Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fra celler til cellefri proteinsyntese inden for 24 timer ved hjælp af cellefri autoinduktionsarbejdsgang

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62866
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

ERRATUM NOTICE

Summary

Dette arbejde beskriver fremstillingen af celleekstrakt fra Escherichia coli (E. coli) efterfulgt af cellefri proteinsyntese (CFPS) reaktioner på under 24 timer. Forklaring af den cellefri autoinduktion (CFAI) protokol beskriver forbedringer foretaget for at reducere forskertilsyn og øge mængderne af opnået celleekstrakt.

Abstract

Cellefri proteinsyntese (CFPS) er vokset som en bioteknologisk platform, der fanger transkriptions- og oversættelsesmaskiner in vitro. Talrige udviklinger har gjort CFPS-platformen mere tilgængelig for nye brugere og har udvidet anvendelsesområdet. For lysatbaserede CFPS-systemer kan celleekstrakter genereres fra en række organismer, der udnytter den unikke biokemi hos denne vært til at øge proteinsyntesen. Inden for de sidste 20 år er Escherichia coli (E. coli) blevet en af de mest anvendte organismer til støtte for CFPS på grund af dens overkommelige priser og alsidighed. På trods af mange vigtige fremskridt er arbejdsgangen for E. coli-celleekstraktforberedelse forblevet en vigtig flaskehals for nye brugere til at implementere CFPS til deres applikationer. Arbejdsgangen til forberedelse af ekstrakter er tidskrævende og kræver teknisk ekspertise for at opnå reproducerbare resultater. For at overvinde disse barrierer har vi tidligere rapporteret om udviklingen af en 24-timers cellefri autoinduktionsarbejdsgang (CFAI), der reducerer brugerinput og den nødvendige tekniske ekspertise. CFAI-arbejdsgangen minimerer den arbejdskraft og tekniske færdighed, der kræves for at generere celleekstrakter, samtidig med at de samlede mængder celleekstrakter, der opnås, øges. Her beskriver vi denne arbejdsgang trin for trin for at forbedre adgangen til og understøtte den brede implementering af E. coli-baserede CFPS.

Introduction

Anvendelsen af cellefri proteinsyntese (CFPS) til bioteknologiske anvendelser er vokset betydeligt i løbet af de sidste par år 1,2,3. Denne udvikling kan til dels tilskrives en øget indsats for at forstå de processer, der forekommer i DE FÆLLES FISKERI-systemer, og den rolle, som hver komponent 4,5 spiller. Derudover har reducerede omkostninger, der tilskrives optimerede opsætninger og alternative energikilder, gjort cellefri teknologi lettere at implementere for nye brugere 6,7,8,9. For at implementere de nødvendige transkriptions- og oversættelsesfaktorer til proteinsyntese bruges celleekstrakt ofte til at drive cellefrie reaktioner10. Nyligt offentliggjorte brugervejledninger har givet enkle protokoller til fremstilling af funktionelt uddrag, hvilket gør det lettere at implementere for både nye og erfarne brugere 1,11,12,13,14. Celleekstrakt opnås normalt gennem lysis af en cellekultur, som kan dyrkes ved hjælp af forskellige organismer afhængigt af den ønskede specifikke anvendelse 1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) er hurtigt blevet en af de mest almindeligt anvendte værtsorganismer til fremstilling af funktionelle ekstrakter17. BL21 Star (DE3) stammen foretrækkes, fordi den fjerner proteaserne fra den ydre membran (OmpT protease) og cytoplasmaet (Lon protease), hvilket giver et optimalt miljø for det rekombinante proteinekspression. Derudover indeholder DE3 λDE3, der bærer genet for T7 RNA-polymerase (T7 RNAP) under kontrol af lacUV5-promotoren; stjernekomponenten indeholder et muteret RNaseE-gen, som forhindrer spaltning af mRNA 4,14,18,19. Under lacUV5-promotoren tillader isopropyl-thiogalactopyranosid (IPTG) induktion ekspression af T7 RNAP20,21. Disse stammer bruges til at dyrke og høste celler, som giver råmateriale til ekstraktforberedelse. Cellelyse kan udføres ved hjælp af en række forskellige metoder, herunder perleslag, fransk presse, homogenisering, sonikering og nitrogenkavitation 1,11,12,22.

Processen med bakteriekultur og høst er konsistent på tværs af de fleste platforme, når man bruger E. coli, men kræver flere dage og intenst forskertilsyn 1,11,13. Denne proces starter generelt med en frøkultur natten over i LB bouillon, som ved nattens vækst derefter podes i en større kultur på 2xYTPG (gær, tryptone, fosfatbuffer, glucose) den næste dag. Væksten af denne større kultur overvåges, indtil den når den tidlige til midterste logfase ved en optisk densitet (OD) på 2,514,20. Konstant måling er påkrævet, da komponenterne i transkription og oversættelse tidligere har vist sig at være meget aktive i den tidlige til midterste logfase23,24. Selvom denne proces kan skabe reproducerbart ekstrakt, har vores laboratorium for nylig udviklet en ny metode ved hjælp af Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, som reducerer forskertilsyn, øger det samlede udbytte af ekstrakt for en given liter cellekultur og forbedrer adgangen til E. coli-baseret ekstraktpræparat for både erfarne og nye brugere (figur 1 ). Her giver vi den trinvise vejledning til implementering af CFAI-arbejdsgangen for at gå fra en stribet plade af celler til en afsluttet CFPS-reaktion inden for 24 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Medievækst

  1. 960 ml CFAI-medier som beskrevet i tabel 1 forberedes, og pH-værdien justeres til 7,2 ved hjælp af KOH.
  2. Overfør kulturmedier til en 2,5 L forvirret kolbe og autoklave i 30 minutter ved 121 °C.
  3. Der fremstilles en 40 ml sukkeropløsning som beskrevet i tabel 1. Filtersteriliser opløsningen i en separat autoklaveret glasbeholder.
    BEMÆRK: Sukkeropløsningen kan opbevares i en 30 °C-inkubator indtil videre brug.
  4. Lad mediet køle helt af til under 40 °C efter autoklavering.
  5. Før podning af CFAI-mediet tilsættes sukkeropløsningen direkte til CFAI-medierne.
  6. For at inokulere mediet skal du stryge en sløjfefuld kolonier fra en tidligere stribet E. coli BL21 Star (DE3) plade og indsætte direkte i medierne. Hvirvl løkken ind i mediet, men undgå at røre ved beholderens sider. Sørg for, at stribepladen er frisk med levedygtige celler.
  7. Kolben anbringes sammen med de podede medier i en 30 °C-inkubator, mens den rystes ved 200 o/min. Lad kulturen vokse natten over. Hvis celler podes om aftenen, vil kulturen nå en omtrentlig optisk densitet målt ved 600 nm (OD600) på 10 den efterfølgende morgen. Podnings- og høsttider kan justeres efter behov.

2. Cellehøst

  1. Forbered S30-bufferen på forhånd, og hold den kold. S30-bufferen i henhold til tabel 2 forberedes til en endelig pH-værdi på 8,2.
    BEMÆRK: S30-bufferen kan fremstilles dage før cellehøsten. Hvis dette er gjort, skal du forberede uden dithiothreitol og opbevare ved 4 °C. Tilsæt dithiothreitol lige før brug.
  2. Fra dette tidspunkt skal du holde alle løsninger og materialer på is. 1 liter medier overføres til en 1 L centrifugeflaske og centrifuge ved 5.000 x g mellem 4-10 °C i 10 min. Dekanter og bortskaf supernatanten. Brug en steril spatel til at overføre pillen til et forkølet og tidligere vejet 50 ml konisk rør.
  3. Vask en gang med 30-40 ml kold S30 buffer ved at genbruge pillen via hvirvel i 30 s udbrud med hvileperioder på is.
    BEMÆRK: På grund af et større volumen pellet kan opdeling af cellepillen i to 50 ml koniske rør være nyttigt til vasketrinnet. Lagring af celler i mindre alikvoter giver også fleksibilitet til downstream-behandling.
  4. Centrifugering af celleresuspensionen ved 5000 x g mellem 4-10 °C i 10 min.
  5. Bortskaf supernatanten og tør overskydende fra de indvendige vægge i det 50 ml koniske rør ved hjælp af et rent væv, undgå at røre ved selve pelleten. Vej og flashfrys pillen i flydende nitrogen. Opbevares ved -80 °C indtil videre brug.
    BEMÆRK: Pellets kræver muligvis ikke flashfrysning, hvis brugeren planlægger at fortsætte med ekstraktforberedelsesprotokollen.

3. Uddrag forberedelse

  1. Kombiner den frosne pellet med 1 ml S30-buffer for hver 1 g af cellepillen og lad den tø op på is i ca. 30-60 min. Resuspend optøet pellet via hvirvel i udbrud på 30 s med hvileperioder på is. Vortex, indtil der ikke er synlige klumper af celler tilbage.
    BEMÆRK: Mindre klumper kan resuspenderes ved blanding ved hjælp af en pipette.
  2. Overfør alikvoter på 1,4 ml celleresuspension til 1,5 ml mikrofugerør til cellelyse. Sonikere hvert rør med en frekvens på 20 kHz og 50% amplitude for tre udbrud på 45 s med 59 s hvile pr. Cyklus omgivet af et isbad. Inverter røret mellem cyklusser og tilsæt straks 4,5 μL 1 M dithiothreitol efter den sidste sonikeringscyklus.
    BEMÆRK: På grund af den varme, der frigives fra sonikering, er det ekstremt vigtigt at sikre, at alle aliquots holdes på is, når de ikke sonikeres. Isbadet skal konstant genopfyldes eller være stort nok til at forblive køligt gennem hele sonikeringsprocessen.
  3. Centrifugering af hvert rør ved 18.000 x g og 4 °C i 10 minutter. Hent supernatanten og alikvoten i 1,5 ml mikrofugerør i 600 μL aliquots. Flashfrys aliquots og opbevar ved -80 °C indtil videre brug. Pas på at pipette kun supernatanten.

4. Cellefri proteinsyntese

  1. Optø en alikvot ekstrakt fra det foregående trin for at udføre 15 μL cellefri proteinsyntesereaktioner i 1,5 ml mikrofugerør i quadruplicate.
  2. Hver reaktion forberedes ved at kombinere 240 ng DNA (16 μg/ml endelig koncentration), 2,20 μL opløsning A, 2,10 μL opløsning B, 5,0 μL ekstrakt og et varierende volumen vand af molekylær kvalitet for at fylde reaktionen til 15 μL. Denne reaktion kan skaleres til højere volumener. Se tabel 3 for nøgletal.
    1. Opløsning A og B forberedes i henhold til tabel 4. Hver opløsning kan fremstilles i partier på 100 μL til 1 ml, aliciteret og opbevares ved -80 °C indtil videre anvendelse.
      BEMÆRK: DNA-mængden kan variere afhængigt af proteinet af interesse. I dette tilfælde er det anvendte plasmid, pJL1-sfGFP, blevet optimeret til at fungere ved 16 μg / ml eller 597 μM.
  3. Lad reaktionerne køre i mindst 4 timer ved 37 °C.

5. Kvantificering af reporterprotein, supermappe grønt fluorescerende protein (sfGFP)

  1. Ved hjælp af en sort polystyrenplade med et halvt areal på 96 brønde kombineres 2 μL af hvert cellefrit proteinsyntesereaktionsprodukt med 48 μL 0,05 M HEPES-buffer ved pH 7,2. Tre til fire replikater af hvert reaktionsrør anbefales.
  2. Kvantificer fluorescensintensiteten af sfGFP med en excitationsbølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 528 nm.
  3. For omdannelse af relative fluorescensenheder til volumetrisk udbytte (μg/ml) af sfGFP fastlægges en standardkurve ved hjælp af renset pJL1-sfGFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved fremstilling af CFAI-medier blev glucose udvekslet med en stigning i lactose og glycerol som det vigtigste energisubstrat i medierne. Derudover blev CFAI-mediernes bufferkapacitet også øget. Disse specifikke komponenter er angivet i tabel 1.

Cellerne blev derefter dyrket til både en OD600 på 10 og standard 2,5 i CFAI-medier for at vise konsistens med ekstraktkvaliteten på trods af varierende ekstraktmængder. 2,5 OD600 CFAI-mediet blev dyrket efter podning fra en frøkultur i LB-bouillon ved 37 °C, 200 o/min., mens OD600 10-kulturen blev podet direkte fra en plade. Hvert parti CFAI-medier blev derefter overvåget og høstet ved deres respektive OD600. Væksten til en OD600 på 10 førte til en stigning i højere mængde cellepiller og samlet ekstrakt opnået, da det producerede 9,60 ml ekstrakt versus 2,10 ml ekstrakt opnået fra væksten til 2,5 OD600 (figur 2). Yderligere analyse af den samlede proteinkoncentration viste ingen signifikant forskel i det samlede protein i hvert ekstrakt (tabel 5). Selvom de blev dyrket til forskellige niveauer af optisk densitet, viste begge partier ekstrakt lignende resultater i cellefrie reaktioner ved anvendelse af sfGFP (figur 3). Dette tyder på, at kombinationen af den øgede bufferkapacitet, brugen af lactose og glycerol som den vigtigste kulstofkilde og implementering af lactose i stedet for IPTG til T7RNAP-induktion hjælper med at stabilisere ekstraktvæksten til enhver OD600 under 10.

Autoklaveret CFAI-medier:
Komponenter Beløb
Natriumchlorid 5,0 g
Tryptone 20,0 g
Gærekstrakt 5,0 g
Kaliumphosphat, monobasisk 6,0 g
Kaliumphosphat, dibasisk 14,0 g
NanorentTM-vand Fyld til i alt 960 ml
Filtersteriliseret sukkeropløsning:
Komponenter Beløb
D-glukose 0,50 g
D-laktose 4,0 g
80% v/v glycerol 7,5 ml
NanorentTM-vand 28,0 ml

Tabel 1: CFAI-komponenter. Komponenter til CFAI-medie- og sukkeropløsninger med deres respektive mængder. Mediet skal omrøres under tilsætningen af hver komponent, og sukkeropløsningsfilteret steriliseres. Hver opløsning skal tilsættes til en separat steril beholder inden podning.

S30 Buffer
Komponenter Koncentration
Trisacetat pH 8,2 ved stuetemperatur 10 mM
Magnesiumacetat 14 mM
Kaliumacetat 60 mM
Dithiothreitol 2 mM

Tabel 2: S30-bufferkomponenter: Komponenter til S30-buffer blev tilsat med deres respektive mængder i et sterilt 50 ml konisk rør.

Komponent Beløb
Løsning A 2,20 μL
Opløsning B 2,1 μL
Ekstrakt 5 μL
DNA-skabelon Volumen for 16 μg/ml finale
Vand Fyld til i alt 15 μL

Tabel 3: CFPS-reaktionsforhold: Relative volumenprocenter for opløsning A, opløsning B og ekstrakt. DNA-volumenet kan variere afhængigt af den specifikke plasmidkoncentration og skal muligvis optimeres til brugerens specifikke plasmid, der anvendes.

Løsning A Opløsning B
Komponenter Koncentration Komponenter Koncentration
Atp 1,2 mM Magnesiumglutamat 10 mM
GTP 0,850 mM Ammoniumglutamat 10 mM
Utp 0,850 mM Kaliumglutamat 130 mM
CTP 0,850 mM Fosfoenolpyruvat (PEP) 30 mM
Folinsyre 31,50 μg/ml L-Valine 2 mM
Trna 170,60 μg/ml L-Tryptophan 2 mM
Nicotinamid adenin dinukleotid (NAD) 0,40 mM L-isoleucin 2 mM
Coenzym A 0,27 mM L-Leucin 2 mM
Oxalsyre 4,00 mM L-cystein 2 mM
Putrescine 1,00 mM L-methionin 2 mM
Spermidin 1,50 mM L-Alanin 2 mM
HEPES Buffer pH 7,5 57,33 mM L-Arginin 2 mM
L-Asparagin 2 mM
L-asparaginsyre 2 mM
L-glutaminsyre 2 mM
L-glycin 2 mM
L-glutamin 2 mM
L-Histidin 2 mM
L-lysin 2 mM
L-Proline 2 mM
L-Serine 2 mM
L-Threonin 2 mM
L-Phenylalanin 2 mM
L-tyrosin 2 mM

Tabel 4: Opløsning A- og B-komponenter. Lagerkoncentrationerne for komponenterne i opløsning A og B blev tilsat med deres respektive mængder, hver i et 1,5 ml mikrofugerør.

Ekstrakt Samlet proteinkoncentration (μg/ml) Standardafvigelse
2xYTPG 2.5 OD 30617 3745
CFAI 2.5 OD 30895 2254
CFAI 10.0 OD 27905 3582

Tabel 5: Samlet ekstraktproteinudbytte. Analyse af det samlede protein af forskellige celleekstraktvækster. Den samlede proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af et Bradford-assay. Hver koncentration blev bestemt ud fra triplikater ved anvendelse af en 1:40 fortynding.

Figure 1
Figur 1: Sammenligning af CFAI og typisk arbejdsgang fra celler til CFPS: Sammenligning af den samlede tidslinje fra celler til CFPS ved hjælp af (A) CFAI-arbejdsgangen (venstre, rød) versus den (B) tidligere etablerede metode (grøn, højre). Sammenligningen viser det reducerede forskertilsyn og -tidslinje, når de udfører CFPS ved hjælp af CFAI-arbejdsgangen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning af CFAI-pelletsstørrelse. Sammenligning af CFAI-mediepiller efter cellehøst ved forskellige OD600. Mediet, der voksede til en OD600 på 2,5, producerede en 2,23 g cellepille (venstre), og mediet vokset til en OD600 på 10 producerede en 9,49 g cellepille (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Effekter af vækst på CFPS-reaktionsudbytter. (A) Sammenligning af CFPS-reaktionsudbytter mellem vækster til 2,5 OD600 og 10 OD600 med (B) billeder af hver CFPS-reaktion over deres respektive udbytte. Cellefrie reaktioner blev udført i et 1,5 ml mikrofugerør og kvantificeret efter 24 timers inkubation ved 37 °C ved anvendelse af en standardkurve til at korrelere fluorescens med sfGFP-koncentration. Det "negative" svarer til det sæt negative kontrolreaktioner, hvor der ikke blev tilføjet skabelon-DNA. De traditionelle 2xYTPG-medier (den positive kontrol) og CFAI-ekstrakterne er af samme kvalitet, som det fremgår af deres høje CFPS-udbytter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskertilsyn er traditionelt nødvendigt for to nøgleaktioner under cellevækst: induktion af T7 RNAP og høst af celler ved en bestemt OD600. CFAI undgår begge disse krav for at reducere forskerens tid og tekniske uddannelse, der kræves for at forberede celleekstrakter af høj kvalitet. Auto-induktion af T7 RNAP opnås ved at erstatte glucose med lactose som det primære sukker i medierne, hvilket undgår det tidligere behov for aktivt at overvåge væksten og derefter inducere med IPTG på et præcist tidspunkt under cellevækst. Behovet for aktivt at overvåge cellekulturer for at høste ved en bestemt OD600 undgås også, hvilket løsner forskeren fra cellekulturen. Dette føjer sig til det seneste arbejde, som også har vist produktion af kvalitetsekstrakter høstet på ikke-traditionelle tidspunkter 13,25,26. Den nye medieformulering forbedrer bufferkapaciteten og kulstofkilderne for at understøtte aktiv energimetabolisme, selv når cellekulturen nærmer sig den stationære fase. Evnen til at opnå robuste celleekstrakter fra høje OD600-kulturer gør det muligt for forskeren at høste kulturerne, når det passer dem27. Den arbejdsgang, vi foretrækker og anbefaler, er at inokulere kulturen om aftenen og vende tilbage til høst næste morgen.

Høstning af celler ved en højere OD600 resulterer også i en signifikant større mængde celler opnået til ekstraktforberedelse. For erfarne forskere er det værd at bemærke, at cellepillen er meget mørkere i farven sammenlignet med celler dyrket i 2xYTPG-medier, selv når de høstes ved en OD600 på 2,5. Det er også vigtigt at bemærke, at hvis hele cellepillen behandles på én gang, vil den store mængde resuspension opnået pr. Cellepille, når der udføres lysis via sonikering, tage nogen tid. Derfor er det vigtigt at holde alle aliquots kolde under denne proces 11,13,14. Stigningen i ekstraktvolumen pr. vækst reducerer omkostningerne proportionalt og understøtter bioforsyningsapplikationer. Med de viste forbedringer giver CFAI-arbejdsgangen en lettere protokol for nye og erfarne brugere af cellefri teknologi til fremstilling af reproducerbar, funktionel E. coli-ekstrakt.

På trods af fordelene ved de leverede CFAI-medier er der begrænsninger for denne metode. Den primære udfordring er arbejdsgangens spirende karakter. Mens metabolomics-analyse har kastet lys over forskellene i CFAI OD600 10-ekstrakter såvel som reaktionsprodukter sammenlignet med 2xYTPG, forbliver konsekvenserne af disse forskelle på specifikke anvendelser ukarakteriserede27. Derudover er denne arbejdsgang udviklet til BL21 E. coli-baseret lysat. Det er uklart, om mediereformuleringen ville understøtte robust ekstraktforberedelse fra andre E. coli-stammer, såsom de genomisk omkodede stammer af E. coli28,29. Det er muligt, at CFAI-metoden kan anvendes til generering af ekstrakter fra andre bakterielle organismer, men det er usandsynligt, at det understøtter ekstraktforberedelse til eukaryote organismer såsom kinesisk hamsterovarie eller kaninreticulocyt; disse har dog deres egne etablerede metoder30,31. Vi forventer, at enkelheden i CFAI-arbejdsgangen vil reducere barriererne og tilskynde det cellefrie samfund til at karakterisere og evaluere dets anvendelighed til den brede vifte af applikationer, som CFPS understøtter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfattere vil gerne anerkende Dr. Jennifer VanderKelen og Andrea Laubscher for teknisk support. Forfattere vil også gerne takke Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington og Jillian Kasman for nyttige diskussioner. Forfattere anerkender også finansieringsstøtte fra Bill og Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly og National Science Foundation (NSF-1708919).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microfuge Tubes Phenix MPC-425Q
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader Biotek BTCYT5F
D-Glucose Fisher D16-3
D-Lactose Alfa Aesar J66376
DTT ThermoFisher 15508013
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
Glycerol Fisher BP229-1
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
HEPES ThermoFisher 11344041
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Glutamic Acid Sigma-Aldrich G1501-500G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Luria Broth ThermoFisher 12795027
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
NaCl Alfa Aesar A12313
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
NH4(Glu) Sigma-Aldrich 09689-250G
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic Acros, Organics A0382124
Potassium Phosphate Monobasic Acros, Organics A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50HZ
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
  3. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
  4. Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  5. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  6. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
  7. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
  8. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
  9. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
  10. Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
  11. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  14. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  15. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  16. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  17. Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
  18. Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
  19. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  20. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  21. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
  24. Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
  25. Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  27. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  28. Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
  29. Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
  30. Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
  31. Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).

Tags

Bioengineering udgave 173

Erratum

Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 05/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

Fra celler til cellefri proteinsyntese inden for 24 timer ved hjælp af cellefri autoinduktionsarbejdsgang
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, … More

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow. J. Vis. Exp. (173), e62866, doi:10.3791/62866 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter