Globale Identifizierung von co-translationalen Interaktionsnetzwerken durch selektives Ribosomenprofiling

Zusammenfassung

Co-translationale Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei Modifikationen, Targeting-, Faltungs- und Montagepfaden der entstehenden Kette. Hier beschreiben wir Selective Ribosome Profiling, eine Methode zur in vivo, direkten Analyse dieser Wechselwirkungen im Modell Eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass Ribosomen nicht nur unsere mRNA entschlüsseln, sondern auch die Entstehung der Polypeptidkette in die überfüllte zelluläre Umgebung leiten. Ribosomen bieten die Plattform für die räumlich und kinetisch kontrollierte Bindung von Membran-Targeting-Faktoren, die Modifikation von Enzymen und die Faltung von Chaperonen. Sogar die Montage zu oligomeren Komplexen höherer Ordnung sowie Protein-Protein-Netzwerkbildungsschritte wurden kürzlich entdeckt, um mit der Synthese koordiniert zu sein.

Hier beschreiben wir das selektive Ribosom-Profiling, eine Methode, die entwickelt wurde, um co-translationale Interaktionen in vivo zu erfassen. Wir werden die verschiedenen Affinitätsreinigungsschritte detailliert beschreiben, die für die Erfassung von Ribosomen-Nascent-Chain-Komplexen zusammen mit co-translationalen Interaktoren erforderlich sind, sowie die mRNA-Extraktions-, Größenausschluss-, Reverse-Transkriptions-, Deep-Sequencing- und Big-Data-Analyseschritte, die erforderlich sind, um co-translationale Interaktionen in nahezu Codon-Auflösung zu entschlüsseln.

Einleitung

Selective RIbosom PRofiling (SeRP) ist die bisher einzige Methode, die co-translationale Interaktionen in vivo auf direkte Weise erfasst und charakterisiert 1,2,3,4,5,6. SeRP ermöglicht die globale Profilerstellung von Wechselwirkungen eines beliebigen Faktors mit der Übersetzung von Ribosomen in nahezu Codon-Auflösung ^2,7.

Die Methode beruht auf dem Einfrie....

Protokoll

1. Generieren von Stämmen für die selektive Ribosomenprofilierung

HINWEIS: Selektives RIbosom PRofiling (SeRP) ist eine Methode, die auf der Affinitätsreinigung von Faktoren von Interesse beruht, um ihre Art der Interaktion mit Ribosomen-naszierenden Kettenkomplexen zu bewerten. Homologe Rekombination⁹ sowie CRISPR / Cas9^10-basierte Methoden werden verwendet, um verschiedene Faktoren von Interesse mit Tags für Affinitätsreinigungen zu verschmelzen. Solche Tags sind GFP, für GFP-Fallen-Affinitätsreinigungen, TAP-Tag für IgG-Sepharus-Perlenreinigungen sowie AVI-Tag, gereinigt ....

Ergebnisse

Wie im Flussdiagramm dieses Protokolls dargestellt (Abbildung 1), wurden Zellen in die Log-Phase gezüchtet und dann schnell durch Filtration gesammelt und durch kryogenes Mahlen lysiert. Das Lysat wurde dann in zwei Teile geteilt: einen für die gesamten Ribosomen-geschützten mRNA-Fußabdrücke und den anderen für ausgewählte Ribosomen-geschützte mRNA-Fußabdrücke, an denen wir eine Affinitätsreinigung durchführten, um die markierten Protein-Ribosomen-naszierenden Kettenkomplexe herunterzuziehen.......

Diskussion

Hier beschreibt das Protokoll den Selective Ribosome Profiling-Ansatz zur Erfassung co-translationaler Interaktionen in nahezu Codon-Auflösung. Da das Ribosom als Drehscheibe für die Koordination der Entstehung der entstehenden Kette in das überfüllte Zytoplasma aufsteigt, ist dies eine entscheidende Methode, um die verschiedenen co-translationalen Wechselwirkungen zu identifizieren und zu charakterisieren, die zur Gewährleistung eines funktionellen Proteoms sowie zur Untersuchung verschiedener Krankheiten erforderlich s.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3'-Phosphoryliertes 28 nt RNA-Kontroll-Oligonukleotid	IDT	kundenspezifische	RNase-freie HPLC-Aufreinigung; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'Absolutes
Ethanol	VWR	20821
Saures Phenol Chloroform	Ambion	AM9722
Antikörper: monklonales Anti-HA der Maus	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto-Agar	BD	214030
Bacto Pepton	BD	211820
Bacto Trypton	BD
Bacto Hefeextrakt	BD	212720
Bestatinhydrochlorid	Roth	2937.2
Chloroform	Merck	102445
CircLigase II ssDNA Ligase*	Epizentrum	CL9025K	100 U/μ L
Kolloidale Coomassie-Färbelösung	Roth	4829
cOmplete, EDTA-freie Proteasehemmer-Cocktailtabletten	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC-behandeltes und steril gefiltertes Wasser*	Sigma	95284
D-Glukose wasserfrei	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonat	Roth	K028
Dimethylsulfoxid*	Sigma-Aldrich	276855 DNA-Leiter
, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA-Ladefarbstoff*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6&fach;
DNase I, rekombinantes		4716728001	RNAse freies
dNTP-Lösungsset*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glycerin	VWR	24388.260.
Glycinlösung	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion Polymerase*	NEB	M0530L
HK aus S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Salzsäure	AppliChem	A1305
Isopropanol	Sigma-Aldrich	33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid	Roth	CN08
Kanamycin	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L(rt)	IDT	Sonderanfertigung
Flüssigstickstoff
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4· 2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4· H2	O Roth	K300.2
NHS-aktivierte Sepharose 4 Fast-Flow-Kügelchen	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 Ersatz	Sigma	74385
Pepstatin A	Roth	2936.2
Phenylmethylsulfonylfluorid	Roth	6367
Fertiggele	Bio-Rad	5671034	10% und 12%
RNase I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNase frei
Natriumacetat*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5,5
Natriumazid	Merck	S8032-100G
Natriumchlorid	Roth	9265
Natriumhydroxid*	Sigma	S2770	1 N
Saccharose	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Superscript III Reverse Transciptase*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 Polynukleotidkinase*	NEB	M0201L
T4 RNA Ligase 2*	NEB	M0242L
FSME Polyacrylamid Gel*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE– Harnstoff-Polyacrylamid-Gel*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE– Harnstoff-Polyacrylamid-Gel*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE– Harnstoff-Probenpuffer*	Novex	LC6876	2&fach;
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7,0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8,0
UltraPure 10&fach; TBE-Puffer*	Invitrogen	15581-044
* - für Bibliotheksvorbereitungsdichtung
und Federklemme, 90 mm,Millipore
Schliffkolben 1 L ,	Millipore	XX1504705

211699 Roche XX1009020