Methodenartikel

Im lebenden Organismus Methoden zur Beurteilung der Funktion und Struktur retinaler Ganglienzellen und Sehnerven bei Großtieren

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DOI:

10.3791/62879

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26. Februar 2022

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1The Eye Hospital, School of Ophthalmology & Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier demonstrieren wir mehrere In-vivo-Tests (Flash Visual Evoked Potential, Muster-Elektroretinogramm und optische Kohärenztomographie) an Ziegen- und Rhesusaffen, um die Struktur und Funktion des Sehnervs und seiner Neuronen zu verstehen.

Zusammenfassung

Der Sehnerv sammelt Axonsignale von den retinalen Ganglienzellen und überträgt visuelle Signale an das Gehirn. Große Tiermodelle der Sehnervenverletzung sind aufgrund ihrer engeren Ähnlichkeit mit Menschen in Größe und Anatomie unerlässlich, um neuartige therapeutische Strategien von Nagetiermodellen auf die klinische Anwendung zu übertragen. Hier beschreiben wir einige In-vivo-Methoden zur Bewertung der Funktion und Struktur der retinalen Ganglienzellen (RGCs) und des Sehnervs (ON) bei großen Tieren, einschließlich des visuell evozierten Potentials (VEP), des Musterelektroretinogramms (PERG) und der optischen Kohärenztomographie (OCT). In dieser Studie wurden sowohl Ziegen als auch nichtmenschliche Primaten eingesetzt. Durch die schrittweise Präsentation dieser In-vivo-Methoden hoffen wir, die experimentelle Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Labors zu erhöhen und die Verwendung von Großtiermodellen optischer Neuropathien zu erleichtern.

Einleitung

Der Sehnerv (ON), der aus Axonen der retinalen Ganglienzellen (RGC) besteht, überträgt visuelle Signale von der Netzhaut an das Gehirn. ON-Erkrankungen wie Glaukom, traumatische oder ischämische Optikusneuropathie verursachten häufig eine irreversible ON/ RGC-Degeneration und einen verheerenden Sehverlust. Obwohl es derzeit viele Durchbrüche bei der ON-Regeneration und dem RGC-Schutz in Nagetiermodellen gibt1,2,3,4,5,6, blieben die klinischen Behandlungen für die meisten ON-Erkrankungen im letzten halben Jahrhundert im Wesentlichen gleich mit unbefriedigendem Ergebnis7,8 . Um die Lücke zwischen Grundlagenforschung und klinischer Praxis zu schließen, sind translationale Studien mit Großtiermodellen von ON-Krankheiten oft notwendig und vorteilhaft, da sie anatomisch näher am Menschen sind als Nagetiermodelle.

Ziegen- und Rhesusmakaken sind zwei große Tierarten, die in unserem Labor verwendet werden, um die ON-Krankheit des Menschen zu modellieren. Die Größe des Augapfels einer Ziege, ON und der angrenzenden Struktur (Orbital- und Nasenhöhle, Schädelbasis usw.) ähnelt der eines Menschen basierend auf dem Schädel-CT-Scan9. Als solches bietet das Ziegenmodell die Möglichkeit, therapeutische Geräte oder chirurgische Verfahren vor der Anwendung beim Menschen zu bewerten und zu verfeinern. Der Rhesusaffe hat als nichtmenschlicher Primat (NHP) ein menschenähnliches einzigartiges visuelles System, das bei anderen Arten nicht existiert10,11. Darüber hinaus sind die pathophysiologischen Reaktionen auf Verletzungen und Behandlungen bei NHP denen beim Menschen sehr ähnlich12.

In-vivo-Tests zur Beurteilung der Struktur und Funktion von ON und RGC in Längsrichtung sind in Großtierstudien wichtig. Das Musterelektroretinogramm (PERG) wurde verwendet, um die RGC-Funktion zu bewerten. Flash Visual Evoked Potential (FVEP) spiegelt die Integrität des retino-geniculo-kortikalen Weges im visuellen System wider. Somit kann PERG in Kombination mit FVEP die ON-Funktion9,13,14 widerspiegeln. Die retinale optische Kohärenztomographie (OCT) kann die Netzhautstruktur mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zeigen, was die Messung der Dicke des retinalen Ganglienkomplexes (GCC) ermöglicht9,15. Für elektrophysiologische Untersuchungen in dieser Studie ist die Überwachung der Vitalparameter (Hitzerate, Bruchrate, Blutdruck) und des Sauerstoffsättigungsgrades (SpO2) vor dem Test von entscheidender Bedeutung, da diese Parameter starke Auswirkungen auf den Augenblutfluss und damit auf die Funktion des visuellen Systems haben. Der Einfachheit halber haben wir jedoch die Vitalfunktionen bei der OCT-Netzhautbildgebung nicht überwacht. Laut unserer vorherigen Studie9 ist die GCC-Dicke, die durch OCT-Netzhautbildgebung gemessen wurde, ziemlich stabil, mit einem Variationskoeffizienten zwischen den Sitzungen in der Nähe von 3%. Diese In-vivo-Tests an Ziegen- und Rhesusaffen wurden in unserer vorherigen Studie ausführlich beschrieben9. Hier stellen wir diese Methoden vor, um die experimentelle Transparenz und Reproduzierbarkeit zu erhöhen.

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Protokoll

Die Experimente wurden streng in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien und dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und entsprechen den Protokollen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wenzhou Medical University (WMU) und des Joinn Laboratory (Suzhou) genehmigt wurden. Die männlichen Saanenziegen im Alter von 4 bis 6 Monaten mit einem Gewicht von 19-23 kg wurden in der Tierhaltung der WMU untergebracht. Die männlichen Rhesusmakaken im Alter von 5 bis 6 Jahren mit einem Gewicht von 5-7 kg wurden in der Tierhaltung Joinn untergebracht. Alle Tiere wurden in einem klimatisierten Raum mit kontrollierter Temperatur (21 ± 2 °C) unter einem 12 h Licht-/12 h Dunkelzyklus mit Ad-libitum-Futter gehalten.

1. Flash visual evoked potential (FVEP) bei Ziege

  1. Allgemeine Betäubung
    1. Rasieren Sie die Hockhaare mit einem elektronischen Rasierer.
    2. Bereiten Sie die Haut vor, indem Sie dreimal mit 70% Alkohol einreiben, um die Haut zu reinigen, und legen Sie dann die subkutane Vene frei.
    3. Führen Sie einen peripheren Venenkatheter intravenös (0,9 mm x 25 mm) ein und injizieren Sie dann Atropin (0,025 mg/kg) und Propofol (5 mg/kg).
    4. Intubieren Sie die Ziege mit einem 6 mm Trachealschlauch und verbinden Sie sie mit einem künstlichen Beatmungsgerät.
    5. Halten Sie die Anästhesie mit 3,5% Isofluran in Sauerstoff bei einer konstanten Durchflussrate von 2 l / min aufrecht.
      HINWEIS: Die Ziege erholt sich innerhalb von Minuten von der durch Propofol induzierten Anästhesie, also seien Sie schnell, um die Ziege zu intubieren.
  2. Kardiopulmonale Überwachung
    1. Platzieren Sie den Temperatursensor unter der Zunge.
    2. Verbinden Sie das Pulsoximeter mit dem proximalen Ende des Ohres.
    3. Binden Sie die Blutdruckmanschette an die Basis des Oberschenkels.
    4. Klemmen Sie die EKG-Clips entsprechend an die Gliedmaßen.
      HINWEIS: Die normale Herzfrequenz von Ziegen beträgt 68-150 bpm. Aufgrund der Verwendung von Gasanästhesie wird die Herzfrequenz von Ziegen erhöht. Daher beträgt unsere Herzfrequenz während der Inspektion 170 ± 30 bpm. Der systolische Blutdruck von Ziegen unter normalen Bedingungen beträgt 110-130 mmHg und der diastolische Blutdruck beträgt 50-60 mmHg. Im Zustand des Einatmens von Sauerstoff kann die Sauerstoffsättigung des Ziegenblutes immer bei 99% gehalten werden. Die Atemfrequenz von Ziegen unter Narkose ist mit der des Beatmungsgeräts synchronisiert, die 10 Atemzüge/min beträgt. Da die Temperatur unter der Zunge der Ziege gemessen wurde, nicht die Kerntemperatur, beträgt die Temperatur der Ziege im Allgemeinen 35 ± 2 °C.
  3. Implantation von Schädelschrauben und Platzierung der Elektroden
    1. Rasieren Sie die Haare mit einem Haarschneider. Desinfizieren Sie die Haut in der Mitte des Stirnbeins, indem Sie dreimal mit einem in Betadin und 70% Alkohol getränkten Wattebausch reiben.
    2. Verwenden Sie sterilisierte Schrauben und Scheren.
      HINWEIS: Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente zur Sterilisation (121 °C, 20 min).
    3. Machen Sie einen 5-mm-Hautschnitt, um den Frontalknochen mit einer Augenschere freizulegen, und implantieren Sie dann eine sterilisierte Schraube in der Mitte des Frontalknochens mit einem Schraubendreher.
    4. Rasieren Sie die Haare und desinfizieren Sie die Haut am zentralen Hinterhauptbein zwischen zwei Ohren mit Betadin und 70% Alkohol, einem gefolgt von dem anderen, dreimal.
    5. Machen Sie einen 5-mm-Hautschnitt, um den Okzipitalknochen mit einer Augenschere freizulegen, und implantieren Sie dann eine sterilisierte Schraube in der Mitte des Okzipitalknochens.
      HINWEIS: Die geschliffene Nadelelektrode wird subkutan unter die vordere Schädelschraube eingeführt. Die Aktiv- und Referenzelektroden sind mit den Okzipital- bzw. Frontalschrauben mit Krokodilklemmen verbunden, um die Elektrodenimpedanz zu reduzieren16.
  4. Tierpräparation
    1. Verwenden Sie ein lichtdichtes Tuch, um das Auge zu bedecken, und fixieren Sie es an der Augenbinde, um ein Auge zu flicken.
    2. Tragen Sie topische anästhetische Augentropfen (Proparacainhydrochlorid-Augentropfen) auf beide Augen auf. Bilaterale Pupillen werden durch topische Verabreichung von mydriatischen Augentropfen mit Tropicamid (5%) und Phenylephrin (5%) erweitert.
    3. Legen Sie den Kopf der Ziege in den Ganzfeld-Stimulator und dimmen Sie das Umgebungslicht.
      HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass Ziegen eine gute Augapfelfixierung unter Narkose aufrechterhalten können, so dass keine zusätzliche Augapfelfixierungsoperation erforderlich ist.
    4. Bedecken Sie den Stimulator und den Kopf der Ziege mit einer schwarzen Decke für 5 minuten zur Anpassung.
    5. Verwenden Sie Augenlidspekulum, um die bulbäre Bindehaut freizulegen. Falten Sie den oberen Ring, ziehen Sie das obere Augenlid nach oben und führen Sie den oberen Ring zuerst in den Bindehautsack des oberen Augenlids und dann auf ähnliche Weise in das untere Augenlid ein.
    6. Drücken Sie die Impedanztaste , um die Elektroden-Gewebe-Kontaktimpedanz zu überprüfen, und die Impedanzwerte werden in jedem Kanal angezeigt.
    7. Stellen Sie sicher, dass die Impedanz für jede Elektrode unter 10 kΩ liegt, um elektromagnetische Störungen durch andere elektrische Geräte im selben Raum zu vermeiden.
      HINWEIS: Wenn sie über 10 kΩ liegt, schließen Sie die Elektrode wieder an oder ersetzen Sie sie. Die Impedanz kann ungewöhnlich hoch erscheinen, wenn das elektrische Metall-Operationsbett, in dem die Ziege liegt, verstopft ist. Die Impedanz sollte zwischen der aktiven und der Referenzelektrode um weniger als 1 kΩ abweichen, um elektrische Störungen zu reduzieren17.
    8. Drücken Sie die Oscillograph-Taste , um das Grundrauschen ohne Lichtstimulation zu überprüfen.
      HINWEIS: Wenn ein großes Grundrauschen auftritt, trennen Sie alle anderen elektrischen Geräte im selben Raum und schalten Sie die Mobiltelefone aus. Wenn das Basisproblem weiterhin besteht, fahren Sie mit Schritt 1.3.10 fort. um zu überprüfen, ob eine typische FVEP-Wellenform hervorgerufen werden kann. Ist dies nicht der Fall, verschieben Sie den FVEP-Test zu einem anderen Zeitpunkt.
    9. Starten Sie die FVEP-Aufnahme, indem Sie die Lichtintensität von 0,025, 0,5 bzw. 3,0 cd·s/m2 im weißen Hintergrundfeld in der oberen rechten Ecke auswählen. Drücken Sie dann die Taste Untersuchung . Beachten Sie, dass die FVEP-Aufzeichnung bei jeder Lichtintensität zweimal durchgeführt wird.
      HINWEIS: Wenn die beiden Wellenformen offensichtlich unterschiedlich erscheinen, ist eine weitere Wiederholung erforderlich.
    10. Befeuchten Sie die Hornhaut mit künstlichen Tränentropfen, wenn sie auf der Infrarotkamera trocken erscheint.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Augenposition vor der Aufnahme mit der integrierten Infrarotkamera, um sicherzustellen, dass der visuelle Blick korrekt ist und die Pupille vollständig belichtet ist (so dass die Feldgröße eines Blitzstimulus 90 ° beträgt). Die Augenposition einer betäubten Ziege kann durch entsprechendes Drehen des Kopfes eingestellt werden. Nach unserer Beobachtung kommt es während der FVEP-Aufnahme (~10 min) bei Ziegen unter Vollnarkose selten zu Blickwanderungen9. Es besteht also keine Notwendigkeit, den Blick während der Aufnahme anzuhalten und neu einzustellen.
    11. Wiederholen Sie die obigen Schritte für das kontralaterale Auge.
    12. Stoppen Sie die Isofluranzufuhr und erhöhen Sie das Tidalvolumen am Beatmungsgerät leicht, um der Ziege zu helfen, sich von der Vollnarkose zu erholen.
    13. Behandeln Sie die Ziege nach Vollnarkose mit Gentamicin (4 mg/kg, IM) und Ceftiofur-Natrium (ein Cephalosporin, 2 mg/kg, IM), um eine Infektion zu verhindern.
  5. FVEP-Messung und quantitative Analyse
    HINWEIS: Wie in Abbildung 1A dargestellt, werden die ersten positiven und negativen Peaks in der FVEP-Wellenform als P1 und N1 und der zweite positive Peak als P2 bezeichnet. Die typische implizite Zeit von P1, N1 und P2 liegt bei etwa 40, 60 bzw. 120 ms. P1- und P2-Amplituden werden vom Tiefpunkt der N1-Wellenform bis zu den Spitzen der P1- bzw. P2-Wellenformen gemessen.
    1. Verwenden Sie im Falle einer monokulären Verletzung einen interokularen Vergleich der Amplitude und der impliziten Zeit, um die Variation der Intersession zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu erhöhen17.

2. PVEP bei Rhesusaffen

HINWEIS: Muster-VEPs könnten bei Rhesusaffen9 ausgelöst werden und sind in Amplitude und impliziter Zeit stabiler als Flash-VEP17. Daher wurde PVEP verwendet, um die Integrität des retino-geniculo-kortikalen Weges bei nicht-menschlichen Primaten nachzuweisen.

  1. Tierpräparation
    1. Betäuben Sie den Affen mit Isofluran (1,5%-2%) nach Induktion mit Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, Tiletamin/Zolazepam).
    2. Positionieren Sie die sterilisierte Masseelektrode am Ohrläppchen. Führen Sie die sterilisierten Aktiv- und Referenzelektroden subkutan entlang der Mittellinie am Frontal- bzw. Okzipitalknochen ein.
    3. Tragen Sie ein Augenlidspekulum auf, um die bulbäre Bindehaut freizulegen.
    4. Verwenden Sie klebendes undurchsichtiges schwarzes Klebeband, um das kontralaterale Auge zu flicken.
  2. PVEP-Aufzeichnung
    1. Drücken Sie die Impedanztaste , um die Elektroden-Gewebe-Kontaktimpedanz zu überprüfen, und die Werte der Impedanz werden in jedem Kanal angezeigt. Stellen Sie sicher, dass es unter 10k Ω liegt. Wenn nicht, schließen Sie die Elektrode wieder an oder ersetzen Sie sie.
    2. Überprüfen Sie die Impedanzwerte im Impedanztestfenster und stellen Sie sicher, dass die Impedanz zwischen der aktiven elektroden und der Referenzelektrode um weniger als 1 kΩ voneinander abweicht, um elektrische Interferenzen zu reduzieren17.
    3. Drücken Sie die Oszillograph-Taste , um das Grundrauschen ohne Stimulation zu überprüfen.
      HINWEIS: Wenn ein großes Grundrauschen auftritt, trennen Sie alle anderen elektrischen Geräte im selben Raum und schalten Sie die Mobiltelefone aus. Wenn das Basisproblem weiterhin besteht, wiederholen Sie den PVEP-Test an einem anderen Tag.
    4. Zeichnen Sie pvEP-Antworten des ungepatchten Auges auf, indem Sie die Lichtintensität von 0,5 bzw. 1,0 Zyklus/Grad im weißen Hintergrundfeld in der oberen rechten Ecke auswählen und dann die Taste Untersuchung drücken.
      HINWEIS: Für jede Aufnahme werden 64 Spuren gemittelt, um eine Wellenform zu erhalten. Für jede Frequenz werden mindestens zwei Aufzeichnungen erfasst, um die Reproduzierbarkeit von PVEP-Signalen zu überprüfen.
    5. Wiederholen Sie den Vorgang für das kontralaterale Auge.
    6. Sobald Sie fertig sind, stellen Sie die Isofluranzufuhr ein, um den Affen zu wecken.
    7. Behandeln Sie den Affen nach Vollnarkose mit Gentamicin (4 mg/kg IM) und Ceftiofur-Natrium (2 mg/kg IM), um eine Infektion zu verhindern.
  3. PVEP-Messung und quantitative Analyse
    1. Wie in Abbildung 1B gezeigt, wurden die ersten negativen und positiven Peaks in der PVEP-Wellenform als N1 und P1 bezeichnet, die typischerweise bei etwa 50 und 90 ms auftreten. Die P1-Amplitude wird vom Tiefpunkt von N1 bis zum Peak von P1 gemessen.
    2. Verwenden Sie im Falle einer monokulären Verletzung einen interokularen Vergleich von Amplitude und impliziter Zeit, um die Intersessionsvariation zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu erhöhen17.

3. Muster ERG (PERG) bei Ziege

HINWEIS: In der vorherigen Studie wurde bei Ziegen kein interokulares Übersprechen des PERG-Signals beobachtet, so dass PERG-Reaktionen gleichzeitig von beiden Augen aufgezeichnet werden können9.

  1. Prüfungsvorbereitung
    1. Betäuben Sie die Ziege mit Xylazin (3 mg / kg, IM) und legen Sie sie auf einen Untersuchungstisch.
    2. Legen Sie einen Temperatursensor unter die Zunge der Ziege.
    3. Schließen Sie das Pulsoximeter an das proximale Ende des Ziegenohrs an.
    4. Binden Sie die Blutdruckmanschette an den Oberschenkel.
    5. Klemmen Sie die EKG-Clips an den Gliedmaßen entsprechend fest.
    6. Um die Elektrodenimpedanz zu reduzieren, legen Sie eine sterilisierte Schädelschraube auf den Frontalknochen und verbinden Sie sie mit einer Krokodilklemme mit der Bodenelektrode.
    7. Platzieren Sie zwei sterilisierte Nadelreferenzelektroden subkutan 1 cm hinter dem seitlichen Canthi auf beiden Seiten.
    8. Verwenden Sie das Augenlidspekulum, um die bulbäre Bindehaut freizulegen.
    9. Platzieren Sie zwei desinfizierte ERG-Jet-Aufnahmeelektroden nach topischer Anwendung eines künstlichen Risses in der Mitte der bilateralen Hornhaut.
    10. Stellen Sie zwei 47,6 cm x 26,8 cm große LED-Monitore mit einem Betrachtungsabstand von 50 cm vor beide Augen.
    11. Stellen Sie jeden Monitor so ein, dass er parallel zur Pupillenebene auf derselben Seite verläuft, und richten Sie die Mitte des Monitors an der Pupillenebene aus.
    12. Stellen Sie sicher, dass das kontrastumkehrende Schachbrett (zeitliche Frequenz, 2,4 Hz) auf beiden Monitoren angezeigt wird und ein maximales Seitenverhältnis von 4:3 aufweist, das durch die Geräteeinstellungen eingestellt wird.
    13. Stellen Sie sicher, dass der Kontrast zwischen weißen und schwarzen Karos 96% beträgt und die mittlere Leuchtdichte 200 cd/m2 (Candela pro Quadratmeter) beträgt, was durch den Leuchtdichtemesser überprüft wird.
      HINWEIS: Laut ISCEV ist beim Menschen eine mittlere photopische Leuchtdichte von 40-60 cd/m2 erforderlich17. In einer anderen Studie mit Mäusemodell blieb das Muster bei einer mittleren Leuchtdichte von 800 cd/m2,18. Für einen Standard-PERG-Test am Menschen wird eine Feldgröße von mindestens 15° in der engsten Dimension benötigt17. Stellen Sie die Position der Hornhautelektrode ein, wenn sie sich nicht in der Mitte der Hornhautoberfläche befindet.
  2. PERG-Aufzeichnung
    1. Dimmen Sie das Umgebungslicht und drücken Sie die Impedanztaste , um die Elektroden-Gewebe-Kontaktimpedanz zu überprüfen. Die Werte der Impedanz werden in jedem Kanal angezeigt.
    2. Überprüfen Sie die Impedanzwerte im Impedanztestfenster und stellen Sie sicher, dass die Impedanz unter 10 kΩ liegt. Wenn nicht, schließen Sie die Elektrode wieder an oder ersetzen Sie sie.
    3. Drücken Sie die Oscillograph-Taste , um das Grundrauschen ohne Lichtstimulation zu überprüfen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die zerbrechlichen ERG-Jet-Aufzeichnungselektroden zu schützen. Das Basisrauschen in PERG ist normalerweise kleiner als das in FVEP bei Ziegen.
    4. Starten Sie die PERG-Aufzeichnung von beiden Augen gleichzeitig mit den Raumfrequenzen von 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 und 12,6 Zyklen / Grad nacheinander. Für jede Ortsfrequenz werden 64 Spuren gemittelt, um eine Anzeige zu erhalten.
    5. Schalten Sie schließlich den Monitor aus, um PERG ohne visuellen Reiz als Negativkontrolle aufzuzeichnen.
      HINWEIS: PERG-Signale sind normalerweise stabil und müssen nicht wiederholt werden.
    6. Entfernen Sie die vordere Schädelschraube und wecken Sie die Ziege, indem Sie Idzoxan (1,5 mg/kg) injizieren, das ein Xylazin-Antagonist ist.
    7. Behandeln Sie die Ziege nach Vollnarkose mit Gentamicin (4 mg/kg IM) und Ceftiofur-Natrium (2 mg/kg IM), um eine Infektion zu verhindern.
  3. PERG-Messung und quantitative Analyse
    1. Stellen Sie den Bandpassfilter auf 1 bis 75 Hz ein. Für 3,0 cpd PERG ist der Bandpassfilter auf 1 bis 50 Hz eingestellt, um die Leiterbahn zu glätten, ohne ihre Amplitude zu beeinträchtigen.
    2. Wie in Abbildung 1C gezeigt, werden die ersten positiven und negativen Peaks in der Wellenform als P1 (typischerweise etwa 25 ms) und N1 (typischerweise etwa 55 ms) bezeichnet. Die PERG-Amplitude wird von N1 bis P1 gemessen.
    3. Im Falle einer monokulären Verletzung verwenden wir den interokularen Vergleich von Amplitude und impliziter Zeit, um die Intersessionsvariation zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu reduzieren17.

4. PERG bei Rhesusaffen

HINWEIS: Es ist unklar, ob es ein interokulares Übersprechen des PERG-Signals im Rhesusaffen gibt, so dass PERG-Reaktionen von beiden Augen separat aufgezeichnet werden.

  1. Prüfungsvorbereitung
    1. Betäuben Sie den Affen mit Isofluran (1,5%-2%) nach Injektion von Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, Tiletamin/Zolazepam) und Trachealintubation.
    2. Legen Sie eine sterilisierte Bodenelektrode subkutan auf den Frontalknochen. Führen Sie eine sterilisierte Nadelreferenzelektrode subkutan ein, 1 cm hinter dem seitlichen Canthus auf der gleichen Seite.
    3. Legen Sie nach topischer Anwendung des künstlichen Risses eine desinfizierte ERG-Jet-Aufnahmeelektrode auf die zentrale Hornhaut.
      HINWEIS: Stellen Sie die Position der Hornhautelektrode ein, wenn sie sich nicht in der Mitte der Hornhautoberfläche befindet.
    4. Verwenden Sie selbstklebendes undurchsichtiges schwarzes Klebeband, um ein Auge zu flicken.
    5. Stellen Sie einen Monitor (47,6 x 26,8 cm) in einem Betrachtungsabstand von 50 cm auf.
    6. Stellen Sie sicher, dass der Monitor so eingestellt ist, dass er parallel zur Pupillenebene verläuft. Richten Sie die Mitte des Monitors an der Pupillenebene aus.
    7. Stellen Sie sicher, dass sich das Schwarz-Weiß-Schachbrett mit einer Frequenz von 2,4 Hz umkehrt und das Seitenverhältnis 4:3 beträgt, das durch die Geräteeinstellungen festgelegt wird.
    8. Stellen Sie sicher, dass der Kontrast zwischen den weißen und schwarzen Prüfern 96% beträgt und die gemittelte Leuchtdichte 200 cd/m2 beträgt, was durch die Leuchtdichteanzeige überprüft wird.
  2. PERG-Aufzeichnung
    1. Dimmen Sie das Umgebungslicht und überprüfen Sie die Elektroden-Gewebe-Kontaktimpedanz.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Impedanz unter 10 kΩ liegt. Wenn nicht, schließen Sie die Elektrode wieder an oder ersetzen Sie sie.
    3. Überprüfen Sie das Grundrauschen ohne Lichtstimulation.
    4. Flicken Sie ein Auge und starten Sie die PERG-Aufzeichnung vom anderen Auge aus bei Raumfrequenzen von 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 und 12,6 Zyklen / Grad nacheinander.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1-4.2.4 für das kontralaterale Auge.
    6. Stoppen Sie die Isofluranversorgung, um den Affen zu erwecken.
    7. Behandeln Sie den Affen nach Vollnarkose mit Gentamicin (4 mg/kg IM) und Ceftiofur-Natrium (2 mg/kg IM), um eine Infektion zu verhindern.
  3. PERG-Messung und quantitative Analyse
    1. Wie in Abbildung 1D gezeigt, werden die ersten positiven und negativen Peaks in der Wellenform als P1 (typischerweise etwa 40 ms) und N1 (typischerweise etwa 85 ms) bezeichnet. Die PERG-Amplitude wird von N1 bis P1 gemessen.
    2. Im Falle einer monokulären Verletzung verwenden wir den interokularen Vergleich von Amplitude und impliziter Zeit, um die Variation zwischen den Volumina zu reduzieren und die Empfindlichkeit zu erhöhen17.

5. OCT bei Ziege

  1. Tierpräparation
    1. Anästhesieren Sie die Ziege mit Xylazin (3 mg / kg, IM) und intubieren Sie dann.
    2. Erweitern Sie die Pupille durch topische Verabreichung von mydriatischen Augentropfen mit Tropicamid (5%) und Phenylephrin (5%).
    3. Verwenden Sie das Augenlidspekulum, um die Pupille vollständig freizulegen.
    4. Legen Sie den Kopf der Ziege auf die Kinnstütze.
      HINWEIS: Obwohl keine Gasanästhesie durchgeführt wird, intubieren Sie die Ziege regelmäßig, um die Atemwege vor der Kompression durch die Kinnstütze zu schützen.
  2. OCT-Bildgebung
    HINWEIS: Die retinale OCT-Bildgebung wird in dieser Studie mit dem OCT-System bei einer Wellenlänge von 870 nm durchgeführt. Die optische axiale Auflösung des OCT-Scanners beträgt 12 μm. Der kreisförmige Scanmodus wird verwendet, um den Sehnervenkopf (ONH) mit hochauflösendem Modus zu scannen. 100 Bilder werden gemittelt, um die Bildqualität zu optimieren. Der detaillierte Schulungsleitfaden ist online verfügbar (siehe Materialtabelle).
    1. Anfängliches OAT-Scannen (Baseline-Prüfung)
      1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um die Erkennungsschnittstelle aufzurufen. Warten Sie, bis das Gerät fertig geladen ist, und drücken Sie dann die gelbe Starttaste, um die Bildgebung zu starten.
      2. Richten Sie die Ziege mit der Infrarotkamera aus, um das ONH im konfokalen Bild der Scanning Laser Ophthalmoscopy (cSLO) zu zentrieren, indem Sie ihre Kopfposition ändern.
      3. Stellen Sie den Joystick so ein, dass das gesamte Infrarotbild gleichmäßig ausgeleuchtet wird, um die Bildqualität zu verbessern.
      4. Bewegen Sie den Joystick nach vorne, bis ein aufrechtes retinales OCT-Bild auf dem aufrechten Bildschirm angezeigt wird.
      5. Ändern Sie den Joystick so, dass er ein gleichmäßig dichtes und horizontal platziertes retinales OCT-Bild erhält.
      6. Drücken Sie die Taste am Joystick, um das Bild automatisch aufzunehmen, und halten Sie den Joystick gedrückt, um die Bildqualität auf dem Livebildbildschirm beizubehalten, bis die Bildaufnahme abgeschlossen ist. Drücken Sie dann auf Erwerben.
      7. Wecken Sie die Ziege durch Injektion von Idzoxan (1,5 mg/kg), einem Xylazin-Antagonisten.
        HINWEIS: Die Zentrierung des ONH in der Baseline-Untersuchung hilft, den Baseline-Scan und den Follow-up-Scan entsprechend unserer Erfahrung auszurichten.
    2. Follow-up-OCT-Scans
      1. Wählen Sie ein hochwertiges OCT-Ausgangsbild aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Referenz festlegen aus.
      2. Initiieren Sie die OCT-Bildgebung wie oben erwähnt.
      3. Drücken Sie die Nachverfolgungstaste , um die automatische Übereinstimmung des aktuellen Scans mit dem Referenzscan zuzulassen.
      4. Drücken Sie nach dem Abgleich (der kreisförmige Scanring wird grün) die Taste am Joystick, um das automatische Echtzeit-Tracking zu aktivieren.
      5. Wecken Sie die Ziege durch Injektion von Idzoxan (1,5 mg/kg), einem Xylazin-Antagonisten.
        HINWEIS: Um den Prozess des Matchings zu erleichtern, (1) bewegen Sie das ONH im Live-Fenster, indem Sie den Kopf entsprechend drehen, oder (2) drehen Sie das ONH im Live-Fenster, indem Sie den Kopf neigen, damit das aktuelle cSLO-Bild dem Basislinienbild ähnlicher erscheint. Dieser vestibulo-okuläre Reflex wirkt gut unter Xylazin-Anästhesie19.
  3. OCT-Messung
    1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Messung , um das Messfenster aufzurufen.
    2. Wählen Sie das Radiergummi-Werkzeug und löschen Sie die RNFL-Linie, die vom Programm automatisch beschriftet wird.
    3. Wählen Sie das Linienzeichnungswerkzeug , um die Berandung zwischen IPL und INL manuell zu umreißen (Abbildung 2).
      HINWEIS: Die GCC-Dicke in sechs peripapillaren Regionen (T, TS, TI, N, NS, NI) und die gemittelte GCC-Dicke um das ONH (G) können auf dem Bildschirm abgelesen werden (Abbildung 2). Der Schülertest, die Einweg-ANOVA oder die Zwei-Wege-ANOVA können verwendet werden, um die OCT-Daten im Falle einer Normalverteilung zu quantifizieren.

6. OCT bei Rhesusaffen

  1. Führen Sie eine retinale OCT-Bildgebung bei Rhesusaffen mit der gleichen Ausrüstung und dem gleichen Verfahren durch wie bei ziegen.

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Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt repräsentative Ergebnisse von FVEP bei Ziegen. Obwohl die Wellenformen bei gleicher Blitzintensität eine relative Ähnlichkeit aufweisen, empfehlen wir dennoch, die Wellenformen zweimal zu untersuchen. Elektromagnetische Wellen, die von elektronischen Geräten erzeugt werden, stören die gesammelten elektrischen Signale, was zu einem hohen Grundlinienrauschen und einer schlechten Wiederholbarkeit der Wellenform führt. Daher wird empfohlen, sicherzustellen, dass während der el...

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Diskussion

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll von VEP, PERG und OCT bei Ziegen und Rhesusaffen vor. Diese In-vivo-Methoden können in großen Tiermodellen verschiedener Optikusneuropathien wie Glaukom, ischämische oder traumatische Optikusneuropathie und Optikusneuritis9 angewendet werden.

PVEP ist stabiler und empfindlicher als FVEP17; es kann jedoch nicht in Ziege9 ausgelöst werden. Daher wird FVEP bei Ziegen und PVE...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch die folgenden Zuschüsse finanziert: National Key R&D Program of China (2021YFA1101200); Medizinisches Forschungsprojekt von Wenzhou (Y20170188), National Key R&D Program of China (2016YFC1101200); Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (81770926;81800842); Wichtiges F&E-Programm der Provinz Zhejiang (2018C03G2090634); und Key R&D Program des Wenzhou Eye Hospital (YNZD1201902). Der Sponsor oder die Förderorganisation hatte keine Rolle bei der Gestaltung oder Durchführung dieser Forschung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
47,6 x 26,8 cm große MonitoreDELL Inc.E2216HVDie visuellen Reize der Kontrastumkehr schwarz-weiß Schachbrettmuster wurden auf Bildschirmen
6,0 mm TrachealtubusHenan Tuoren Medical Device Co., LtdPVC 6.0sicherstellen die
Atemwege Alligator Clip
AtropinGuangdong Jieyang Longyang Animal Pharmaceutical Co., Ltd.reduzieren die Bronchialsekretion und schützen das Herz vor der Aktivierung des Vagusnervs
Carbomer Eye GelFabrik GmbH Tochtergesellschaft von Bausch & LombBefeuchten Sie die Hornhaut und stabilisieren Sie die Aufzeichnungselektroden
ERG-Jet AufzeichnungselektrodenRoland Consult Stasche& Finger GmbH2300 La Chaux-De-FondsERG Aufzeichnung
AugenspekulumShanghai Jinzhong Medical Device Co., LtdZYD020offene Lidfissur
Heidelberg Spectralis OCT SystemHeidelberg EngineeringOCT System
Bildgebung https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
IsofluranRWD Life Science Co., LtdR510-22Isofluran-Anästhesie
männliche Saanen-ZiegenCaimu Livestock Company, Land (Hangzhou, China)Die männlichen Saanen-Ziegen im Alter von 4 bis 6 Monaten mit einem Gewicht von 19– 23 kg
NadelelektrodeRoland Consult Stasche& Finger GmbHU51-426-G-DVerwendung für FVEP-Erdungselektrode und PERR-Referenzelektroden
peripherer Venenkatheter intravenösBD Shanghai Medical Device Co., Ltd383019intravenöser Zugang für Atropin und Propofol
PropofolXian Lipont Enterprise Union Management Co., Ltd.Induktion der Isofluran-Anästhesie bei Ziegen
Tropicamid Phenylephrin AugentropfenSANTEN OY, Japan5% Tropicamid und 5% Phenylephrin Hydrochlorid
visuelle Elektrophysiologie GerätGotec Co., LtdGT-2008V-IIIVerwendung für FVEP & Verifizierter
XylazinHuamu Tiergesundheitsprodukte Co., Ltd.Xylazin-Anästhesie: Intramuskuläre Injektion von Xylazin 3 mg/kg
Zoletil50Virbacinduziert Isofluran-Anästhesie bei Affen
(Lieferant - PERG

Referenzen

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Retinale Ganglienzellenvisuell evoziertes PotenzialMuster Elektroretinogrammoptische Koh renztomografieGro tiermodelleSehnervensch digungRhesusaffeZiegenmodellOptikusneuropathie

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