Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen effizienten und reproduzierbaren Ansatz für histologische Studien des Mausgehirns, einschließlich Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung.

Zusammenfassung

Die immunhistochemische Färbung von Mäusegehirnen ist eine Routinetechnik, die häufig in den Neurowissenschaften verwendet wird, um zentrale Mechanismen zu untersuchen, die der Regulation des Energiestoffwechsels und anderer neurobiologischer Prozesse zugrunde liegen. Die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der Hirnhistologie kann jedoch zwischen den Labors variieren. Für jedes Färbeexperiment ist es notwendig, die Schlüsselverfahren basierend auf Unterschieden in Spezies, Geweben, Zielproteinen und den Arbeitsbedingungen der Reagenzien zu optimieren. Dieses Papier demonstriert einen zuverlässigen Workflow im Detail, einschließlich intraaortaler Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebender Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung, die von Forschern auf diesem Gebiet leicht verfolgt werden können.

Diskutiert wird auch, wie diese Verfahren modifiziert werden können, um den individuellen Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden. Um die Zuverlässigkeit und Effizienz dieses Protokolls zu veranschaulichen, wurden perineuronale Netze mit Biotin-markiertem Wisteria florbunda agglutinin (WFA) und Arginin-Vasopressin (AVP) mit einem Anti-AVP-Antikörper im Mausgehirn gefärbt. Schließlich wurden die kritischen Details für das gesamte Verfahren und die Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu denen anderer Protokolle angesprochen. Zusammengenommen stellt dieser Artikel ein optimiertes Protokoll für die frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirngewebe vor. Die Einhaltung dieses Protokolls erleichtert diesen Prozess sowohl für Nachwuchs- als auch für Senior-Wissenschaftler, um die Qualität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit von Immunostaining-Studien zu verbessern.

Einleitung

Die Prävalenz von Fettleibigkeit und damit verbundenen Komorbiditäten hat epidemische Ausmaße erreicht, was zu einer enormen sozioökonomischen Belastung ^führt1,2. Verschiedene Mausmodelle wurden entwickelt, um die biologischen Prozesse, die für Fettleibigkeit verantwortlich sind, besser zu ^verstehen3,4. Da in diesen Tiermodellen zentrale Mechanismen für die Regulation der Energiehomöostase wichtig sind, sind neuroanatomische Untersuchungen von Mausgehirnen zu einer notwendigen Technik auf diesem Gebiet geworden. Die Qualität, Zuverlässigkeit und Reprod....

Protokoll

C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts (8-16 Wochen) wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Die Pflege aller Tiere und alle Verfahren wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees des Baylor College of Medicine genehmigt.

1. Durchblutung

HINWEIS: Die Schritte 1.1 - 1.6 werden in einem Abzug ausgeführt.

1. Anästhesie
   1. Gießen Sie 5 ml Isofluran (siehe Materialtabelle) auf ein Papiertuch, das sich am Boden eines Exsikkators befindet. Führen Sie die Maus auf die durchlöcherte Barriere im Inneren des Exsikkators ein und warten Sie, bis die Anzeichen ein....

Ergebnisse

Das Flussdiagramm dieses Protokolls ist in Abbildung 1 kurz dargestellt. Das Kryosektionsverfahren dieses Labors ist in Abbildung 2A dargestellt, in der 5 Gehirnproben gleichzeitig geschnitten wurden. Die Montage von Hirnschnitten ist in Abbildung 2B dargestellt, und ein vollständig montierter Objektträger mit Hirnschnitten ist in Abbildung 2C dargestellt. In Abbildung 3 wu.......

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine etablierte Methode für neuroanatomische Studien des Mausgehirns, einschließlich Perfusion, Gewebeschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung. Einige wichtige Details, die für konsistente und zuverlässige Ergebnisse unerlässlich sind, müssen jedoch optimiert werden.

Die Qualität der Perfusion ist entscheidend für eine erfolgreiche Färbung. Die Färbeergebnisse können beeinträchtigt werden, wenn Blut im Gehirn verbleibt, da Blutkörperchen (z. B.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alexa Mehl 594 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30 % Saccharose	VWR	470302	30 g Saccharose in 100 mL PBS zerlegt
; Neutral gepuffertes Formalin	VWR	16004-128	10%, 25 &Grad; C, pH 6,8-7,2
1 mL Sub-Q Spritze	BD	309597
48-Well-Zellkulturplatte	Corning	3548
6-Well-Zellkulturplatte	Corning	3516
Antifading-Einbettmedien mit DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Autoklavierbarer Kunststoff-Exsikkator	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
AVP-Antikörper	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Zellsieb	Corning	431752
Kryoprotektivan-Puffer	Benutzerpräferenz	Nicht zutreffend	20 % Glycerin, 30 % Ethylenglykol und 50 % PBS
Isofluran	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX Mikroskop	Leica	Nicht zutreffend
Objektträgerboxen (50 Plätze)	VWR	Nicht zutreffend
PBT	Benutzerpräferenz	Nicht zutreffend	2,5 mL Triton X-100 aufgelöst in 1000 mL PBS
Perfusion zwei automatisierte Perfusionssysteme	Leica	39471005
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 ° C, pH 7,3-7,5, 1x Zusammensetzung:137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,8 mM Phosphatpuffer
Gleitmikrotom Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Natriumchlorid	RICCA Chemikalie	7220-32	0,9%, 25 ° C, pH 7,4
Streptavidin Protein, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
WFA Antikörper	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Nicht zutreffend
Zen 3.1 Software			Scanner Software