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Von der Zelle zur zellfreien Proteinsynthese innerhalb von 24 Stunden mit zellfreiem Autoinduktions-Workflow

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DOI:

10.3791/62866

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22. Juli 2021

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

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Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von Zellextrakt aus Escherichia coli (E. coli ) gefolgt von zellfreien Proteinsynthesereaktionen (CFPS) in weniger als 24 Stunden. Die Erläuterung des CFAI-Protokolls (Cell-Free Autoinduction) beschreibt Verbesserungen, die vorgenommen wurden, um die Aufsicht der Forscher zu reduzieren und die Mengen des erhaltenen Zellextrakts zu erhöhen.

Zusammenfassung

Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) hat sich zu einer biotechnologischen Plattform entwickelt, die Transkriptions- und Translationsmaschinen in vitro erfasst. Zahlreiche Entwicklungen haben die CFPS-Plattform für neue Anwender zugänglicher gemacht und das Anwendungsspektrum erweitert. Für lysatbasierte CFPS-Systeme können Zellextrakte aus einer Vielzahl von Organismen erzeugt werden, wobei die einzigartige Biochemie dieses Wirts genutzt wird, um die Proteinsynthese zu verstärken. In den letzten 20 Jahren hat sich Escherichia coli (E. coli) aufgrund seiner Erschwinglichkeit und Vielseitigkeit zu einem der am häufigsten verwendeten Organismen zur Unterstützung von CFPS entwickelt. Trotz zahlreicher wichtiger Fortschritte ist der Workflow für die Herstellung von E. coli-Zellextrakten nach wie vor ein wichtiger Engpass für neue Anwender bei der Implementierung von CFPS für ihre Anwendungen . Der Workflow der Extraktaufbereitung ist zeitintensiv und erfordert technisches Know-how, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Um diese Barrieren zu überwinden, haben wir bereits über die Entwicklung eines 24-Stunden-CFAI-Workflows (Cell-Free Autoinduction) berichtet, der den Benutzeraufwand und das erforderliche technische Fachwissen reduziert. Der CFAI-Workflow minimiert den Arbeitsaufwand und die technischen Fähigkeiten, die für die Erzeugung von Zellextrakten erforderlich sind, und erhöht gleichzeitig die Gesamtmenge der erhaltenen Zellextrakte. Hier beschreiben wir diesen Workflow Schritt für Schritt, um den Zugang zu verbessern und die breite Implementierung von E. coli-basiertem CFPS zu unterstützen.

Einleitung

Der Einsatz der zellfreien Proteinsynthese (CFPS) für biotechnologische Anwendungen hat in den letzten Jahren erheblich zugenommen 1,2,3. Diese Entwicklung ist zum Teil auf verstärkte Anstrengungen zum Verständnis der in CFPS auftretenden Prozesse und der Rolle jeder Komponentezurückzuführen 4,5. Darüber hinaus haben reduzierte Kosten, die auf optimierte Setups und alternative Energiequellen zurückzuführen sind, die Implementierung der zellfreien Technologie für neue Benutzer erleichtert 6,7,8,9. Um die notwendigen Transkriptions- und Translationsfaktoren für die Proteinsynthese zu implementieren, wird Zellextrakt häufig verwendet, um zellfreie Reaktionen anzutreiben10. Kürzlich veröffentlichte Benutzerhandbücher haben einfache Protokolle für die Erstellung von Funktionsextrakten bereitgestellt, die die Implementierung für neue und erfahreneBenutzer erleichtern 1,11,12,13,14. Zellextrakt wird normalerweise durch die Lyse einer Zellkultur gewonnen, die je nach gewünschter spezifischer Verwendung mit verschiedenen Organismen gezüchtet werden kann 1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) hat sich schnell zu einem der am häufigsten verwendeten Wirtsorganismen für die Herstellung funktioneller Extrakteentwickelt 17. Der Stamm BL21 Star (DE3) wird bevorzugt, da er die Proteasen von der äußeren Membran (OmpT-Protease) und dem Zytoplasma (Lon-Protease) entfernt und eine optimale Umgebung für die rekombinante Proteinexpression bietet. Darüber hinaus enthält das DE3 das λDE3, das das Gen für die T7-RNA-Polymerase (T7-RNAP) unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors trägt; Die Sternkomponente enthält ein mutiertes RNaseE-Gen, das die Spaltung der mRNA 4,14,18,19 verhindert. Unter dem lacUV5-Promotor ermöglicht die Induktion von Isopropyl-Thiogalactopyranosid (IPTG) die Expression von T7-RNAP20,21. Diese Stämme werden verwendet, um Zellen zu züchten und zu ernten, die Rohstoffe für die Extraktherstellung liefern. Die Zelllyse kann mit einer Vielzahl von Methoden durchgeführt werden, einschließlich Perlenschlagen, French Press, Homogenisierung, Beschallung und Stickstoffkavitation 1,11,12,22.

Der Prozess der Bakterienkultur und -ernte ist bei der Verwendung von E. coli auf den meisten Plattformen konsistent, erfordert jedoch mehrere Tage und eine intensive Aufsicht durch die Forscher 1,11,13. Dieser Prozess beginnt im Allgemeinen mit einer Samenkultur über Nacht in LB-Brühe, die dann bei Wachstum über Nacht am nächsten Tag in eine größere Kultur von 2xYTPG (Hefe, Trypton, Phosphatpuffer, Glukose) eingeimpft wird. Das Wachstum dieser größeren Kultur wird überwacht, bis sie die frühe bis mittlere Log-Phase mit einer optischen Dichte (OD) von 2,514,20 erreicht. Eine konstante Messung ist erforderlich, da sich die Komponenten der Transkription und Translation bereits in der frühen bis mittleren Log-Phase23,24 als hochaktiv erwiesen haben. Während dieser Prozess reproduzierbaren Extrakt erzeugen kann, hat unser Labor kürzlich eine neue Methode mit Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media entwickelt, die die Aufsicht der Forscher reduziert, die Gesamtausbeute an Extrakt für einen bestimmten Liter Zellkultur erhöht und den Zugang zu E. coli-basierter Extraktvorbereitung für erfahrene und neue Benutzer verbessert (Abbildung 1 ). Hier bieten wir die Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Implementierung des CFAI-Workflows, um innerhalb von 24 Stunden von einer gestreiften Zellplatte zu einer abgeschlossenen CFPS-Reaktion zu gelangen.

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Protokoll

1. Medienwachstum

  1. Bereiten Sie 960 ml CFAI-Medien wie in Tabelle 1 beschrieben vor und stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,2 ein.
  2. Übertragen Sie Kulturmedien für 30 min bei 121 °C auf einen 2,5 l verblüfften Kolben und Autoklaven.
  3. Bereiten Sie eine 40 ml Zuckerlösung vor, wie in Tabelle 1 beschrieben. Sterilisieren Sie die Lösung in einen separaten Autoklavglasbehälter.
    HINWEIS: Die Zuckerlösung kann bis zur weiteren Verwendung in einem 30 °C Inkubator gelagert werden.
  4. Lassen Sie die Medien nach dem Autoklavieren vollständig auf unter 40 °C abkühlen.
  5. Vor der Beimpfung der CFAI-Medien die Zuckerlösung direkt in die CFAI-Medien geben.
  6. Um das Medium zu impfen, streichen Sie eine Schleife voller Kolonien von einer zuvor gestreiften E. coli BL21 Star (DE3) -Platte und legen Sie sie direkt in das Medium ein. Schwenken Sie die Schlaufe in das Medium, aber vermeiden Sie es, die Seiten des Behälters zu berühren. Stellen Sie sicher, dass die Streifenplatte frisch ist und lebensfähige Zellen enthält.
  7. Legen Sie den Kolben mit den geimpften Medien in einen 30 °C Inkubator, während Sie bei 200 U / min schütteln. Lassen Sie die Kultur über Nacht wachsen. Wenn die Zellen abends geimpft werden, erreicht die Kultur eine ungefähre optische Dichte, gemessen bei 600 nm (OD600), von 10 am folgenden Morgen. Impf- und Erntezeiten können nach Bedarf angepasst werden.

2. Zellernte

  1. Bereiten Sie den S30-Puffer im Voraus vor und halten Sie ihn kalt. Der S30-Puffer wird gemäß Tabelle 2 auf einen endgültigen pH-Wert von 8,2 vorbereitet.
    HINWEIS: Der S30-Puffer kann Tage vor der Zellernte vorbereitet werden. Wenn dies geschieht, bereiten Sie ohne Dithiothreitol vor und lagern Sie es bei 4 ° C. Dithiothreitol kurz vor Gebrauch hinzufügen.
  2. Halten Sie ab diesem Zeitpunkt alle Lösungen und Materialien auf Eis. 1 L Medien in eine 1 L Zentrifugenflasche geben und bei 5.000 x g zwischen 4-10 °C für 10 min zentrifugieren. Dekantieren und entsorgen Sie den Überstand. Mit einem sterilen Spatel das Pellet in ein vorgekühltes und zuvor gewogenes 50 ml konisches Rohr überführen.
  3. Einmal mit 30-40 ml kaltem S30-Puffer waschen, indem Sie das Pellet durch Vortexing in 30 s Ausbrüchen mit Ruhephasen auf Eis wieder suspendieren.
    HINWEIS: Aufgrund eines höheren Pelletvolumens kann das Aufteilen des Zellpellets in zwei 50 ml konische Röhrchen für den Waschschritt hilfreich sein. Das Speichern von Zellen in kleineren Aliquots bietet auch Flexibilität für die nachgelagerte Verarbeitung.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellresuspension bei 5000 x g zwischen 4-10 °C für 10 min.
  5. Entsorgen Sie den Überstand und wischen Sie den Überschuss von den Innenwänden des 50 ml konischen Rohrs mit einem Reingewebe ab, vermeiden Sie es, das Pellet selbst zu berühren. Wiegen und schockgefrieren Sie das Pellet in flüssigem Stickstoff. Bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Pellets erfordern möglicherweise kein Schockgefrieren, wenn der Benutzer plant, mit dem Extraktvorbereitungsprotokoll fortzufahren.

3. Extraktvorbereitung

  1. Kombinieren Sie das gefrorene Pellet mit 1 ml S30-Puffer pro 1 g des Zellpellets und lassen Sie es ca. 30-60 min auf Eis auftauen. Resuspendiertes aufgetautes Pellet durch Vortexing in Schüben von 30 s mit Ruhephasen auf Eis. Wirbel, bis keine sichtbaren Zellklumpen mehr übrig sind.
    HINWEIS: Kleinere Klumpen können durch Mischen mit einer Pipette resuspendiert werden.
  2. Transfer von Aliquots von 1,4 ml Zellresuspension in 1,5 ml Mikrofugenröhrchen für die Zelllyse. Beschallen Sie jede Röhre mit einer Frequenz von 20 kHz und 50% Amplitude für drei Ausbrüche von 45 s mit 59 s Ruhe pro Zyklus, umgeben von einem Eisbad. Kehren Sie das Rohr zwischen den Zyklen um und fügen Sie nach dem letzten Beschallungszyklus sofort 4,5 μL 1 M Dithiothreitol hinzu.
    HINWEIS: Aufgrund der bei der Beschallung freigesetzten Wärme ist es äußerst wichtig, sicherzustellen, dass alle Aliquots auf Eis gehalten werden, wenn sie nicht beschallt werden. Das Eisbad sollte ständig aufgefüllt oder groß genug sein, um während des gesamten Beschallungsprozesses kühl zu bleiben.
  3. Zentrieren Sie jedes Röhrchen bei 18.000 x g und 4 °C für 10 min. Holen Sie sich den Überstand und das Aliquot in 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen in 600-μL-Aliquoten. Aliquots einfrieren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern. Es sollte darauf geachtet werden, nur den Überstand zu pipettieren.

4. Zellfreie Proteinsynthese

  1. Tauen Sie ein Aliquot Extrakt aus dem vorherigen Schritt auf, um 15 μL zellfreie Proteinsynthesereaktionen in 1,5 ml Mikrofugenröhrchen in Quadruplicate durchzuführen.
  2. Bereiten Sie jede Reaktion vor, indem Sie 240 ng DNA (16 μg/ml Endkonzentration), 2,20 μL Lösung A, 2,10 μL Lösung B, 5,0 μL Extrakt und ein variierendes Volumen an molekularem Wasser kombinieren, um die Reaktion auf 15 μL zu füllen. Diese Reaktion kann auf höhere Volumina skaliert werden. Die Verhältnisse sind Tabelle 3 zu entnehmen.
    1. Bereiten Sie die Lösungen A und B gemäß Tabelle 4 vor. Jede Lösung kann in Chargen von 100 μL bis 1 ml hergestellt, aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert werden.
      HINWEIS: Die DNA-Menge kann je nach interessantem Protein variieren. In diesem Fall wurde das verwendete Plasmid pJL1-sfGFP für eine Leistung von 16 μg/ml oder 597 μM optimiert.
  3. Lassen Sie die Reaktionen mindestens 4 h bei 37 °C laufen.

5. Quantifizierung von Reporterprotein, Superfolder grün fluoreszierendes Protein (sfGFP)

  1. Kombinieren Sie 2 μL jedes zellfreien Proteinsynthesereaktionsprodukts mit 48 μL 0,05 M HEPES-Puffer bei pH 7,2 mit einer halbgroßen schwarzen Polystyrolplatte mit einer Fläche von 96 Wells. Drei bis vier Replikate jedes Reaktionsrohrs werden empfohlen.
  2. Quantifizierung der Fluoreszenzintensität des sfGFP mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 528 nm.
  3. Für die Umrechnung von relativen Fluoreszenzeinheiten in volumetrische Ausbeute (μg/ml) von sfGFP ist eine Standardkurve mit gereinigtem pJL1-sfGFP zu erstellen.

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Ergebnisse

Bei der Herstellung von CFAI-Medien wurde Glukose gegen eine Erhöhung von Laktose und Glycerin als Hauptenergiesubstrat in den Medien ausgetauscht. Zusätzlich wurde auch die Pufferkapazität der CFAI-Medien erhöht. Diese spezifischen Komponenten sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die Zellen wurden dann sowohl zu einem OD600 von 10 als auch zum Standard 2,5 in CFAI-Medien gezüchtet, um trotz unterschiedlicher Extraktmengen Konsistenz mit der Extraktqualität zu zeigen. Das ...

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Diskussion

Die Aufsicht der Forscher wird traditionell für zwei Schlüsselaktionen während des Zellwachstums benötigt: die Induktion von T7-RNAP und die Gewinnung von Zellen bei einem spezifischen OD600. CFAI macht beide Anforderungen überflüssig, um die Zeit des Forschers und die technische Ausbildung zu verringern, die für die Herstellung hochwertiger Zellextrakte erforderlich sind. Die Autoinduktion von T7-RNAP wird erreicht, indem Glukose durch Laktose als primären Zucker in den Medien ersetzt wird, wodurch die vorher...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Jennifer VanderKelen und Andrea Laubscher für die technische Unterstützung. Die Autoren danken auch Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington und Jillian Kasman für hilfreiche Diskussionen. Die Autoren würdigen auch die finanzielle Unterstützung durch den Bill and Linda Frost Fund, den Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant des Center for Applications in Biotechnology, Cal Poly Research, Scholarly und die National Science Foundation (NSF-1708919).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL Mikrofuge-RöhrchenPhenixMPC-425Q
1L ZentrifugenröhrchenBeckman CoulterA99028
Avanti J-E ZentrifugeBeckman Coulter369001
CoASigma-AldrichC3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode ReaderBiotekBTCYT5F
D-GlucoseFisherD16-3
D-LaktoseAlfa AesarJ66376
DTTThermoFisher15508013
FolinsäureSigma-AldrichF7878-100MG
GlycerinFisherBP229-1
GlycinSigma-AldrichG7126-100G
HEPESThermoFisher11344041
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
JLA-8.1000 RotorBeckman Coulter366754
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
L-AlaninSigma-AldrichA7627-100G
L-ArgininSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparaginSigma-AldrichA0884-25G
L-AsparaginsäureSigma-AldrichA7219-100G
L-CysteinSigma-AldrichC7352-25G
L-GlutaminsäureSigma-AldrichG1501-500G
L-GlutaminSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadinSigma-AldrichH8000-25G
L-IsoleucinSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucinSigma-AldrichL8000-25G
L-LysinSigma-AldrichL5501-25G
L-MethioninSigma-AldrichM9625-25G
L-PhenylalaninSigma-AldrichP2126-100G
L-ProlinSigma-AldrichP0380-100G
L-SerinSigma-AldrichS4500-100G
L-ThreoninSigma-AldrichT8625-25G
L-TryptophanSigma-AldrichT0254-25G
L-TyrosinSigma-AldrichT3754-100G
Luria BouillonThermoFisher12795027
L-ValinSigma-AldrichV0500-25G
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
Molekulares WasserSigma-Aldrich7732-18-5
NaClAlfa AesarA12313
NADSigma-AldrichN8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R InkubatorEppendorfM1335-0000
NH4(Glu)Sigma-Aldrich09689-250G
NTPsThermoFisherR0481
OxalsäureSigma-AldrichP0963-100G
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
Kaliumphosphat DibasischeAcros, Organische StoffeA0382124
Kaliumphosphat MonobasischeAcros, Organische StoffeA0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep KitThermoFisherK210007
PutrescineSigma-AldrichD13208-25G
SpermidinSigma-AldrichS0266-5G
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
tRNASigma-Aldrich10109541001
TryptonFisher Bioreagents73049-73-7
Tunair 2,5 l SchüttelkolbenSigma-AldrichZ710822
UltraschallprozessorQSonicaQ125-230V/50HZ
HefeextraktFisher Bioreagenzien1/2/8013

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Erratum


Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 5/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

Schlagwörter

E coli Extraktezellfreie ExpressionProtein EngineeringZelllyseSonikationsmethodeFluoreszenzquantifizierungS30 PufferBiotechnologie Ausbildung

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