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Methodenartikel

Nagetier-Östruszyklus-Überwachung mit vaginaler Lavage: So etwas wie ein normaler Zyklus nicht

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DOI:

10.3791/62884

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30. August 2021

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1Department of Neurosurgery, Brain Injury Research Center, UCLA, David Geffen School of Medicine, 2Department of Psychology, Pepperdine University, Seaver College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt die entscheidenden Faktoren, die bei experimentellen Designs mit weiblichen Ratten zu berücksichtigen sind. Im weiteren Sinne dienen diese Daten dazu, die Stigmatisierung zu verringern und die Entwicklung umfassenderer Diagnose- und Interventionsinstrumente zu unterstützen.

Zusammenfassung

Die aktuelle Methodik etabliert einen reproduzierbaren, standardisierten und kostengünstigen Ansatz zur Überwachung des Östruszyklus weiblicher Sprague Dawley (SD) heranwachsender Ratten. Diese Studie zeigt die Komplexität der Hormonzyklen und das breite Spektrum des Verständnisses, das erforderlich ist, um eine zuverlässige und valide Überwachungstechnik zu konstruieren. Durch eine eingehende Untersuchung der wichtigsten experimentellen Design- und Verfahrenselemente bietet diese Beschreibung des Zyklus und seiner Grundprinzipien einen Rahmen für das weitere Verständnis und dekonstruiert Missverständnisse für die zukünftige Replikation.

Zusammen mit einem Überblick über den Probenentnahmeprozess unter Verwendung von vaginaler Lavage beschreibt das Verfahren den Mechanismus der Datenkategorisierung in das vierstufige Modell von Proestrus, Östrus, Metestrus und Diestrus. Diese Stadien sind durch einen neuen vorgeschlagenen Ansatz gekennzeichnet, der die 4 kategorisierenden Determinanten des vaginalen Flüssigkeitszustands, des Zelltyps (der vorhandenen Zelltypen), der Zellanordnung und der Zellmenge zum Zeitpunkt der Sammlung verwendet. Variationen jeder Stufe, günstige und ungünstige Stichproben, die Unterscheidung zwischen Zyklizität und Azyklizität sowie grafische Darstellungen der gesammelten Kategorisierungskomponenten werden neben effektiven Interpretations- und Organisationspraktiken der Daten präsentiert. Insgesamt ermöglichen diese Tools erstmals die Veröffentlichung quantifizierbarer Datenbereiche, was zur Standardisierung von Kategorisierungsfaktoren bei der Replikation führt.

Einleitung

Neue Beiträge
Der Östruszyklus von Nagetieren wurde als wesentlicher Indikator für das Wohlbefinden identifiziert. Unbewusste Vorurteile der Forscher und ungenaue Interpretationen in Bezug auf den weiblichen Körper behindern jedoch die wissenschaftliche Gemeinschaft. Die Etymologie des Wortes "Östrus" impliziert ein Gefühl von Minderwertigkeit und Negativität. Euripides benutzte den Begriff, um eine "Raserei" oder einen Wahnsinn zu beschreiben, Homer, um Panik zu beschreiben, und Platon, um einen irrationalen Antrieb zu beschreiben. Diese Studie zeigt, wie diese urzeitlichen Perspektiven die aktuelle wissenschaftliche Gemeinschaft beeinflussen, und adressiert diese Bedenken durch ein neuartiges Mosaikparadigma - eine aktualisierte Kombination zuvor untersuchter Methoden, die im Rahmen eines umfassenderen Ansatzes erweitert wurde.

Das Studium und die Verwendung dieser Technik sind erstens notwendig, da es keine standardisierte und umfassende Überwachungstechnik gibt und die Dateninterpretationspraktiken unklar sein können. Zweitens, obwohl die Merkmale des Östruszyklus von einzelnen untersuchten Ratten abhängen, sind sie oft universellisiert. Drittens, während hormonelle Zyklen routinemäßige und nützliche Prozesse sind, sind sie von einem gefährlichen Stigma umgeben, das im Abschnitt "Übersetzung an den Menschen" untersucht wird. Diese Studie zielt darauf ab, diese drei Probleme auf drei Arten anzugehen: (A) durch die Beschreibung einer eingehenden Östruszyklusüberwachungstechnik und die Klärung, wie die Ergebnisse interpretiert werden können, (B) durch die Skizzierung von Methoden, die die Integrität und Individualität jedes Zyklus aufrechterhalten, und (C) durch die Aufmerksamkeit auf Missverständnisse, die unbegründete Praktiken aufrechterhalten.

Diese Studie ist auch einzigartig in ihrem Fokus auf jugendliche Ratten, eine Periode, die durch entscheidende Entwicklungsveränderungen gekennzeichnet ist, die Licht auf verschiedene verhaltensbezogene, anatomische und physiologische Manifestationen im Erwachsenenalterwerfen 1. Der Aufbau eines standardisierten experimentellen Designs zur Überwachung der Hormonzyklen in einer wenig erforschten Population bei gleichzeitiger Dekonstruktion gemeinsamer Verzerrungen ermöglicht die Entwicklung zuverlässiger und gültiger hormoneller Korrelationen 2,3,4 und die Bestimmung zustandsabhängiger Zyklusstörungen 5,6,7,8,9,10 . Letztendlich dienen diese Neuheiten dazu, diagnostische Kriterien, Behandlungen und Interventionen verschiedener Wellness-Anliegen zu erweitern.

Grundlegende Definitionen und Verwendungen
Der Östruszyklus ist eine Sammlung dynamischer physiologischer Prozesse, die als Reaktion auf die drei oszillierenden weiblichen Sexualsteroidhormone auftreten: Östradiol, leuteinisierendes Hormon (LH) und Progesteron (Abbildung 1A, B). Wechselwirkungen zwischen dem endokrinen und dem zentralen Nervensystem regulieren den Zyklus, der meistens 4-5 Tage anhält und vom Beginn der sexuellen Reifung bis zur reproduktiven Seneszenz und / oder Beendigung wiederkehrt. Es ist in separate Kategorien unterteilt, die auf dem Hormonspiegel basieren - am häufigsten in die 4 Stadien von Diestrus (DIE), Proestrus (PRO), Estrus (EST) und Metestrus (MET), die kreisförmig verlaufen. Die Anzahl der Divisionen kann je nach Art der Studie 13 zwischen 3 Stufen11 und13 Stufen12 liegen. Die geringere Anzahl von Abteilungen schließt MET oft als Phase aus und klassifiziert es als eine kurze Übergangsperiode. Die höhere Zahl umfasst typischerweise Unterabschnitte, die eine genauere Untersuchung von Phänomenen wie Tumorentwicklung oder spontaner Pseudoschwangerschaft, dem physiologischen Zustand der Schwangerschaft ohne embryonale Implantation 12,14,15, ermöglichen.

In dieser Studie wurden die Stadien durch Komponenten des Vaginalkanals identifiziert, die als 3 kategorisierende Determinanten - Zelltyp (n), Zellanordnung und Zellmenge bezeichnet werden (Abbildung 2A-D). Während der Zustand der Vaginalflüssigkeit in dieser Studie nicht überwacht wurde, wird empfohlen, sie als vierte kategorisierende Komponente einzubeziehen. Weitere Informationen zur Untersuchung der Vaginalflüssigkeit finden Sie in der Referenzliste16. Die kategorisierenden Komponenten können untersucht werden, indem Zellen über vaginale Lavage extrahiert werden, die primäre Technik, die in der modernen Überwachung des Östruszyklus empfohlen wird. Während die eingehenden physiologischen Prozesse innerhalb jeder Phase außerhalb des Rahmens dieser Studie liegen, finden Sie weitere Informationen in der Literatur17.

Die Verwendung und Weiterentwicklung dieser Überwachungstechnik des Östruszyklus beruht auf den Verbindungen zwischen Sexualsteroidhormonen und der Funktion von Körpersystemen wie dem Herz-Kreislauf-System18, dem endokrinen System8 und dem zentralen Nervensystem 19,20,21. Gleichzeitig ist eine Überwachung des Östruszyklus möglicherweise nicht immer erforderlich, wenn weibliche Nagetiere beteiligt sind 22,23,24,25. Vielmehr ist es wichtig zunächst zu prüfen, ob in dem spezifischen Studienbereich geschlechtsspezifische Unterschiede berichtet wurden, die in veröffentlichten Reviews22,23 weiter untersucht werden können. Obwohl die Überwachung des Östruszyklus in einem breiten Spektrum von Forschungsuntersuchungen von entscheidender Bedeutung ist, sollte sie nicht als Hindernis für die Einbeziehung weiblicher Nagetiere in Experimente angesehen werden. Während diese Technik komplex und zeitaufwendig erscheinen mag, kann das Verfahren selbst je nach Prüfer weniger als 15 Minuten dauern und ist kostengünstig. Insgesamt ist die Einbeziehung weiblicher Nagetiere in wissenschaftliche Studien vorteilhaft für das Verständnis von Körpersystemen, verschiedenen Zuständen und Pathologien sowie für das allgemeine Wohlbefinden, da diese Entwicklungen hauptsächlich auf der männlichen Körpervorlage basieren.

Universelle Parameter und natürliche Variabilitäten beim Nagetier
Die Festlegung von Bereichen für Aspekte, die als "typisch" angesehen werden, ist notwendig, um Standardzyklusmuster zu definieren, Parameter für vergleichende und analytische Zwecke festzulegen und Anomalien und Ausreißer zu erkennen. Gleichzeitig ist es auch wichtig zu erkennen, dass der Zyklus jeder Ratte einzigartig ist und Abweichungen aufgrund von Tierstamm, physiologischen Prozessen und Umweltbedingungen erwartet werden. Tatsächlich ist einer der "normalsten" Aspekte des Östruszyklus die Variabilität. Dies zeigt sich in der Gesamtzykluslänge mit einem Bereich von 3-38 Tagen26,27; das Alter der sexuellen Reifung, das von 32-34 Tagen bis zu mehreren Wochenreichen kann 28,29,30; was als azyklisch 11 und die kategorisierenden Determinantenmusterals 11,13 gilt. Insgesamt gibt es keine universelle Vorlage für den Östruszyklus, und dies sowohl für die wissenschaftliche Gemeinschaft als auch für die breite Öffentlichkeit zu übersetzen, ist ein wichtiger Teil des experimentellen Prozesses.

Experimentelle Zeitpunkte und Entwicklungsalter
Die Anerkennung dieses Variabilitätsprinzips hilft beim Aufbau eines zuverlässigen und gültigen Versuchsdesigns. Zum Beispiel hängt der Beginn der Überwachung des Östruszyklus von der anatomischen und physiologischen Entwicklung der Ratten ab, die je nach Umwelt- und physiologischen Faktoren variiert. Die Überwachung kann erst mit der Entwicklung der Vaginalöffnung (VO) beginnen, bei der es sich um die äußere Vaginalöffnung handelt, die von der Vulva umgeben ist und zum inneren Teil des Vaginalkanals führt (Abbildung 3A-D). Während sich die VO oft im Alter zwischen 32 und 34 Tagen vollständig entwickelt, bleibt sie für jedes Subjekt individualisiert, und vieles über den Prozess bleibt unbekannt. Diese Öffnung wurde verwendet, um den Beginn der Geschlechtsreifung zu identifizieren, der mit dem Anstieg vonÖstradiol 31, der Reifung der Hypothalamus-Hypophysen-Ovarialachse 32 und dem ersten Eisprung bei Ratten 17,33,34,35 in Verbindung gebracht wurde. Neuere Veröffentlichungen haben jedoch ergeben, dass es nur ein indirekter Marker für die reproduktive Entwicklung ist, da es sich von hormonellen und entwicklungsbedingten Ereignissen in ungünstigen Umgebungen entkoppelnkann 31 und Veränderungen des Östradiolspiegels anstelle der sexuellen Reifung darstellenkann 33. Daher wird empfohlen, sich nicht nur auf die VO zu verlassen, um das Entwicklungsalter zu bestimmen und als Qualifikator für die Überwachung des Östruszyklus36 zu verwenden, sondern auch das Auftreten des ersten EST-Stadiums und die Verhornung derEpithelzellen 30 zu nutzen, um den Beginn der sexuellen Reifung zu markieren.

Das Körpergewicht korreliert bei Nagetieren30,37 Jahren deutlich mit dem Entwicklungsalter während der Adoleszenzzeit und kann daher auch bei der Bestimmung des Entwicklungsalters in diesem Zeitraum helfen. Zu den vorgeschlagenen Mechanismen im Zusammenhang mit diesem Phänomen gehören die Stimulation von Hormonen, die für die Fortpflanzungsentwicklung notwendig sind, wie Wachstumshormon, und die Hemmung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse (HPA) durch den AppetitregulatorLeptin 30. Es wird jedoch nicht empfohlen, dieses Maß als einzigen Indikator für das Entwicklungsalter zu verwenden, da die Varianz zwischen Ratten zwischen den Arten und den Anbieterngroß ist 38. Die Variabilität, die bei der Entwicklung der VO und des Körpergewichts beobachtet wurde, veranschaulicht die Bedeutung des Konzepts im gesamten experimentellen Prozess.

Übersetzung an den Menschen: kulturelle und wissenschaftliche Kontexte
Die translationale Beziehung von Tier-zu-Mensch-Fortpflanzungsstudien ist bidirektional. Die Ergebnisse tierbasierter Studien beeinflussen, wie die menschlichen Prozesse bewertet, angegangen und analysiertwerden 39. Die Wahrnehmung des menschlichen Fortpflanzungssystems und der damit verbundenen Prozesse beeinflussen, wie Tiere untersucht werden. Tatsächlich ist einer der lautesten Hinweise auf weitere Forschung in diesem Bereich auf voreingenommene soziokulturelle Überzeugungen im Zusammenhang mit hormonellen Zyklen, die den wissenschaftlichen Prozess beeinflussen. Viele dieser Konventionen leiten sich aus einer allgemeinen kulturellen Abneigung gegen die Diskussion über die Menstruation ab, die zu einer Datenlücke in gut fundiertem Wissen geführthat 40,41. Dies hat ein Spektrum von Konsequenzen, die von geringfügig bis tödlich reichen - von Regalhöhe und Smartphone-Größe bis hin zu Polizei-Körperpanzeranpassung und verpassten Krebsdiagnosen42.

Die Beschreibung der Menstruation als unhygienisch, destruktiv und toxisch - gesehen in verehrten Texten, Medien, Wörterbüchern und medizinischen Lehren - wird von wissenschaftlichen Publikationen konserviert. Dies geschieht durch ungenaue und voreingenommene Beschreibungen von Hormonzyklen, die Isolierung des Fortpflanzungssystems von seinen neuroendokrinen Gegenstücken und Umwelteinflüssen und die reduktionistische Perspektive der Vollendung eines Zyklus als "Versagen der Empfängnis"43,44. Dies führt zur Schaffung unsolider experimenteller Praktiken, wie dem Weglassen externer Variablen, die hormonelle Zyklen beeinflussen, der Bestimmung von Start und Endpunkten, die ausschließlich auf anatomischen Entwicklungen basieren, und der Messung des Zyklusfortschritts in linearer und nicht zirkulärer Weise. Trotz der direkten Korrelation zwischen soziokulturellen Faktoren und biologischen Konsequenzen wird sie in der wissenschaftlichen Literatur nicht oft berücksichtigt. Durch die Inspektion ganzheitlicherer Publikationen43,44,45 können Forscher diese Stigmata dekonstruieren und zuverlässigere und validere experimentelle Designs erstellen.

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Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Handhabungs- und Verfahrensmethoden stimmen mit den Tierpflege- und Verwendungsrichtlinien der National Institutes of Health (NIH) überein und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Pepperdine University und dem Animal Research Committee (ARC) des UCLA-Kanzlers genehmigt.

1. Tierpflege und -verwendung

  1. Erwerben Sie weibliche Ratten in Zahlen gemäß der Leistungsanalyse und männliche Ratten, um den Whitten-Effekt oder ein konsistenteres Radfahrenzu fördern 46. Bestimmen Sie die Dehnung basierend auf dem Ziel der Studie in bekannten Datenbanken47.
    HINWEIS: Die aktuellen Daten spiegeln die des weiblichen SD International Genetic Standardization Program (IGS) in Anwesenheit von männlichen SD-Ratten wider, die sich sowohl an der Pepperdine University als auch an den UCLA-Labors im Rahmen einer gemeinsamen Studie befinden. Diese Ratten kamen im Alter von 28 Tagen in getrennten Gruppen an, und die Progression des Brunstzyklus wurde entweder für 10 oder 20 Tage überwacht, um Unterschiede auf akuten und chronischen Ebenen zu zeigen, beginnend im Alter von 34 Tagen (nach einer 7-tägigen Akklimatisierungsphase).
  2. Planen Sie vor der Handhabung eine Quarantäne und/oder eine Eingewöhnungsphase zur physiologischen Stabilisierung nach dem Transport und der Anpassung an die neue Umgebung ein.
    HINWEIS: Es wurde ein Mindestzeitraum von 3 Tagen angegeben, wobei ein Zeitraum von 7 Tagenempfohlen wird 48,49,50,51,52. Insgesamt hängt dies von den Transportbedingungen, der Tierbelastung und den Studienzielen ab.
  3. Stellen Sie sicher, dass Stress durch die Verwendung einer Akklimatisierungsphase reduziert wird, da Stress die ordnungsgemäße Funktion des Fortpflanzungssystems stören kann53. Überkompensieren Sie jedoch nicht, indem Sie versuchen, es zu beseitigen, da ein moderater Stress für das Wohlbefinden der Tiere von Vorteil ist51.
  4. Wirtsratten in einer temperatur- (68-79 ° F, dh 20-26 ° C) und feuchtigkeitskontrollierten (30-70%) Umgebung, indem Sie das Vivarium oder Laborleiter kontaktieren und diese Eigenschaften sicherstellen. Verteilen Sie Wasser und Chow ad libitum mit Nährstoffkomponenten, die auf der Website des Unternehmens aufgeführt sind, und reinigen Sie den Käfig einmal pro Woche.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden die Ratten in Gruppen von 2 Personen untergebracht, die nach Geschlecht in 19 "x 10" x 8" klaren wiederverwendbaren Kunststoffkäfigen getrennt waren und Zugang zu Maiskolbenbettwäsche hatten, die einmal pro Woche gewechselt wurde. Die Temperatur wurde bei 70 ° F und die Luftfeuchtigkeit bei 35-79% gehalten, mit einem Durchschnitt von 62%.
  5. Überprüfen Sie die Entwicklung einer Ringschwanz- oder ischämischen Nekrose des Schwanzes und der Zehen auf Hinweise auf niedrige relative Luftfeuchtigkeit und extreme Temperaturen, die den Wechsel biologischer Reaktionen verursachen können.
    HINWEIS: Temperatur und Luftfeuchtigkeit sind wichtig für das Fortpflanzungssystem, die sexuelle Reifung und die Östruszyklizität54,55,56,57,58.
  6. Stellen Sie eine ordnungsgemäße und ausgewogene Beleuchtung im gesamten Wohnraum sicher, indem Sie im gesamten Laborraum gleiche Mengen an Lichtquellen ablegen, die auf ein zeitgesteuertes Licht-zu-Dunkel-System wirken.
    HINWEIS: Hier wurde ein 12:12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus mit eingeschaltetem Licht von 06:00 bis 18:00 Uhr von linearen 2.550-Lumen-LED-Lampen gesteuert.
  7. Befolgen Sie die Lux-Anforderungen52, basierend auf Variationen der Pigmentierung, des Alters, des Stammes, des Geschlechts und des Hormonstatus der Tiere.
    HINWEIS: Wenn Forscher die gesammelten Zellproben kategorisieren, ermöglicht eine konsistente Beleuchtung eine ordnungsgemäße visuelle Erkennung und ein zuverlässiges Staging59. Die Dauer und Intensität des Lichts stehen in direktem Zusammenhang mit dem Fortpflanzungssystem, der sexuellen Reifung und dem Östruszyklus 54,55,56,57,60,61.

2. Ausrüstung und Versuchsvorbereitung

  1. Überprüfen Sie die Kategorisierungsdeterminanten (siehe Abbildung 2A): Wie man jede Stufe des Östruszyklus identifiziert und wie man das Mikroskop und die Kameraausrüstung bedient.
  2. Stellen Sie sicher, dass jedes zu überwachende Subjekt die sexuelle Reifung erreicht hat und geeignete Indikatoren für die Entwicklung aufweist - VO, Körpergewicht und Alter. Wiegen Sie die Ratten und untersuchen Sie sie jeden Tag zur gleichen Zeit auf VO für genaue Vergleiche und übertragen Sie sie mit einer zugelassenen Handhabungsmethode. Wenden Sie sich an den an der Universität angeschlossenen Tierarzt, wenn ein Tier mehr als 20% seines vorherigen Körpergewichts verliert.
    HINWEIS: Die VO bleibt kaudal zur Harnröhrenöffnung und der Schädel zum Anus, der sich zwischen den beiden befindet, wie in Abbildung 3 dargestellt.
  3. Da diese Faktoren belastungsabhängig sind, erkundigen Sie sich beim Lieferanten nach Spezifikationen und berücksichtigen Sie die für das Labor spezifischen Umweltfaktoren62.
    HINWEIS: Im Allgemeinen tritt dies zwischen 32 und 34 Tagen und einem durchschnittlichen Körpergewicht zwischen 75 und 150 Gramm63 für SD-Ratten auf und wird durch eine kreisförmige Öffnung angezeigt, die zuvor von einer membranösen Hülle bedeckt war.
  4. Wählen Sie einen Probenentnahmezeitraum aus, der für die Gruppe der überwachten Ratten geeignet ist, um die Entnahme von Übergangsproben zu verhindern. Probieren Sie zunächst einige Tiere zu 2 oder 3 verschiedenen Zeitpunkten im Laufe des Tages, um die Zeit zu bestimmen, zu der die meisten Zyklusphasen vorhanden sind (z. B. Probenahme um 12:00 Uhr, 13:00 Uhr und 14:00 Uhr für verschiedene Tiere). Schließen Sie die vaginale Spülung jeden Tag zur gleichen Zeit ab, um eine konsistente und zuverlässige Inszenierung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Es wurde berichtet, dass die Stunden zwischen 12:00 und 14:00 Uhr am besten geeignet sind, um alle Etappen einzufangen. In dieser Studie fand die Überwachung des Östruszyklus zwischen 12:00 und 14:00 Uhr statt, wobei das Halten im Kompressionsstil erfolgte (siehe Schritt 3.4). Die Bedeutung des Timings der Überwachung des Östruszyklus im Vergleich zu anderen experimentellen Interventionen (z. B. Verhaltenskonditionierung, Medikamente) ist ein sich entwickelndes Forschungsgebiet und kann weiter erforschtwerden 11. Die Bestimmung der Dauer des Östruszyklus-Monitorings ist studienabhängig und kann in veröffentlichten Studien11,33 weiter untersucht werden.
  5. Entfernen Sie die Schutzhülle vom Mikroskop und befestigen Sie die Kamera am Computer, indem Sie die Schutzobjektivabdeckung der Kamera entfernen und das Objektiv über das Okular des Mikroskops legen.
  6. Öffnen Sie dann die vorausgewählte Software auf dem Computer. Um die in dieser Studie ausgewählte Software zu verwenden, wählen Sie unter der Registerkarte Kameraliste die Kamera aus, die an den USB-Anschluss auf der linken Seite des Bildschirms angeschlossen ist. Stellen Sie sicher, dass die USB-Kamera ordnungsgemäß an den Computer angeschlossen ist, wodurch No Device unter der Registerkarte Camera List (Kameraliste) angezeigt wird, falls dies nicht der Fall ist.
  7. Sobald die USB-Kamera unter der Registerkarte ausgewählt wurde, schalten Sie den Mikroskoplichtschalter ein, der sich auf der Basis befindet.
  8. Erstellen Sie einen Ordner auf dem Computer, der für die Zellenbeispielfotos vorgesehen ist. Erstellen Sie einen Dateiordner für jeden einzelnen Tag, an dem Daten gesammelt werden, und bereiten Sie ihn vor, bevor Bilder aufgenommen werden.
  9. Wenn die Ausrüstung vorbereitet ist, holen Sie den Käfig des Probanden aus seinem Halteplatz und bringen Sie ihn zur Probenentnahmestation.

3. Sammlung von Vaginalzellen

  1. Holen Sie sich eine Einwegspritze und füllen Sie jede der Spritzen mit 0,2 ml sterilem 0,9% NaCl. Wenn Luftblasen vorhanden sind, streichen Sie vorsichtig mit der Fassspritze, bis alle Luftblasen die offene Spitze der Spritze erreicht haben, und stoßen Sie die Luft aus. Wenn noch Luftblasen vorhanden sind, stoßen Sie die Lösung wieder in den NaCl-Behälter aus und füllen Sie nach, bis keine vorhanden sind.
    HINWEIS: Übermäßiges Flackern kann zur Bildung von mehr Luftblasen führen.
  2. Geben Sie jede Spritze in die Kunststoffverpackung zurück, um ein steriles Feld aufrechtzuerhalten, wobei sich die Spitze der Spritze innerhalb des versiegelten Teils der Verpackung befindet.
  3. Öffnen Sie den Käfig und heben Sie das Subjekt vorsichtig entweder an der Basis des Schwanzes oder am Rumpf des Körpers an und schließen Sie den Deckel des Käfigs, um zu verhindern, dass andere aussteigen. Wählen Sie eine der unten aufgeführten Haltungsmethoden aus, die auf persönlichen Vorlieben und der Reaktion der Tiere basiert.
  4. Verwenden Sie den Kompressionsstil für jugendliche Ratten, indem Sie das Subjekt gegen die obere Brustregion legen, wobei die Nase des Probanden auf den Boden zeigt. Bevor Sie mit dem Tupfer beginnen, stellen Sie sicher, dass das Subjekt ausreichend komprimiert ist, um eine Bewegung zu verhindern, aber bequem und sicher im Griff ist. Legen Sie den Vaginalkanal des Subjekts frei, indem Sie den Schwanz sanft beugen, bevor Sie die Spritze einführen.
  5. Verwenden Sie den Hind Leg Lift für erwachsene Ratten, indem Sie die Vorderpfoten des Tieres entweder auf die Oberseite oder die Seite des Käfigs legen, während der Schwanz und die Hinterbeine mit einem sanften Halt zwischen dem ersten und zweiten Finger zurückgehalten werden, so dass der Daumen frei bleibt, um die Spritze64 zu bedienen.
  6. Ermöglichen Sie den Tieren, sich an die Handhabung und Überwachung zu gewöhnen. Behandeln Sie die Tiere sanft und dennoch sicher, um übermäßigen Stress abzubauen und den Forscher vor Aggressionen wie Beißen zu schützen.
    HINWEIS: Die ersten Tage der Überwachung führen möglicherweise nicht zu den gewünschten Ergebnissen, da sich die Tiere an ihre Bedingungen gewöhnen. Der Umgang mit den Tieren, um Körpergewichte während der Akklimatisierungsphase zu sammeln, kann diesen Übergangunterstützen 33.
  7. Während Sie die Spritze mit Zeigefinger und Mittelfinger ruhig halten, führen Sie die Spitze der Spritze (nicht mehr als 2 mm) in einem Winkel parallel zum Vaginalkanal ein. Schleusen Sie den NaCl langsam in den Kanal, indem Sie den Kolben nach innen drücken. Führen Sie die Spritze nicht weiter in den Kanal ein, da dies den Östruszyklus stören kann.
  8. Extrahieren Sie das NaCl aus dem Vaginalkanal, indem Sie den Kolben der Spritze von der Epithelauskleidung wegziehen (nach oben). Wenn es Schwierigkeiten gibt, das Subjekt während dieses Vorgangs im Griff zu halten, legen Sie es für eine kurze Ruhezeit zurück in den Käfig, bevor Sie die NaCl-Extraktion versuchen.
  9. Sobald die Zellprobe entnommen wurde, legen Sie das Subjekt zurück in den Käfig und wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Tier, bevor alle Proben unter dem Mikroskop ausgewertet werden.
    HINWEIS: Alternativ kann jede Probe gesammelt und ausgewertet werden, bevor sie zum nächsten Tier übergeht. Ein Tier kann eine zweite Lavage benötigen, wenn die Probe nicht kategorisiert werden kann. Die gleiche Spritze aus der ursprünglichen Sammlung kann wiederverwendet werden, wenn sie die Kochsalzlösung nicht direkt im Behälter und nur für dasselbe Tier berührt.

4. Stichprobenauswertung

  1. Beginnen Sie mit der Kategorisierung, indem Sie die extrahierte Vaginalflüssigkeitsprobe untersuchen. Notieren Sie die Viskosität entweder viskos oder nicht viskos und die Färbung als undurchsichtig oder transparent auf dem Beschreibungsdokument oder einem anderen Aufzeichnungssystem.
    HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls kann zum Zeitpunkt der Probenentnahme oder später durchgeführt werden.
  2. Stoßen Sie 2-3 Tropfen der Flüssigkeit auf einen Objektträger aus und legen Sie ein Mikroskop-Deckglas auf den Objektträger. Legen Sie das Deckglas auf den Objektträger von der Oberseite des Objektträgers nach unten oder von einer Seite des Objektträgers zur anderen, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern. Wenn möglich, lassen Sie etwa die Hälfte der gesammelten Probe in der Spritze, wenn eine weitere Untersuchung erforderlich ist, und um zu verhindern, dass eine überschüssige Menge Flüssigkeit auf den Objektträger gegeben wird.
  3. Suchen Sie die gesammelten Zellen, indem Sie den Objektträger über die Bühne bewegen. Wenn zu wenige Zellen oder eine hohe Menge an Ablagerungen vorhanden sind, stoßen Sie die verbleibende Flüssigkeit auf einen neuen Objektträger aus und untersuchen Sie sie erneut. Wenn die in der Spritze verbleibende Probenmenge nicht ausreicht oder wenn der zweite Tropfen ähnliche Probleme aufweist, entnehmen Sie dem Subjekt eine weitere Probe, bevor Sie versuchen, das Östruszyklusstadium zu identifizieren.
  4. Sobald die Zellen gefunden wurden und bevor Sie den Computer oder die Computertastatur berühren, entfernen Sie den einen Handschuh, um eine Verschmutzung der Tastatur zu verhindern.
  5. Erfassen Sie Bilder der Zellproben, indem Sie auf die Funktion Snap auf der linken Seite des Software-Bedienfelds klicken.
  6. Speichern Sie dann die Datei, indem Sie unter dem Dateisymbol in der oberen linken Ecke der Seite auf Speichern unter klicken. Speichern Sie das Foto in einem vorbeschrifteten Ordner auf dem Computer.
    HINWEIS: Beispiel für eine Etikettenvorlage: #subjectnumber_date collected_estrous stage_objective verwendete Linse.
  7. Nehmen Sie mehr als ein Foto an jedem Objektivobjektiv auf, wenn sich nicht viele Zellen in jedem Rahmen befinden.
    HINWEIS: Beispielbeschriftungen für mehrere Bilder: #1_01/09/2021_EST_4x1 und #1_01/09/2021_EST_4x2.
  8. Wiederholen Sie den Vorgang für jede gesammelte Probe unter mehreren Objektivlinsen. Schließen Sie mindestens eine kleinere Objektivierung, z. B. 4x, und mindestens eine größere Objektivierung, z. B. 20x, ein.
  9. Laden Sie die Bilder auf ein freigegebenes Laufwerk / einen freigegebenen Ordner oder eine externe Festplatte hoch, damit alle beteiligten Forscher Zugriff auf die Dateien haben und Sicherungskopien verfügbar sind.

5. Stufenkategorisierung

  1. Richten Sie den Computerbildschirm so ein, dass gleichzeitig die aufgenommenen Fotos und das Aufnahmeblatt angezeigt werden (Abbildung 4A-C).
    HINWEIS: Auf diese Weise kann die Dokumentation während der Anzeige der gesammelten Probe erfolgen. Dieser Teil des Protokolls kann zum Zeitpunkt der Probenentnahme oder später abgeschlossen werden.
  2. Bestimmen Sie, welche Zelltypen in der Probe vorhanden sind. Wählen Sie anhand der Kriterien eine der vier Optionen aus, die in den Schritten 5.2.1-5.2.4 aufgeführt sind, und zeichnen Sie die Ergebnisse auf.
    1. Anukleierte keratinisierte Epithelzellen (AKE)/verhornte Epithelzellen
      1. Suchen Sie nach gezackten oder eckigen Zellen, wie in Abbildung 2B und Abbildung 5C zu sehen, die trotz des Fehlens von Kernen leichte runde Bereiche (Kerngeister) innerhalb der Zelle zeigen können, die darstellen, wo einst ein Kern vorhanden war. Verwenden Sie eine höhere Vergrößerung, z. B. 20x und höher, um zwischen solchen kernhaltigen und anukleierten Zellen zu unterscheiden.
      2. Verwenden Sie eine höhere Vergrößerung, um den keratinisierten oder verhornten Teil der Zelle zu unterscheiden - eine dünne Schicht von Zellen, denen Kerne fehlen und die mit Keratin gefüllt sind - falls gewünscht.
        HINWEIS: Zusätzlich zu ihrem gezackten Aussehen können diese auch dadurch unterschieden werden, wie sie sich falten oder zerlegen können, wodurch gezackte und längliche Strukturen entstehen, die als Keratinstäbe bekannt sind.
    2. Große kernhaltige Epithelzellen (LNE)
      1. Suchen Sie nach diesen typischerweise runden bis polygonal geformten Zellen, die von unregelmäßigen, gezackten oder eckigen Rändern umgeben sind.
      2. Beobachten Sie, wie ihre Kerne verschiedene Formen annehmen können, die von intakt bis degeneriert oder pykontisch reichen und sich auf die irreversible Kondensation von Chromatin im Kern einer Zelle beziehen, die sich dem Tod oder der Verschlechterung unterzieht, wie in Abbildung 2B und Abbildung 5D1,2 zu sehen ist. Beachten Sie, dass diese Kerne weniger Platz einnehmen als das Zytoplasma innerhalb der Zelle, mit einem niedrigeren Kern-Zytoplasma-Verhältnis (N: C) als die kleinen Epithelzellen. Achten Sie auf zytoplasmatische Granulate, die bei höheren Vergrößerungen13 zu sehen sind.
    3. Leukozyten (LEUs)/Neutrophile/polymorphkernige Zellen
      1. Suchen Sie nach diesen kompakten, kugelförmigen Zellen mit multilobulierten Kernen (daher als polymorphkernige Zellen bekannt), die mit zunehmender Zellreife verschwinden (Abbildung 2B und Abbildung 5A). Eine höhere Vergrößerung (z. B. 40x) kann verwendet werden, um die mehrfach lobulierten Kerne zu beobachten.
        HINWEIS: Bei der Sammlung und Vorbereitung können diese Zellen kondensieren, falten oder reißen.
    4. Kleine kernhaltige Epithelzellen (SNE)
      1. Achten Sie auf diese runden bis ovalen Zellen, die größer sind als die oben beschriebenen Neutrophilen.
      2. Beobachten Sie die runden Kerne dieser nicht keratinisierten Epithelzellen (Abbildung 2B), die eine größere Menge an Platz einnehmen als das Zytoplasma in der Zelle, wodurch ein höheres N: C-Verhältnis im Vergleich zu großen Epithelzellen entsteht.
        HINWEIS: Beim Sammeln und Vorbereiten können sich diese Zellen falten oder überlappen, um eine Form zu erzeugen, die einer Schnur oder einem Balken ähnelt, wie in Abbildung 5B1 dargestellt.
  3. Untersuchen Sie, wie die im Beispiel vorhandenen Zellen für jede Objektivierung organisiert sind. Verwenden Sie die untere Objektivierung, z. B. 4x, um eine repräsentative Ansicht der gesamten Zellanordnung anzuzeigen. Notieren Sie, ob die Zellen verklumpt (C), gleichmäßig dispergiert (ED) oder zufällig dispergiert (RD) sind (siehe Abbildung 4C), und notieren Sie die spezifische Organisation jedes Zelltyps (z. B. sind kleine kernhaltige Epithelzellen verklumpt und Neutrophile sind gleichmäßig verteilt).
  4. Als nächstes schätzen und notieren Sie visuell die Gesamtzellmenge (ein bisschen, mäßig, zahlreich) und die einzelnen Zellmengen (Prozentsatz jedes vorhandenen Zelltyps).
    HINWEIS: Ein Smidge stellt die kleinste Anzahl vorhandener Zellen dar, die zur Bestimmung der Stichprobenkategorisierung verwendet werden können, zahlreiche stellen das Vorhandensein einer unzähligen Anzahl von Zellen dar, die entweder den größten, wenn nicht den gesamten Platz auf dem Objektträger ausmachen oder übereinander gestapelt sind, und eine moderate Anzahl von Zellen stellt eine vergleichsweise durchschnittliche Anzahl von Zellen dar (Beispiele in Abbildung 5A-D und Abbildung 6A-D).
  5. Beachten Sie, ob es Abweichungen von den aufgeführten Kriterien oder von Aspekten gibt, die für das spezifische Thema in der Kategorie "Anomalien" typisch sind, und konsultieren Sie bei Bedarf einen Tierarzt.
  6. Bestimmen Sie, welche Östruszyklusstufe in der Stichprobe dargestellt wird, indem Sie die kategorisierenden Komponenten und die folgenden Beschreibungen verwenden.
    1. Sterben
      1. Suchen Sie nach LEUs als dominantem oder einzigem Zelltyp, die zu Beginn des DIE verklumpt angeordnet sind, aber in späten Stadien stärker verstreut sind.
        HINWEIS: Während des Übergangs in DIE kann die Menge der Zellen abnehmen, wenn die Epithelzellen zu zerfallen beginnen, wie in Abbildung 6D1 zu sehen ist. Gleichzeitig beginnt die Anzahl der LEUs zuzunehmen, und sie neigen dazu, zunächst verklumpt angeordnet zu sein und sich im Laufe der Zeit zu zerstreuen.
      2. Beachten Sie, dass die Gesamtmenge der Zellen vergleichsweise niedrig sein kann, meistens in den späteren Stadien der DIE-Periode, am zweiten oder dritten Tag.
      3. Beobachten Sie die hohe Menge an Schleim, die in dieser Phase vorhanden sein kann, die sich als konzentrierte Stränge von LEUs darstellt (Abbildung 5A1). Achten Sie auf kleine Klumpen oder Zellstränge von SNE-Zellen, die die LEUs in späten Phasen des Übergangs zu PRO begleiten (Abbildung 5A1,2).
      4. Beobachten Sie das viskose und undurchsichtige Erscheinungsbild der Vaginalflüssigkeit beim Übergang in DIE, beim vollständigen Übergang in und beim Übergang aus dem DIE.
        HINWEIS: Die durchschnittliche Dauer dieser Phase beträgt 48 h während eines 4-Tage-Zyklus und möglicherweise 72 h während eines 5-Tage-Zyklus.
    2. Profi
      1. Suchen Sie nach SNE-Zellen als dominanten Zellen und nach LEUs, LNE und / oder AKE-Zellen, die in geringer Anzahl zu sehen sind. Verwenden Sie eine hohe Objektivierung, um das körnige Erscheinungsbild der SNE-Zellen zu beobachten, die typischerweise in dieser Phase in Clustern, Blättern oder Strängen angeordnet sind (Abbildung 5B1,2).
      2. Beobachten Sie das viskose und undurchsichtige Aussehen der Vaginalflüssigkeit, wenn Sie von DIE in PRO übergehen, und wie es nicht viskos und transparent wird, sobald es vollständig in das PRO-Stadium übergegangen ist (durchschnittliche Dauer von 14 h bei Ratten).
    3. Est
      1. Achten Sie auf die Dominanz von AKE-Zellen, eine Verringerung der SNE-Zellen in EST und eine Zunahme der Anzahl und Größe der Zellen, da EST weiterhin11,13 anhält.
      2. Beachten Sie das Unterscheidungsmerkmal der oft gruppierten Anordnung von AKE-Zellen in Form von Keratinstäben oder Geisterkernen, die sich beim Übergang von PRO (Abbildung 6B) und zu MET (Abbildung 6C) zufälliger ausbreiten können.
      3. Beobachten Sie die charakteristische nichtviskose und transparente Vaginalflüssigkeit, die erwartet werden kann, wenn die Ratten in EST übergehen, vollständig in EST übergehen und aus ihr übergehen.
        HINWEIS: Die Progression von EST beinhaltet eine starke Diversifizierung (Abbildung 5C und Abbildung 6B, C). Das Stadium tritt typischerweise für durchschnittlich 24 h in einem 4-Tage-Zyklus oder möglicherweise 48 h in einem 5-Tage-Zyklus auf.
    4. Traf
      1. Achten Sie auf eine höhere Anzahl von SNE- und LNE-Zellen, wenn die Ratte in MET übergeht, entweder dominant in Bezug auf den Zellanteil innerhalb des Kanals oder fast gleich hoch wie die LEUs11,13. Notieren Sie sich außerdem die größere Menge an Trümmern in MET und die Übergänge als in anderen Stadien aufgrund des Epithelzellzerfalls nach EST und der Bewegung in DIE.
      2. Beachten Sie das Fehlen einer konsistenten Anordnung, da alle Zelltypen in verschiedenen Mengen gesehen werden (Abbildung 5D1-3). Achten Sie jedoch auf die LEUs, die in den Anfangsstadien in der Nähe der Epithelzellen gepackt oder verklumpt sind, die beim Übergang in DIE zur verklumpten Anordnung zurückkehren können.
      3. Beobachten Sie das nicht viskose und transparente Aussehen der Vaginalflüssigkeit in diesem Stadium und die Veränderung zu einem viskoseren und undurchsichtigeren Aussehen, während Sie sich in DIE bewegen.
        HINWEIS: Die durchschnittliche Dauer dieser Phase beträgt 6-8 h.
  7. Beschriften Sie Proben in Übergängen mit dem Stadium, auf das sich das Subjekt zubewegt, wobei der Übergang in Klammern zu verfolgen ist, wann diese gesammelt werden. Weitere Informationen zur Unterscheidung zwischen diesen 4 Stufen und ihren Übergängen finden Sie in den repräsentativen Ergebnissen.
    HINWEIS: Da die gesammelten Proben statisch sind und der Zyklus dynamisch ist, können die Objektträger Übergänge zwischen den Stufen darstellen (siehe Abbildung 6A-D).
  8. Schließen Sie diesen Vorgang für jedes Tier ab, bis die Überwachungsphase abgeschlossen ist.
  9. An Tag 11 (45 Tage alt) oder 21 (55 Tage alt) euthanasieren Sie die Ratten mit 5% Isofluran und 2% Sauerstoff vor einer Guillotine-Enthauptung. Diese Zeitpunkte können je nach Art der Studie variieren.

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Ergebnisse

Die aktuellen Daten spiegeln die des weiblichen SD International Genetic Standardization Program (IGS) in Anwesenheit von männlichen SD-Ratten wider. Diese Tiere wurden im Rahmen einer gemeinsamen Studie sowohl in den Labors der Pepperdine University als auch der UCLA gefunden. Abbildung 5 zeigt mehrere Variationen der 4 Zyklusstufen. Abbildung 5A1 wurde als Diestrusprobe mit mehreren Zelltypen identifiziert. Dieses Beispiel zeigt, dass Proben m...

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Diskussion

Wichtige Schritte und wichtige Überlegungen
Bestimmte kritische Schritte im bereitgestellten Protokoll erfordern Betonung, insbesondere bei der Sammlung von Vaginalzellen. Während der Vaginalflüssigkeitsextraktion ist die Sicherstellung des richtigen Winkels und der richtigen Tiefe des Spritzeneinführens der Schlüssel, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen und letztendlich Reizungen, Verletzungen oder zervikale Stimulation des Tieres zu verhindern. Die Stimulation des Gebärmutterhalses kann ein...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde im Rahmen einer NIH-finanzierten Zusammenarbeit zwischen dem Los Angeles Brain Injury Research Center (BIRC) der University of California durchgeführt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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Ultraleichtes Tissue und Kunststoff 17' x 24' EinwegunterlageMedlineEAN: 0480196288558
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BH

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