmänhet inte och betraktas därför ofta som BSL-2-material. Lämpliga inneslutningsvillkor måste bekräftas i det land där försöket äger rum.
- Förbered tarm- och kolonorganoider från isolerade vävnader och/eller tarmbiopsier med tidigare beskrivna metoder2. Dessutom finns mer tekniska detaljer om hur man förbereder organoider från patientbaserat material eller från iPSCs i Lees et al. och Mahe et al.24,25.
- När organoid kulturer är etablerade, följ nedan beskrivna dela rutin för att förbereda organoider att utföra infektioner med enteriska patogener.
- Frö 20-100 organoider i 50 μL 100% ECM-lösning i 24-väl icke-vävnadskulturbehandlade plattor. Tillsätt 500 μL tillväxtmedium(tabell 1) per brunn.
- Byt media varannan dag genom att ta bort 250 μL av det gamla mediet och lägga till 250 μL av det färska tillväxtmediet till varje brunn. Värm mediet till rumstemperatur innan du byter media.
VARNING: Kalla medier kondenserar ECM-lösningen som innehåller organoider. - Passage organoiderna en gång i veckan när inredningen börjar bli mörk på grund av ackumulering av döda celler. Ett exempel på detta finns i figur 2.
- På delningsdagen tar du bort ECM-lösningen från -20 °C och tinar på is.
- Placera den nya tomma cellodlingsplattan som ska användas för att så organoiderna efter att ha delats vid 37 °C (detta kräver minst 1 h för att vara varm och kan värmas över natten). Värm kulturmedierna till rumstemperatur.
- Ta bort tillväxtmediet med en P1000-pipett och tillsätt 500 μL kall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till varje brunn i 3 minuter för att delvis kondensera ECM-lösningen och separera från plattan.
- Använd en P1000-pipett (450 μL) för att säkerställa fullständig störning av ECM-lösningen. Pipettera upp och ner 10 gånger för att återanvända PBS, ECM-lösningen och organoiderna, överför de återanvända organoiderna till ett 15 ml koniskt rör och placera dem på is.
- Samla flera brunnar av samma organoider i samma koniska rör.
- Om flera olika organoider (olika donatorer, olika sektioner, olika förbehandling etc.) delas samtidigt, samla dem i olika koniska rör. Underhåll de koniska rören på is under insamlingen.
- Snurra proverna vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Ta försiktigt bort PBS med en pipett för att bibehålla den organoida pelleten längst ner.
- Undvik att använda ett vakuumavfallssystem med en monterad pipett eftersom pelleten av organoider är mycket lös och lätt kan aspireras när du tar bort PBS för snabbt.
- Tillsätt 1 ml 0,05% trypsin till koniska röret och återanvänd organoider genom pipettering upp och ner 10 gånger med en P1000 pipetter. Inkubera koniskt rör som innehåller organoider vid 37 °C i 3 min.
- Tillsätt 2 ml DMEM/F12-media som innehåller 10% fetalt bovinserum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin för att stoppa matsmältningen och återanvända för att störa organoiderna genom pipettering upp och ner 10 gånger med en P1000-pipett.
- Snurra proverna vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Ta bort koniska rör från centrifugen och förvara dem på is.
- Ta försiktigt bort media/trypsin med en engångspipeett på 5 ml för att hålla den organoida pelleten i botten. Lämna cirka 500 μL media och ta bort detta med en P1000 pipett.
- När media/trypsin har tagits bort från alla koniska rör, ta bort den 24-väle well non-cell kulturbehandlade plattan från 37 °C inkubatorn och placera den under cellodlingshuven.
- Tillsätt 100% ECM-lösning (hålls på is) till det koniska röret med de delade organoiderna vid förhållandet 1:3 till 1:5 beroende på tillväxtvanorna hos de enskilda donatororganoiderna. (Om till exempel en brunn som innehåller 20-100 organoider i en 50 μL droppe ECM-lösning har passagets, återanvänd den organoida pelleten i 150-250 μL iskall ECM-lösning.)
- Frö 50 μL ECM-lösning/organoidblandning per brunn av den 24-well non-cell kulturbehandlade plattan förvärmd till 37 °C.
OBS: ECM-lösningen polymeriseras mycket snabbt när den har värmts upp. Håll ECM-lösningen kall hela tiden (förvaras på is) under användning. När organoider har återutnyttjats, frö omedelbart på en ny tallrik. För nybörjare rekommenderas att lagra en låda med pipettspetsar vid -20 °C för att ge extra tid för sådd. - Inkubera 24-brunnsplattan vid 37 °C i 10-15 minuter så att ECM-lösningen kan polymeriseras.
- Efter polymerisation tillsätt 500 μL tillväxtmedium (tabell 1)26 till varje brunn och inkubera organoiderna vid 37 °C. Kontrollera organoiderna dagligen med mikroskopi. Byt media varannan dag enligt steg 1.4.
2. Beredning av organoider i två dimensioner (2D) för apikal infektion
OBS: Följande protokoll kommer att beskriva hur man sår intestinala organoider som ett monoskikt av celler i en cellodlingsplatta för att infektera intestinala epitelceller från deras apikala sida. Använd 48-brunnsplattan för sekvenseringsexperimenten och 8-brunnsglasbottenkammaren för att kontrollera infektion med immunofluorescensmetoder.
- Odla och underhålla organoider enligt beskrivningen i avsnitt 1.
- Innan du sår organoider i 2D, belägga 48-brunnsplattorna och 8-brunns glasbottenkammaren med 200 μL 2,5% mänskligt kollagen i vatten per brunn i 1 h vid 37 °C.
OBS: Intestinala organoider är bäst sådda i 48-brunnsplattor och i 8-väl glasbottenkammarerutschbana. Erfarenheten har visat att de inte infekterar bra i 96-brunnsplattor. Transwell insatser kan också användas för att möjliggöra både apikal och basolateral infektion i 2D. Om transwells används, övervaka transepitelets elektriska resistens (TEER) före infektion för att bekräfta ett sammanflödesmonolayer. Normalt har intestinala organoider en tät barriär med en TEER på 450-600 Ohm/cm2. - Frö 100-150 organoider i varje brunn på en 48-brunnsplatta eller för en brunn i en 8-väl glasbottenkammarerutschbana.
- För att uppskatta antalet organoider, räkna antalet organoider som finns i 50 μL ECM-lösningsdroppe av 24-brunnsplattan som bereds i avsnitt 1. I genomsnitt behövs 1-2 brunnar, vilket ger cirka 15 000-30 000 celler.
- För att störa ECM-lösningen och trypsinisera organoiderna, följ steg 1.8-1.17.
- Ta bort mänskligt kollagen från 48-brunnsplattorna och 8-brunns glasbottenkammaren.
- Resuspend organoid pelleten i koniska röret i 250 μL tillväxtmedier/brunn och tillsätt blandningen till de kollagenbelagda brunnarna. Placera plattan i en inkubator på 37 °C.
OBS: Vid utförandet av experimenten jämförs flera villkor (mock vs. infekterad +/- behandling av intresse). För att minimera variabiliteten mellan varje brunn av 2D-sådd organoider, samla det totala antalet nödvändiga organoider i samma koniska rör. Samla organoider från upp till 12 brunnar av en 24-brunnsplatta kan använda 1 ml trypsin och 2 ml neutraliserande media. När du använder 12-24 brunnar, öka detta till 2 ml trypsin och 4 ml neutraliserande media. - Efter 48 h, ta bort plattan från inkubatorn och placera den i cellodlingshuven. Ta bort tillväxtmediet och ersätt det med 250 μL per brunn differentieringsmedium(tabell 1). Upprepa den här medieändringen 48 h senare.
- Efter 48 h, bekräfta differentiering (fyra dagar efter övergången till differentieringsmedia) genom att extrahera RNA, göra cDNA med 250 ng RNA och utföra SYBR grönbaserad qPCR med primers för stamceller (OLFM4 och/ eller SMOC2), bägareceller (MUC2), enteroendokrina celler (CHGA) och enterocyter (SI och/eller CYP3A4) (figur 3).
OBS: Vid byte från tillväxtmedier till differentieringsmedier kommer organoider att minska sitt uttryck för stamcellsmarkörer (OLFM4 och/eller SMOC2) och öka uttrycket av bägareceller (MUC2), enteroendokrina celler (CHGA) och enterocyter (SI och/eller CYP3A4) markörer med qPCR. Förbered en extra brunn och underhåll med tillväxtmedier för att jämföra uttrycksnivån för varje celltypspecifik markör i tillväxt kontra differentieringsmedia. - Vid bekräftelse av differentiering är organoider redo för apikal infektion. Flytta organoiderna till den biosäkerhetsnivå inneslutning som krävs för patogenen.
VARNING: Se institutets lokala föreskrifter och standardrutiner vid hantering av patogener under BSL-2 eller BSL-3 inneslutning. - För att infektera tarmorganoiderna som odlas i 2D från deras apikala sida, ta bort media med en P1000 pipetter och tillsätt patogen utspädd vid den mångfald av infektion som krävs för experimentet i differentieringsmedia (minsta volym patogen/ medieblandning är 50 μL per brunn och maximal volym är 250 μL per brunn).
- Låt infektionen fortsätta i 2 timmar vid 37 °C med antingen ett vippbord i cellodlingsinkubatorn eller genom att manuellt gunga plattan var 15-20 min. Optimera den här tiden baserat på patogenen.
- Efter 2 timmar, ta bort mediet med en P1000-pipett och ersätt den med 250 μL per brunn av nya differentieringsmedier. Inkubera celler vid 37 °C fram till tidpunkten för encellssekvensering.
- Om du vill förbereda celler för encellig sekvensering fortsätter du till avsnitt 4.
3. Beredning av organoider i tre dimensioner (3D) för apikal och basolateral infektion
- Odla organoider som beskrivs i avsnitt 1 i en 24 väl, icke-cell kulturbehandlad tallrik.
- Två dagar efter passaging, ta bort plattan från inkubatorn och placera i en cellkulturhuv.
- Ta bort tillväxtmediet med en P1000-pipett, byt ut den mot 500 μL/brunn differentieringsmedier som är förvärmda till rumstemperatur och placera plattan i inkubatorn 37 °C.
- Efter 48 timmar, ersätt med nya differentieringsmedier (500 μL/brunn).
OBS: Organoider upprätthålls i differentieringsmedia i totalt 4 dagar före infektion. - Bekräfta differentiering enligt beskrivningen i steg 2.9.
- Vid bekräftelse att differentiering har inträffat är organoider redo för infektion.
- Tina ECM på is. Värm differentieringsmediet till rumstemperatur och värm en 24-brunnsplatta vid 37 °C.
- För att utföra infektioner, ta bort organoiderna från ECM-lösningen.
OBS: Ta bort så mycket ECM-lösning som möjligt eftersom virus föredrar att hålla sig till ECM-lösningen snarare än celler. Om det finns för mycket ECM-lösning kvar runt organoiderna, kommer smittsamheten att påverkas allvarligt. - Stör ECM genom att tillsätta 500 μL kallt 1x PBS och inkubera i 3 min. Använd en P1000 för att pipett upp och ner 10x. Kombinera organoider i ett rör och centrifugera vid 500 x g i 5 min. Ta bort PBS med en P1000.
OBS: För att minimera variationen mellan varje infektionstillstånd, kombinera organoiderna som kommer från flera brunnar i en 24-brunnsplatta till samma koniska rör. Till exempel, om åtta villkor för infektion krävs, kommer åtta brunnar av en 24-brunnsplatta (som innehåller ~ 100 organoider vardera) att kombineras och därefter delas in i åtta brunnar av en ny 24-brunnsplatta efter nålavbrott (se steg 3.12). - Resuspend organoids i 1 mL differentiering media. För apikala och basolateral infektion följ steg 3.10.1 och för basolateral infektion följ endast steg 3.10.2.
- Fäst en 27 G nål på en 1 ml spruta och återanvänd pelleten sex gånger för att möjliggöra störningar av organoider och för infektion att uppstå på både de apikala och basolaterala sidorna. Fortsätt till steg 3.11.
OBS: Organoiderna bör vara de klassiska cyst-utseende och bläckfisk-spirande organoider med ett mörkt centrum när de observeras före nål störningar. Efter störningen kommer dessa organoider att visas mindre med mindre eller inget mörkt inre. När du utför infektion kommer det alltid att finnas minst två tillstånd (mock och infektion), minst två brunnar på en 24-brunnsplatta kommer initialt att kombineras till ett 15 ml koniskt rör för nålbaserad störning (vilket förklarar varför minst 1 ml används för resuspension). När du utför mer än två villkor, kombinera upp till 10 brunnar av en 24-brunnsplatta i ett enda 15 ml koniskt rör och återanvänd i 1 ml differentieringsmedia för nålavbrott. Efter avbrottet, lägg till 500 μL differentieringsmedier per n + 1 (till exempel om du använder 10 brunnar, fyll sedan på med 4,5 ml för att ha 5,5 ml totalt). Om mer än 10 villkor behövs, använd flera koniska rör. En 1 ml spruta rekommenderas eftersom organoider störs bättre med denna volym av sprutan. Ett alternativ till en spruta är att använda en välplattad P1000-spets. - Återsuspend organoiderna i 500 μL differentieringsmedier per brunn. Var försiktig så att du inte stör organoiderna och se till att den apikala sidan inte är tillgänglig. Fortsätt till steg 3.11.
- Fäst en 27 G nål på en 1 ml spruta och återanvänd pelleten sex gånger för att möjliggöra störningar av organoider och för infektion att uppstå på både de apikala och basolaterala sidorna. Fortsätt till steg 3.11.
- Överför 500 μL organoida suspensioner per brunn till en 24-väl cellodlingsplatta med en P1000-pipett och flytta plattan till den biosäkerhetsnivå inneslutning som krävs för den patogen som valts.
VARNING: Se de lokala reglerna och institutets standardrutiner vid hantering av patogener under BSL-2 eller BSL-3 inneslutning. Utför alltid nålstörningen hos organoiderna utanför BSL-3 för att undvika potentiella olyckor med nålen. Lokala bestämmelser kan också förhindra användning av nålar i BSL-3. - Tillsätt patogenen utspädd i differentieringsmedia för att nå den mångfald av infektion som krävs för experimentet. Överskrid inte en total volym på 500 μL (för att ha 1 ml totalt i 24-brunnsplattan).
- Låt infektionen fortsätta i 2 timmar (den här gången måste anpassas till patogenen) vid 37 °C med antingen ett vippbord i cellodlingsinkubatorn eller genom att manuellt gunga plattan var 15-20 min.
- Efter inkubationen på 2 timmar samlar du upp organoiderna i ett 1,5 ml rör per tillstånd och snurrar vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort mediet som innehåller patogen med en P1000-pipett och förvara den på is. Tvätta organoidernas pellet en gång med PBS.
- Återanvänd organoiderna i 50 μL 100% ECM-lösning (som tidigare tinades på is), plätera i en 24-väl icke-cellskulturbehandlad platta förvärmd till 37 °C och inkubera 24-brunnsplattan vid 37 °C i 10-15 minuter för att ecm-lösningen ska kunna polymeriseras.
- Efter polymerisationen tillsätt 500 μL differentieringsmedier vid rumstemperatur till varje brunn och inkubera vid 37 °C tills skörden för encellssekvensering.
OBS: Om skörden behöver ske mer än 48 h efter sådd, byt media varannan dag genom att ta bort det gamla mediet och ersätta det med 500 μL nytt differentieringsmedium. Erfarenheten har dock visat att eftersom organoider odlas under differentieringsmedier kommer de inte att överleva mycket längre än 48 timmar.
4. Beredning av encellslösning och beredning av gelpärlor i emulsion (GEMs) i biosäkerhetsnivå 3 (BSL-3)
OBS: För att slutföra följande steg krävs att encellssekvenseringsutrustningen(Table of Materials) och en PCR-maskin som kan hantera 100 μL-reaktioner finns i en BSL-3-anläggning. Organoider odlas enligt beskrivningen i avsnitt 1 och infekteras enligt beskrivningen i avsnitten 2-3 beroende på patogen och ingångsväg. Vid en förutbestämd tid efter infektion skördas organoider. Under den metod som används för att skörda intestinala organoider beskrivs.
- Innan du skördar infekterade organoider, ta bort single cell gelpärlor(Materialtabell) från -80 °C och värm till rumstemperatur (minst 30 minuter tidigare).
- Dessutom balansera RT-reagenset, reduktionsmedel B och RT-enzym C (alla lagrade vid -20 °C) till rumstemperatur. Återanvänd mallomkopplaren oligo enligt beskrivningen i tillverkarens instruktioner.
OBS: Alla följande steg måste utföras med avseende på de lokala biosäkerhetsbestämmelserna enligt det fastställda standardrutineret för den ansedda patogenen. Som en tumregel för BSL-3-arbete måste det säkerställas att utsidan av alla kärl (plattor, rör etc.) som lämnar en cellkulturhuv desinficeras ordentligt. Detsamma gäller för händer/ handskar hos den person som utför experimenten. - För att utföra infektioner på organoider sådda i 2D (avsnitt 2) fortsätt till steg 4.4. För att utföra infektioner på 3D-organoider (avsnitt 3) fortsätt till avsnitt 4.5.
- För infektioner av 2D-organoider, ta cellodlingsplattan i huven och ta bort differentieringsmediet med en P1000-pipett.
- Tillsätt 250 μL 1x PBS vid rumstemperatur till varje brunn.
- Ta bort PBS med en P1000-pipett och tillsätt 250 μL rumstemperingsdiamenzym (t.ex. TrypLE Express) till varje brunn på en 48-välplatta. Byt handskar, rengör plattan och placera plattan med dissociationsenzymet i inkubatorn 37 °C.
- Observera cell dissociation genom mikroskopi var 5: e minut.
OBS: Ungefär tar det 15 minuter att dissociera intestinala organoider odlade i 2D i enstaka celler. Denna tid måste justeras eftersom det beror på hur många organoider som ursprungligen såddes och smittades samt på patogenen eftersom vissa patogener är mer cytopatiska och orsakar organoider att dissociera mycket snabbare än andra. - Efter bekräftelse av en uppenbar encellig suspension, ta tillbaka plattan i cellodlingshuven och stoppa matsmältningen genom att lägga till 250 μL DMEM/ F12-media som innehåller 10% FBS per brunn på en 48-brunnsplatta.
- Samla cellerna i ett koniskt rör på 15 mL med en P1000-pipett.
- Byt handskar, rengör röret och snurra proverna vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort medie-/dissociationsenzymet med en P1000 för att bibehålla cellpelleten längst ner. Återanvänd enstaka celler i en minimal volym PBS som innehåller 0,1% BSA. För intestinala organoider, återanvänd i 250 μL för varje brunn på 48-brunnsplattan.
- Skicka cellfjädringarna till ett FACS-rör med ett filter för att ta bort stora klumpar och placera FACS-röret som innehåller celler på is.
- Fortsätt till steg 4.6 för att fortsätta med cellräkning och beredning av huvudblandningen.
- För infektioner av 3D-organoider, ta bort plattan från inkubatorn och placera den i cellodlingshuven.
- Ta bort differentieringsmediet från varje brunn på 24-brunnsplattan med en P1000-pipett. Tillsätt 500 μL iskall 1x PBS till varje brunn och inkubera i 3 min på is.
- Använd en P1000-pipett (inställd på 450 μL) för att säkerställa fullständig störning av ECM-lösningen. Pipett upp och ner 10 gånger för att återanvända PBS, ECM-lösningen och organoiderna; överföra de återsuspenderade organoiderna till ett koniskt rör på 15 ml och placera på is. Samla varje infektionstillstånd i sitt eget 15 ml koniska rör.
OBS: Att använda ett koniskt rör på 15 mL ger en bättre, tydligare cellpellet än ett koniskt rör på 50 ml eller ett 1,5 ml-rör. - Byt handskar och ta bort röret från cellodlingshuven. Rengör utsidan av röret.
- Snurra proverna vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
- Flytta tillbaka röret till cellodlingshuven och ta bort PBS med en P1000-pipett för att undvika att organoidernas pellet från botten av röret återanvänds.
- Återanvänd pelleten i 1 ml dissociationsenzym (t.ex. TrypLE Express). Byt handskar, rengör röret och inkubera proverna vid 37 °C.
- Var 10: e minut i 30 minuter, flytta röret tillbaka i cellodlingshuven och återanvänd organoiderna genom att pipettera upp och ner med en P1000-pipett 10 gånger.
OBS: Normalt kräver intestinala organoider cirka 30 min för att bilda en enda cell suspension när de infekteras i 3D. - För att bestämma när organoider är dissocierade till enstaka celler, ta 10 μL av den organoida suspensionen med en p10 pipetter.
- Placera suspensionen i en engångs cellbänk i plast. Försegla provinmatningsporten med klar tejp.
- Byt handskar och rengör utsidan av celldisken. Använd ett brightfieldmikroskop för att avgöra om en enda cellfjädring görs.
- Efter bekräftelse av en enda cellfjädring, stoppa matsmältningen genom att lägga till 1 ml DMEM / F12-media som innehåller 10% FBS och pipetter upp och ner 10 gånger med en P1000-pipett.
- Byt handskar, rengör röret och snurra proverna vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort medie-/dissociationsenzymet med en P1000-pipett för att undvika att cellpelleten återanvänds från botten av röret.
- Återanvänd de enskilda cellerna i en minimal volym PBS som innehåller 0,1% BSA. För intestinala organoider resuspend i 250 μL.
- Skicka cellfjädringarna till ett FACS-rör med ett filter för att ta bort stora klumpar och placera FACS-röret som innehåller celler på is.
- Fortsätt till steg 4.6 för att fortsätta med cellräkning och beredning av huvudblandningen.
- Bestäm antalet celler per μL genom att tillsätta 10 μL av cellupphängningen i en engångskammare för plastceller.
- Försegla provinmatningsporten med klar tejp innan provet tas bort från cellodlingshuven, eftersom cellfjädringen fortfarande är smittsam i detta skede.
- Byt handskar, rengör cellräkningskammaren och räkna cellnumret med hjälp av ett brightfield-mikroskop.
- Inuti cellodlingshuven, förbered en huvudblandning av RT Reagens, Template Switch Oligo, Reducing Agent B och RT enzym C i ett 1,5 ml rör enligt tillverkarens instruktioner beroende på antalet prover i experimentet. För varje prov ska alikvoten 33,4 μL masterblandningen blandas i ett PCR-rör och förvaras på is.
- Tillsätt cellerna och vattnet i huvudblandningen enligt målcellnumret enligt beskrivningen i tillverkarens instruktioner.
OBS: 50%-60% av cellerna återvinns normalt (dvs. vid lastning av 10 000 celler på chipet används 5 000-6 000 celler för analys). Ladda därför alltid 10 000 celler. Om celltätheten inte tillåter detta, centrifugera cellerna och återanvända i en lägre volym. Var försiktig så att du inte överbelastar chipet eftersom detta resulterar i igensättning av chipet. Dessutom, om celler inte är korrekt åtskilda, kommer det att finnas en ökad risk att få flera celler per pärla, som måste avlägsnas i efterföljande bioinformatik bearbetning. - Byt handskar, flytta encellskontrollen till cellodlingshuven och förbered chipet eftersom chipet endast är täckt med en packning som inte är förseglad.
OBS: Maskinen måste vara inuti huven för att förhindra exponering för infekterade cellupphängningar och potentiella aerosoler. - Tillsätt encellschipet till spånhållaren och fyll de oanvända körfälten med 50% glycerol.
- Tillsätt huvudblandningen, pärlor och skiljeolja i de körfält som används för prover enligt tillverkarens instruktioner.
- Täck chipet med packningen, ladda chipet i styrenheten och starta programmet.
OBS: Det rekommenderas att endast lasta sex av de åtta körfälten. Problem med felaktiga emulsioner uppstår ofta i körfält ett och åtta. Företaget säger att alla körfält är oberoende, och detta bör inte ske; Undvik dock om möjligt dessa två körfält och kör två marker om åtta prover behövs. - När programmet är klart, ta bort chipet och packningen.
- Använd en flerkanalspipetter och överför 100 μL av emulsionerna till ett rent PCR-rör. Se till att varje brunn har en enhetlig vit färg som indikerar att en fullständig emulsion har inträffat.
- Byt handskar, rengör rören och överför PCR-röret till en PCR-maskin som kan stödja 100 μL-reaktioner. Kör programmet: 53 °C i 45 min; 85 °C i 5 min.
- Förvara proverna vid 4 °C. Bearbeta reaktionen enligt tillverkarens instruktioner eller förvara vid 4 °C i 3 dagar eller -20 °C i 1 vecka.
- Efter 5 min vid 85 °C kommer de flesta höljen att inaktiveras, ta bort cDNA från BSL-3 enligt det normala driftsförfarandet och utföra bibliotekspreparaten i ett BSL-1-laboratorium.
OBS: Detta experiment måste utföras som tre biologiska replikat (t.ex. på tre olika dagar) eftersom omfattningen av differentieringen av varje celltyp kan variera något mellan varje experiment. De resulterande sekvenseringsbiblioteken kan indexeras och sekvenseras olika i en sekvenseringskörning.
Representative Results
Beredning av organoider för encellssekvensering
Encelliga sekvenseringsresultat är i hög grad beroende av att använda celler av god kvalitet. För att säkerställa att organoider är av god kvalitet bör de underhållas och observeras dagligen för att avgöra när de är redo att delas (figur 2). Tidpunkten för uppdelning av organoider är donatorberoende; Vissa givare växer snabbare och måste delas upp var femte dag, medan andra är långsammare och måste delas upp var tionde dag. I genomsnitt delas organoider en gång i veckan när centra blir mörka (figur 2B). Om organoider tillåts bli för stora och ackumulerar för många döda celler i mitten, kommer organoiden att dö.
Organoider upprätthålls i ett medium som innehåller stora mängder Wnt3A. Detta stöder stamcellsnisch och främjar organoiderna att fortsätta växa och föröka sig. Under dessa tillväxtförhållanden innehåller organoiderna stora mängder stamceller och transitförstärkande celler och en lägre mängd differentierade cellpopulationer såsom mogna enterocyter, bägareceller och enteroendokrina celler. Men för att efterlikna den cellulära komplexiteten som finns i den mänskliga tarmen är det viktigt att driva celldifferentiering och producera fler av dessa celler. Detta åstadkoms genom att ändra medieförhållandena och ta bort Wnt3A och minska R-Spondin och Noggin (tabell 1). Normalt kräver cellulär differentiering mot enterocyter, bägareceller och enteroendokrina celler 4 dagars differentieringsmedium (figur 3). Det är viktigt att uppnå en god differentiering. Annars kommer det att bli svårt att utvärdera patogen tropism och celltyp-specifika svar.
Bekräftelse av BSL-3 patogeninaktivering
Fullständig inaktivering måste bekräftas med den patogen som valts och valideras att det är säkert att ta bort cDNA från BSL-3. För SARS-CoV-2 validerades fullständig inaktivering av viruset genom att ta 100 μL SARS-CoV-2 och inkubera det i en PCR-maskin i 5 min vid 85 °C. Viruset tillsattes sedan tillbaka till naiva Vero-celler, och virusinfektion jämfördes med icke-värmebehandlat virus genom immunofluorescens- och plackanalyser vid 24 h, 48 timmar och 72 h efter infektion för att säkerställa att alla partiklar inte längre var smittsamma. Dessa resultat skickades till den lokala tillsynsmyndigheten, och efter deras godkännande utfördes encellsexperimentet och cDNA-bearbetningen.
Resultat för encellssekvensering
För att utvärdera hur SARS-CoV-2 infekterar mänskliga kolon och ileum organoider, encellig sekvensering utfördes. Organoider förbereddes enligt beskrivningen ovan och smittades i ett 2D-format för att möjliggöra apikal infektion av SARS-CoV-2. Infekterade celler skördades vid 12 h och 24 h efter infektion och bearbetades för encellig sekvensering enligt beskrivningen ovan. Analys av encelliga sekvenseringsdata gjorde det möjligt för oss att fastställa att endast en subpopulation (omogen enterocyt 2) av mänskliga intestinala epitelceller stödde infektionen av SARS-CoV-2 (figur 4). Dessutom, eftersom inte alla celler i en population var infekterade, analyserades både infekterade celler och icke-infekterade åskådare celler (figur 5). Dessa resultat visade att SARS-CoV-2 inducerade en proinflammatorisk signal kaskad i infekterade celler medan icke-infekterade åskådare celler visade ett interferon-medierat immunsvar. Dessutom visade scRNA-Seq att infekterade celler inte kunde känna av interferoner på grund av virusmedierad blockering av vägen (figur 5). Det var inte möjligt att få denna information när du använder bulk RNA sekvensering.
Figur 1: Schematisk som visar de tre olika metoderna för att förbereda mänskliga tarmorganoider för infektion med enteriska patogener. Apical infektion kan uppnås genom sådd intestinala organoider i 2D. En apikal och basolateral infektion kan utföras genom att störa 3D organoid. Slutligen kan en basolateral endast infektion utföras genom att infektera intakta 3D intestinala organoider. Var och en av dessa metoder kan användas för att generera prover för encellssekvensering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Organoid underhållsschematiska och representativa brightfield bilder. (A) Schematic för underhåll och passaging av mänskliga intestinala organoider. (B). Representativa brightfield-bilder från dag 1, 3, 5 och 7 efter delning. På dag 7 blir organoiderna stora och mörka på grund av ackumulering av döda celler och är redo att delas. Skalstången indikerar 25 μm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativ qPCR av humana intestinala organoider 4 dagar efter bytet till differentieringsmedier. Intestinala organoider bibehölls i tillväxtmedia eller bytte till differentiering media för 4 dagar. RNA skördades och qPCR utfördes för markörer av stamceller (OLFM4), Paneth celler (LYZ), Bägare celler (MUC2) och enterocyter (SI). N = 5. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Identifiering av den cellpopulation som smittats av SARS-CoV-2. Mänskliga kolon och ileum härledda organoider var infekterade med SARS-CoV-2. Efter 12 och 24 h post-infektion celler skördades och utsattes för encelliga RNA sekvensering för att identifiera vilka cellpopulationer stödde SARS-CoV-2 infektion. Virusinfektion konstaterades öka med tiden och främst infektera omogna enterocyt 2. Denna siffra har ändrats från Triana et al.19. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Bestämning av inneboende medfött immunsvar. Mänskliga kolon härledda organoider var infekterade med SARS-CoV-2. Efter 12 och 24 h post-infektion celler skördades och utsätts för en cell RNA sekvensering för att bestämma det inneboende medfödda immunsvaret i både viralt infekterade och icke-infekterade åskådare celler. SARS-CoV-2 infekterade celler visade ett starkt pro-inflammatoriskt svar medan icke-infekterade åskådare celler visade en interferon-medierad svar. Figur ändrad från Triana et al.19. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Tillväxtmedia | |
| Förening | Slutlig koncentration |
| Annons DMEM/F12 | GlutaMAX (1x) |
| +GlutaMAX | HEPES 1 mM |
| +HEPES | Penna 10 U/mL |
| +P/S | Strep 10 μg/mL |
| L-WRN | 50 volymprocent |
| B27 | 01:50 |
| N-acetylcystein | 1 mM |
| Fonden för justering för justering för justering för | 50 ng/mL |
| A83-01 | 500 nM |
| IGF-1 | 100 ng/mL |
| FGF grundläggande | 50 ng/mL |
| Gastrin | 10 mM |
| Differentieringsmedia | |
| Förening | Slutlig koncentration |
| Annons DMEM/F12 | GlutaMAX (1x) |
| +GlutaMAX | HEPES 1 mM |
| +HEPES | Penna 10 U/mL |
| +P/S | Strep 10 μg/mL |
| B27 | 01:50 |
| N-acetylcystein | 1 mM |
| R-spondin | 5 volymprocent |
| Skalle | 50 ng/mL |
| Fonden för justering för justering för justering för | 50 ng/mL |
| Gastrin | 10 mM |
| A83-01 | 500 nM |
Tabell 1: Mediesammansättning för tillväxt- och differentieringsmedier.
Discussion
Enteriska patogener initierar oftast sin livscykel genom att infektera intestinala epitelceller från deras apikala sida mot tarmens lumen. Medan organoider är välkända för att vara en bra modell för att reproducera den cellulära komplexiteten och organisationen av tarmepitelet, gör deras organisation som tredimensionella, slutna strukturer deras apikala membran otillgängliga för patogenen. Detta protokoll beskrivs metoder för att infektera intestinala organoider från deras apikala sida, deras basolateral sida, eller båda med BLS-3 patogener. Dessa protokoll kan enkelt anpassas för att studera någon enterisk patogen under BSL-2 eller BLS-3 inneslutning eller någon annan organoid modell genom att följa några kritiska steg som markeras nedan. Den metod som beskrivs ovan är för isolering och beredning av encellsdroppar i enlighet med bestämmelserna i Tyskland. Som en ansvarsfriskrivning beskriver detta protokoll inte de åtgärder för hantering av biosäkerhet (standardrutiner) som måste vidtas när du arbetar under BSL-3-förhållanden. Det är också viktigt att insistera på att bestämmelserna kan variera i andra länder och att de lokala myndigheterna måste kontaktas för att se till att alla lokala bestämmelser respekteras.
Ett av de kritiska stegen i sådd av organoider i två dimensioner för apikal infektion är att kontrollera att celler på samma sätt kommer att skilja sig åt jämfört med när de odlas som klassiska tredimensionella organoider. Beroende på enterisk patogen, tropism kan begränsas till mycket sällsynta celler eller till celler som behöver vara mycket differentierade. I detta fall, med hjälp av en tvådimensionell organoid som inte helt differentierade kan resultera i missuppfattningen att denna enteriska patogen inte kan infektera intestinala organoider. Det föreslås, om möjligt, att utföra infektioner med hjälp av de tre konfigurationerna av detta protokoll: 2D organoid för apikal infektion endast (avsnitt 2), spruckna öppna 3D organoider för apikal och basolateral infektion (avsnitt 3) och fullständiga 3D organoider för basolateral infektion endast (avsnitt 3). Detta tillvägagångssätt kommer att bidra till att urskilja patogenens ingångsväg (apical vs. basolateral) och kommer också att kontrollera att en liknande differentieringsnivå har uppnåtts. Ett alternativ för 2D-apikal infektion är mikroinjektion, som kommer att använda en 3D-organoid men leverera patogenen direkt till den apikala sidan (se Bartfeld m.fl.27 för detaljer). Denna metod kräver en skicklig injektor för att säkerställa att patogenen är korrekt placerad och organoiderna förblir intakta. Mikroinjektion används ofta i BSL-2 inneslutning och kanske inte är lämplig för BSL-3 inneslutning.
En ytterligare viktig faktor när man utför infektionsexperiment i 2D-seedade organoider är den slutliga celltätheten. Som nämnts i steg 2.3 kommer 100-150 organoider att sås i en brunn på en 48-brunnsplatta eller en brunn i en 8-väl glasbottenkammarerutschbana. Beroende på organoidlinjen och på den person som hanterar organoiderna kan storleken på dessa organoider vara betydligt annorlunda. Detta kan resultera i mycket olika celltätheter i 48-brunnsplattan eller 8-brunns glasbottenkammaren. Beroende på det enteriska viruset föredrar vissa virus mer glesa celler, medan andra också kommer att kunna infektera sammanflödesceller. Det molekylära ursprunget till sådana skillnader i smittsamhet för olika cellkonfluenser är inte klart; Därför bör pilotexperiment som syftar till att hitta den bästa celltätheten för den enteriska patogenen utföras innan ytterligare nedströms karakterisering utförs.
Ofta utförs FACS-sortering innan du utför encellsdropparmulsionen. Detta steg används ofta för att separera döda från levande celler och enskilda celler från dubbletter. Vid arbete med BSL-3 patogener kräver det att anläggningen är utrustad med en lämplig FACS-sorterare, vilket inte ofta är fallet. Dessutom har inte alla celler i en organoid samma storlek, och det är ofta svårt att skilja mellan en doublet eller en större cell, vilket orsakar en risk för att negativt välja mot en viss celltyp. Det finns också fortfarande diskussioner i fältet om den tid som behövs för att sortera mellan 5 000-10 000 för varje prov kan resultera i en betydande ändring av transkriptionsprofilen för de enskilda cellerna. Medan cellfixeringsmetoder som är kompatibla med encellssekvensering (t.ex. metanol och RNAassist) har beskrivits, observerades det att detta leder till en minskning av kvaliteten på sekvensering18. Slutligen misstänks det att sortering av celler med hjälp av celldödsmarkörer också kan leda till en partiskhet. Med tanke på cellernas riktningsproliferation och differentiering genom krypt-villi-axeln ligger de mest differentierade cellerna, som kommer att kastas och släppas, vid villis spets. Dessa celler är ofta positiva för olika markörer för celldödsvägar (t.ex. apoptos, nekros och nekroptos); Men när man tittar på rotavirusinfektion i mustarmen är spetsen på villi det mest infekterade området28. Således skulle filtrering av celler som kan se positiva ut för dödsmarkörer resultera i ett negativt urval av de infekterade cellerna som kan representera den fysiologiska infektionen. För närvarande finns det ingen bra lösning för sortering och fixering av organoider före encellig sekvensering. Användning av levande, osorterade celler rekommenderas eftersom ytterligare studier behövs för att hitta lämpliga alternativa protokoll.
Encellig sekvensering har revolutionerat hur cellulära svar kan utvärderas. Denna teknik möjliggör identifiering av cell härstamning-specifika svar både i basala förhållanden och under patogen infektioner. Denna metod har öppnat dörrar inom många områden som tidigare begränsades av massläsningar. Även om denna metod är mycket kraftfull, har den sina begränsningar. En viktig begränsning är den omfattande bioinformatiska analys som krävs nedströms sekvenseringen. Detta är särskilt viktigt när du analyserar vävnader och tilldelar celltyper där det för närvarande inte finns någon anteckning. Att ha en skicklig bioinformatiker krävs för att stödja alla encellsstudier.
Detta protokoll beskriver hur man frö och hanterar mänskliga intestinala organoider, infekterar dem med enteriska patogener och utför scRNAseq. Att anpassa detta tillvägagångssätt till andra organ är nu möjligt, eftersom organoida modellsystem har utvecklats för de flesta organ. Lung- och leverorganoider är på samma sätt organiserade jämfört med intestinala organoider, och som sådan, med hjälp av ett analogt tillvägagångssätt kan överföras till dessa organoider. Den kritiska kontrollen kommer att vara att validera att när de odlas i två dimensioner eller spricker öppna, uppnår dessa organoider liknande differentiering som deras 3D-organoida motsvarigheter. De specifika egenskaper och gener som definierar en differentierad status är specifika för varje organmodell. Andra organoida modeller som njure och kärlorganoider, stora täta strukturer, kommer att behöva ytterligare metoder för att seriellt separera dessa strukturer i enstaka celler.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Megan Stanifer och Steeve Boulant stöddes av forskningsanslag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Projektnummer 240245660, 278001972, 415089553 och 272983813 till Steeve Boulant och 416072091 till Megan Stanifer), delstaten Baden-Wuerttemberg och Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B till MS och 01KI20198A och (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) till SB. Schematics skapades i BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
| 24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
| 8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
| A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
| B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
| Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
| CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
| CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
| DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
| Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
| Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
| GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
| HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
| L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
| MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
| MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
| MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
| N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
| OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
| OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
| Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
| Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
| Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
| SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
| SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
| TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
| Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |
References
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Tekes, G., Ehmann, R., Boulant, S., Stanifer, M. L. Development of feline ileum- and colon-derived organoids and their potential use to support feline coronavirus infection. Cells. 9, (2020).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375, 409-424 (2019).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26, 1077-1083 (2020).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- de Graaf, M., van Beek, J., Koopmans, M. P. Human norovirus transmission and evolution in a changing world. Nature Reviews Microbiology. 14, 421-433 (2016).
- Leshem, E., et al. Real-world effectiveness of pentavalent rotavirus vaccine among bedouin and jewish children in southern Israel. Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society Of America. 62, Suppl 2 155-160 (2016).
- Karst, S. M. The influence of commensal bacteria on infection with enteric viruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 197-204 (2016).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353, 1387-1393 (2016).
- de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D., Munster, V. J. SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 523-534 (2016).
- Scaldaferri, F., et al. The thrilling journey of SARS-CoV-2 into the intestine: From pathogenesis to future clinical implications. Inflammatory Bowel Diseases. 26, 1306-1314 (2020).
- Kipkorir, V., Cheruiyot, I., Ngure, B., Misiani, M., Munguti, J. Prolonged SARS-CoV-2 RNA detection in anal/rectal swabs and stool specimens in COVID-19 patients after negative conversion in nasopharyngeal RT-PCR test. Journal of Medical Virology. 92, 2328-2331 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369, 50-54 (2020).
- Stanifer, M. L., et al. Critical role of type III interferon in controlling SARS-CoV-2 Infection in human intestinal epithelial cells. Cell Reports. 32, 107863 (2020).
- Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. bioRxiv. , (2020).
- Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Molecular Systems Biology. 17, 10232 (2021).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 1-14 (2018).
- García-Rodríguez, I., Sridhar, A., Pajkrt, D., Wolthers, K. C. Put some guts into it: Intestinal organoid models to study viral infection. Viruses. 12, 1288 (2020).
- Stanifer, M. L., et al. Asymmetric distribution of TLR3 leads to a polarized immune response in human intestinal epithelial cells. Nature Microbiology. 5, 181-191 (2020).
- Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478 (2019).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52483 (2015).
- Fujii, M., et al. Human Intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: Culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter Pylori. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53359 (2015).
- Hernandez, P. P., et al. Interferon-lambda and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection. Nature Immunology. 16, 698-707 (2015).
