Methodenartikel

Analyse von oxidativem Stress in murinen Darmorganoiden mit reaktiver Sauerstoffspezies-sensitiver fluorogener Sonde

DOI:

10.3791/62880

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17. September 2021

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1Molecular Microbial Pathogenesis Unit, Institut Pasteur, 2Chaire de Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Institut de Biologie Paris Seine (IBPS) - Developmental Biology Unit, Sorbonne Université, CNRS UMR7622, INSERM U1156, 4Molecular Radiotherapy, INSERM U1030, Gustave Roussy, Université Paris-Saclay, 5The Center for Microbes, Development and Health, Institut Pasteur Shanghai and Chinese Academy of Sciences, 6Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zum Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den intestinalen murinen Organoiden unter Verwendung qualitativer Bildgebung und quantitativer Zytometrie-Assays. Diese Arbeit kann möglicherweise auf andere fluoreszierende Sonden ausgedehnt werden, um die Wirkung ausgewählter Verbindungen auf ROS zu testen.

Zusammenfassung

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Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wesentliche Rolle bei der intestinalen Homöostase. ROS sind natürliche Nebenprodukte des Zellstoffwechsels. Sie werden als Reaktion auf Infektionen oder Verletzungen auf Schleimhautebene produziert, da sie an antimikrobiellen Reaktionen und Wundheilung beteiligt sind. Sie sind auch kritische sekundäre Botenstoffe, die mehrere Wege regulieren, einschließlich Zellwachstum und -differenzierung. Auf der anderen Seite führen übermäßige ROS-Spiegel zu oxidativem Stress, der für Zellen schädlich sein kann und Darmerkrankungen wie chronische Entzündungen oder Krebs begünstigt. Diese Arbeit bietet eine einfache Methode zum Nachweis von ROS in den murinen Organoiden des Darms durch Live-Bildgebung und Durchflusszytometrie unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen fluorogenen Sonde. Hier beschreibt das Protokoll die Untersuchung der Wirkung von Verbindungen, die das Redoxgleichgewicht in Darmorganoiden modulieren und ROS-Spiegel in bestimmten Darmzelltypen nachweisen, veranschaulicht hier durch die Analyse der mit GFP genetisch markierten Darmstammzellen. Dieses Protokoll kann mit anderen Fluoreszenzsonden verwendet werden.

Einleitung

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Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind natürliche Nebenprodukte des Zellstoffwechsels. Sie können auch aktiv durch spezialisierte enzymatische Komplexe wie die membrangebundenen NADPH-Oxidasen (NOX) und Dual-Oxidasen (DUOX) hergestellt werden, die Superoxidanion und Wasserstoffperoxid1 erzeugen. Durch die Expression von antioxidativen Enzymen und ROS-Aasfressern können Zellen ihr Redoxgleichgewicht fein abstimmen und so die Gewebehomöostase schützen2. Obwohl ROS für die Zellen hochgiftig sein und DNA, Proteine und Lipide schädigen kann, sind sie entscheidende Signalmoleküle2. Im Darmepithel sind mo....

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden nach Genehmigung durch das Verwendungskomitee des Institut Pasteur und durch das französische Landwirtschaftsministerium Nr. 2016-0022 durchgeführt. Alle Schritte werden in einer Gewebekulturhaube durchgeführt.

1. Herstellung von Reagenzien und Materialien zur Kultivierung von Darmorganoiden

  1. Zur Herstellung des Wachstumskulturmediums mischen Sie fortgeschrittenes DMEM/F-12, ergänzt mit 1x Glutamin, 1x Penicillin/Streptomycin (P/S)-Lösung, 10 mM HEPES, 50 ng/ml murinem EGF, 20 μg/ml murinem Noggin 500 ng/ml Maus R-Spondin1 (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Medium während der Extraktio....

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Ergebnisse

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Als Proof of Concept des beschriebenen Protokolls wurden die aus der Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 Mauslinie gewonnenen Krypten verwendet, in denen Darmstammzellen eine von Barker et al. etablierte Mosaik-GFP-Expression aufweisen, um Darmstammzellen10 zunächst zu charakterisieren und diese Zellen anhand ihrer GFP-Expression abzubilden. Dabei wird ein Modell bereitgestellt, um die ROS-Spiegel in einer bestimmten Zelltyppopulation bei verschiedenen Behandlungen zu vergleichen. Ein ROS-Inhibitor (NAC) wurde.......

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Diskussion

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Diese Arbeit bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Isolierung muriner Jejunalkrypten, zur Kultivierung zu 3D-Organoiden und zur Analyse von ROS in Organoiden durch Kombination einer ROS-empfindlichen fluorogenen Sonde mit qualitativer Mikroskopiebildgebung ganzer Organoide und quantitativer ROS-Messung mittels Durchflusszytometrie an einzelnen Zellen nach Organoiddissoziation.

Der erste kritische Schritt in dieser Methode ist das Extraktionsverfahren für Krypten. In der Tat ist die Qual.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss 17-CE14-0022 (i-Stress) der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) unterstützt.

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Materialien

Growth culture medium

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Mäuse
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)The Jackson Laboratory
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)ThermoFisher12634010
B-27 Supplement, minus Vitamin AThermoFisher12587010Stammkonzentration: 50x
GlutaMAX (glutamin)ThermoFisher35050038Stammkonzentration: 100x
HepesThermoFisher15630056Stammkonzentration: 1 M
Maus EGFR& D2028-EG-200Bestandskonzentration: 500 & Mikro; g/mL in PBS
murine NogginR& D1967-NG/CFBestandskonzentration: 100 & Mikro; g/ml in PBS
Murine R-Spondin1R& D3474-RS-050Bestandskonzentration: 50 & Mikro; g/ml in PBS
N-2 SupplementThermoFisher17502048Stammkonzentration: 100x
Penicillin-Streptomycin (P/S)ThermoFisher15140122Stammkonzentration: 100x (10.000 Einheiten/ml Penicillin und 10.000 &; Mikro; g/mL Streptomycin)
Material
70 µ m cell SiebCorning352350
96-Well-Schere mit rundem BodenCorning3799
KugelschereFine Science Tools GMBH14086-09
CellROX® Tiefrotes ReagenzThermoFisherC10422
DAPI (4',6-diamidino-2-phé Nylindol, Dichlorhydrat) (fluorgene Sonde)ThermoFisherD1306Bestand bei 10 mg/mL
DPBS 1x kein Calcium kein Magnesium (DPBS)ThermoFisher14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM kein Phenolrot)ThermoFisherA1896701
Hoechst 33342ThermoFisherH3570Bestand bei 10 mg/mL
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)Corning356231nach dem Auftauen im Kühlschrank 1 Stunde auf Eis aufbewahren und 500 mL Aliquots herstellen und bei -20 & Grad lagern; C
µ-Slide 8 Well ChambersIbidi80826
N-Acetylcystein (NAC)SigmaA9165
tert-Butylhydroperoxid (tBCHP)Lösung (70% Gew. In H2O2)Sigma458139
TrypLE Express Enzym (1X), kein Phenolrot (trypsin)ThermoFisher12604013
UltraPure 0,5 M EDTA, pH8,0ThermoFisher15575020
Y-27632SigmaY0503Gesteinsinhibitor zur Minimierung des Zelltods bei Gewebedissoziation
Programme und AusrüstungAttune
NxT (Durchflusszytometer)ThermoFischerDurchflusszytometer-Analysator
Fidschi/ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsBilderzeugung
FlowJoBD BioscienceFACS-Analyse
Observer.Z1Zeisskonfokales System
Opterra (Swept-Field-Konfokal)Brukerkonfokales System
Hochgeschwindigkeits-EMCCD-Kamera Evolve Delta 512Photometrischeskonfokales System
PrismGraphPad Softwarestatistische Analyse

Referenzen

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  1. Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
  2. Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequence....

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Schlagwörter

Murine OrganoideDurchflusszytometrieKonfokalmikroskopieOrganoidkulturStammzellanalyseLive Imaging

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