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Methodenartikel

Design und Entwicklung eines Modells zur Untersuchung der Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mukoviszidose-Atemwegsmikrobiom

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DOI:

10.3791/62888

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3. August 2021

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1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 3Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 4Department of Microbiology & Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 5Swiss i-research and teaching institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ziel dieses Protokolls ist es, ein Modellsystem für die Wirkung von Hyperoxie auf mikrobielle Gemeinschaften der Mukoviszidose der Atemwege zu entwickeln. Künstliches Sputummedium emuliert die Zusammensetzung von Sputum, und hyperoxische Kulturbedingungen modellieren die Auswirkungen von zusätzlichem Sauerstoff auf mikrobielle Lungengemeinschaften.

Zusammenfassung

Es wird angenommen, dass mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Mukoviszidose (CF) und anderer chronischer Lungenerkrankungen spielen. Mikroben wurden traditionell aufgrund ihrer Fähigkeit, Sauerstoff zu verwenden oder zu tolerieren, klassifiziert. Zusätzlicher Sauerstoff ist eine gängige medizinische Therapie, die Menschen mit Mukoviszidose (pwCF) verabreicht wird. Bestehende Studien zu Sauerstoff und dem Mikrobiom der Atemwege haben sich jedoch darauf konzentriert, wie hypoxie (sauerstoffarm) und nicht Hyperoxie (hoher Sauerstoffgehalt) die überwiegend aeroben und fakultativen anaeroben mikrobiellen Lungengemeinschaften beeinflusst. Um diese kritische Wissenslücke zu schließen, wurde dieses Protokoll unter Verwendung eines künstlichen Sputummediums entwickelt, das die Zusammensetzung von Sputum aus pwCF nachahmt. Die Verwendung der Filtersterilisation, die ein transparentes Medium ergibt, ermöglicht optische Methoden, um das Wachstum von einzelligen Mikroben in Suspensionskulturen zu verfolgen. Um hyperoxische Bedingungen zu erzeugen, nutzt dieses Modellsystem etablierte anaerobe Kultivierungstechniken, um hyperoxische Bedingungen zu untersuchen; Anstatt Sauerstoff zu entfernen, wird den Kulturen Sauerstoff zugesetzt, indem täglich Serumflaschen mit einer Mischung aus komprimiertem Sauerstoff und Luft geschont werden. Sputum von 50 pwCF wurde über einen Zeitraum von 72 Stunden täglich gespart, um die Fähigkeit dieses Modells zur Aufrechterhaltung unterschiedlicher Sauerstoffbedingungen zu überprüfen. Die metagenomische Shotgun-Sequenzierung wurde an kultivierten und unkultivierten Sputumproben von 11 pwCF durchgeführt, um die Fähigkeit dieses Mediums zu überprüfen, das Wachstum von kommensalen und pathogenen Mikroben zu unterstützen, die häufig in Mukoviszidose-Sputum vorkommen. Wachstumskurven wurden aus 112 Isolaten von pwCF erhalten, um die Fähigkeit dieses künstlichen Sputummediums zur Unterstützung des Wachstums häufiger Mukoviszidose-Erreger zu überprüfen. Wir stellen fest, dass dieses Modell eine Vielzahl von Krankheitserregern und Kommensalen im CF-Sputum kultivieren kann, eine Gemeinschaft wiederherstellt, die dem unkultivierten Sputum unter normoxischen Bedingungen sehr ähnlich ist, und verschiedene Kulturphänotypen unter unterschiedlichen Sauerstoffbedingungen erzeugt. Dieser neue Ansatz könnte zu einem besseren Verständnis der unvorhergesehenen Wirkungen führen, die durch die Verwendung von Sauerstoff in pwCF auf mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege und häufige Atemwegspathogene induziert werden.

Einleitung

Mukoviszidose (CF) ist eine genetische Erkrankung, die durch die Unfähigkeit gekennzeichnet ist, dicken Schleim aus der Lunge zu entfernen, was zu wiederholten Infektionen und fortschreitendem Rückgang der Lungenfunktion führt, was oft zu einer Lungentransplantation oder zum Tod führt. Das Atemwegsmikrobiom von Menschen mit Mukoviszidose (pwCF) scheint die Krankheitsaktivität1zu verfolgen, wobei eine Verringerung der mikrobiellen Vielfalt mit unerwünschten Langzeitergebnissen verbunden ist2,3. In klinischen Studien mit pwCF wurde die ergänzende Sauerstofftherapie mit fortgeschrittenerenErkrankungen inVerbindung gebracht 4,5, obwohl traditionell die Verwendung der Sauerstofftherapie einfach als Marker für die Schwere der Erkrankung angesehen wurde6. Jüngste Studien aus einer klinischen Studie mit Patienten mit Atemversagen haben gezeigt, dass ein höherer Sauerstoffgehalt bei Patienten paradoxerweise mit einer Zunahme schwerer bakterieller Infektionen und einer höheren Mortalität verbunden ist7, was darauf hindeutet, dass zusätzlicher Sauerstoff zur Pathogenese der Krankheit beitragen kann. Die Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mukoviszidose-Lungenmikrobiom und die damit verbundenen mikrobiellen Lungen- und Atemwegsgemeinschaften wurde nicht gut untersucht.

Mechanistische Studien können aufgrund logistischer Schwierigkeiten und potenzieller ethischer Probleme im Zusammenhang mit Interventionen mit unbekanntem medizinischem Nutzen oder Schaden oft nicht direkt am Menschen durchgeführt werden. Translationale Ansätze, die menschliche Bioproben in Modellsysteme integrieren, können in diesen Fällen wichtige biologische Erkenntnisse liefern. Während die Fähigkeit, Sauerstoff zu verwenden oder zu tolerieren, traditionell ein wichtiger Bestandteil der mikrobiellen Klassifizierung war, ist wenig darüber bekannt, wie die therapeutische Einführung von zusätzlichem Sauerstoff in die Umwelt mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege stören könnte. Um die unbekannten Auswirkungen von zusätzlichem Sauerstoff auf die Atemwegsmikrobiome von pwCF zu beleuchten, mussten wir uns zwei großen Herausforderungen stellen; erstens die Schaffung eines Kulturmediums, das sich physiologisch der Zusammensetzung von CF-Sputum annähert; zweitens die Schaffung eines Modellsystems, das die Aufrechterhaltung erhöhter Sauerstoffkonzentrationen in Kultur über längere Zeiträume ermöglicht.

Künstliche Sputummedien (ASM) werden häufig verwendet, um Lungenputum ex vivo8,9,10zu emulieren , aber es gibt keinen klaren Konsens über ein bestimmtes Rezept. Dieses Protokoll beschreibt eine künstliche Sputum-Medium-Rezeptur und Zubereitungsstrategie, die sorgfältig entwickelt wurde, um Sputum von pwCF physiologisch anzunähern. Tabelle 1 zeigt die ausgewählten Rezeptwerte basierend auf veröffentlichter Literatur. Grundlegende chemische Komponenten und pH-Wert wurden mit Werten abgeglichen, die durch Studien an menschlichem CF-Sputum11,12,13 identifiziertwurden. Niedrige Konzentration physiologische Nährstoffe wurden unter Verwendung von Eigelb, das als 0,25% des Endvolumens10enthalten war, sowie Vitamin- und Spurenmetallmischungen14,15hinzugefügt. Mucin, die Schlüsselkomponente von Sputum16,wurde mit 1% w/v14eingeschlossen. Obwohl arbeitsintensiver, wurde die Filtersterilisation der konventionelleren Praxis der Wärmesterilisation vorgezogen, um potenzielle Probleme durch hitzeinduzierte Denaturierung wesentlicher Medienkomponenten zu reduzieren10. Ein zusätzlicher Vorteil der Filtersterilisation besteht darin, dass transparente Medien erzeugt werden (Die Wärmesterilisation kann aufgrund der Ausfällung und Koagulation von Salzen und Proteinen trübe Medien erzeugen), so dass diese künstlichen Auswurfmedien verwendet werden können, um das mikrobielle Wachstum auf der Grundlage einer Erhöhung der Trübung zu verfolgen.

Dieses Modellsystem für die hyperoxische Kultur basiert auf anaeroben Kultivierungstechniken, bei denen Sauerstoff hinzugefügt und nicht entfernt wird, wodurch ein Modell für die Wirkung der zusätzlichen Sauerstoffnutzung für pwCF erstellt wird. Abbildung 1 und das zugehörige Sauerstoffsparging-Protokoll skizziert die Komponenten eines Sauerstoff-Sparging-Systems, das kostengünstig von allgemeinen Labor- und Krankenhauslieferanten bezogen werden kann. Dieses System ermöglicht das Mischen von komprimiertem Sauerstoff und Luft zu festen Konzentrationen im Bereich von 21% -100% Sauerstoff. Die Integration eines Sauerstoffsensors ermöglicht die Überprüfung der Konzentration des Ausgangsgasgemisches sowie die Überprüfung der Ausflussgaszusammensetzung von zuvor verschonten Serumflaschen, um sicherzustellen, dass die Sauerstoffbedingungen im gewünschten Bereich eingehalten wurden.

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Erzeugung eines künstlichen Sputummediums, den Aufbau und die Verwendung eines Sauerstoffsparsystems und die Anwendung beider auf DIE Kultur von CF-Sputum unter differentiellen Sauerstoffbedingungen.

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Protokoll

Diese Studie wurde vom Partners Institutional Review Board genehmigt (Protokoll Nr. 2018P002934). Einschlusskriterium umfasste erwachsene Patienten mit Mukoviszidose, die eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung für die Studie erteilten. Es gab kein Ausschlusskriterium. Gemäß den Protokollrichtlinien wurden alle Sputumproben von Patienten mit Mukoviszidose während eines geplanten ambulanten Besuchs bei ihrem klinischen Anbieter gesammelt.

1. Künstliche Sputum Medium Vorbereitung

HINWEIS: Die hier aufgeführten Mengen beziehen sich auf die Herstellung von 1 l des endgültigen künstlichen Sputummediums und setzen die spezifischen Reagenzien voraus, die in der Materialtabelleaufgeführt sind. Die Nummern müssen für andere Mengen oder für die Verwendung verschiedener Reagenzien angepasst werden, um das gleiche Endprodukt zu gewährleisten. Für die Zielkonzentrationen siehe Tabelle 1.

  1. Künstlicher Sputum chemische Mischung (ASCM)
    HINWEIS: ASCM macht 25% des endgültigen mittleren Volumens aus. Es ist lagerstabil und kann in großen Mengen oder im Voraus zubereitet werden. Wenn Sie für die spätere Verwendung vorbereitet sind, autoklavieren Sie die chemische Mischung und lagern Sie sie sicher bei Raumtemperatur.
    1. Mischen Sie die konstituierenden chemischen Stammlösungen.
      1. Bereiten Sie 1 M NaCl-Brühe vor: Fügen Sie 58,44 g NaCl pro Liter steriles Wasser hinzu.
      2. 1 M KCl-Brühe zubereiten: 74,55 g KCl pro Liter steriles Wasser zugeben.
      3. 1 M MgSO4-Brühe vorbereiten: 246,47 g MgSO4·7H2O pro Liter steriles Wasser oder 120,37 g wasserfreies MgSO4 pro Liter steriles Wasser zugeben.
      4. Bereiten Sie 1 M Glukosevorrat vor: Fügen Sie 180,16 g Glukose pro Liter steriles Wasser hinzu.
    2. Autoklav sterilisieren Sie die chemischen Stammlösungen sowie eine leere 250-ml-Flasche. Führen Sie die Autoklavierschritte auf mindestens Standardwerte von 121 °C und 15 PSI für 30 min durch.
    3. Geben Sie 80,59 ml steriles Wasser in die leere 250 ml Flasche.
    4. Geben Sie 152,30 ml 1 M NaCl-Brühe in die Mischung.
    5. Geben Sie 15,8 ml 1 M KCl-Material zu der Mischung hinzu.
    6. 610 μL 1 M MgSO4-Brühe in die Mischung geben.
    7. Geben Sie 700 μL 1 M Glukosebrühe in die Mischung.
  2. Künstlicher Sputum Mucin Mix (ASMM)
    HINWEIS: ASMM macht 50% des endgültigen mittleren Volumens aus. Stellen Sie sicher, dass es am selben Tag wie die endgültige mittlere Charge zubereitet wird.
    1. 450 ml steriles Wasser in eine leere 1 L Flasche geben.
    2. 50 ml 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Flasche geben.
    3. Fügen Sie der Flasche einen magnetischen Einwegrührbalken hinzu.
    4. Autoklavieren Sie die PBS-haltige Flasche und den Rührstab.
    5. Messen Sie 10 g Mucinpulver ab und geben Sie es dem PBS hinzu.
    6. Schütteln Sie die Flasche für das vorläufige Mischen kräftig.
    7. Stellen Sie die Flasche mit einem Magnetrührer auf eine Kochplatte. Stellen Sie die Hitze auf mittelhoch und zielt auf 50 ° C und die Rührgeschwindigkeit auf 1100 U / min. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit schrittweise, damit die Stange nicht vom Magneten abfliegt.
      1. 15 min erhitzen und umrühren lassen.
      2. Heben Sie die Flasche mit hitzebeständigen Handschuhen auf. Beobachten Sie, ob sich Mucinpulver aus der Lösung absetzt.
      3. Wenn Mucinpulver nicht vollständig gelöst ist, bringen Sie die Flasche für 5-minütige Intervalle zum Erhitzen / Rühren zurück, bis sie vollständig gelöst ist.
    8. Lassen Sie die Mucinmischung auf Raumtemperatur abkühlen.
  3. Biologische Mischung aus künstlichem Sputum (ASBM)
    HINWEIS: ASBM beträgt 25% des endgültigen mittleren Volumens. Bereiten Sie es am selben Tag wie die endgültige mittlere Charge vor und setzen Sie seine Komponenten im Gegensatz zu den anderen Mischungen keiner Hitze aus.
    1. Tauen Sie die 100-fache Vitaminbrühe in einem 4 °C Kühlschrank oder auf Eis auf.
      HINWEIS: Portionieren Sie den Vitaminvorrat in 10 ml Aliquots vor, um die Anzahl der Gefrier- / Auftauzyklen zu minimieren.
    2. Geben Sie 124,24 ml steriles Wasser in die leere autoklavierte 250 ml Flasche.
    3. Fügen Sie 25,76 ml 50x essentiellen Aminosäuren zu der Mischung hinzu.
    4. Fügen Sie 80,14 ml 100x nicht-essentiellen Aminosäuren in die Mischung hinzu.
    5. Fügen Sie 10 ml (aufgetauten) 100x Vitaminbrühe zu der Mischung hinzu.
    6. Fügen Sie 1 ml 1000x Spurenmetallmaterial zu der Mischung hinzu.
    7. Fügen Sie 8,33 ml 30% Eigelb-Emulsion zur Mischung hinzu.
    8. 400 μL 10 g/L Ferritin-Brühe in die Mischung geben.
    9. Mischen Sie die Lösung gut durch manuelles Schütteln.
  4. Künstliches Sputummedium (ASM)
    1. Geben Sie 250 ml ASCM in die 1 L Flasche, die ASMM enthält.
    2. Geben Sie 250 ml ASBM in die mittlere Flasche.
    3. Titrieren Sie das Medium mit einem grundlegenden MOPS-Puffer (1 M), um einen pH-Wert von 6,3 auf einem pH-Papier im engen Bereich zu erreichen. Vor der Titration ist die Mediummischung zu sauer.
    4. Kühlen Sie das resultierende künstliche Sputummedium bei 4 °C, bis es filtrationsbereit ist.
    5. Um den Filtrationsprozess zu starten, geben Sie 200 ml ungefiltertes künstliches Sputummedium in ein Vakuumfiltrationssystem mit einem 0,22 μm Porengrößenfilter.
    6. Schließen Sie das Filtersystem an die Vakuumpumpe an, schalten Sie die Vakuumpumpe ein, stellen Sie sie auf 70 mbar und stellen Sie die Kammer dann auf einen Orbitalschüttler, der bei 90 U / min in einem Kalten Raum bei 4 ° C schüttelt.
      1. Ergänzen Sie das Medium mit zusätzlichen 150 ml, da eine nennenswerte Menge gefiltert wird. Es dauert 1-2 Tage, um 1 L Medium vollständig zu filtern.
      2. Wiederholen Sie den Vorgang mit zusätzlichen Kammern, bis alle Medien gefiltert sind.
        HINWEIS: Versuchen Sie, nicht mehr als 350 ml des Mediums durch denselben 0,22 μm-Filter zu filtern, da Mucin den Filter im Laufe der Zeit verstopft.
    7. Filtriertes künstliches Sputummedium bei 4 °C bis zur Gebrauchsfertigkeit kühlen. Verwenden Sie ASM innerhalb eines Monats nach der Vorbereitung, um die besten Ergebnisse zu erzielen.

2. Sauerstoffschonung

  1. Einrichtung der Sparging-Station
    HINWEIS: Dieses Protokoll sollte nur einmal vollständig durchgeführt werden müssen, danach kann das Setup bei Bedarf durch einfache Wartung aufrechterhalten werden. Siehe Abbildung 1 für einen visuellen Schaltplan des Sauerstoffsparsystems.
    1. Besorgen und sichern Sie die Druckluft- und Sauerstofftanks ordnungsgemäß.
      VORSICHT: Hoher Druck macht die Tanks extrem gefährlich, wenn sie falsch gehandhabt werden. Stellen Sie sicher, dass die Tanks vollständig abgedichtet und gesichert sind, dass beim Schließen des Tanks keine Lecks auftreten und dass das gesamte Umschlagpersonal vollständig in ihrer Verwendung geschult ist.
    2. Befestigen Sie einen Luftregler mit einem Schraubenschlüssel am Drucklufttank. Für eine optimale Durchflussmessung am Regler befestigen Sie den Regler so nah wie möglich an einer aufrechten Position.
    3. Befestigen Sie einen Sauerstoffregler am komprimierten Sauerstofftank und befestigen Sie ihn so nah wie möglich an einer aufrechten Position. Abhängig von der Sauerstoffflasche muss man möglicherweise die Richtung zum Anziehen umkehren.
    4. Verbinden Sie den Schlauch von den Reglern mit einem Y-Stecker, um den Gasfluss aus den beiden Tanks zu kombinieren.
    5. Schließen Sie den Ausgang des Y-Steckers an das zentrale T-Sperrschichtventil an.
    6. Schließen Sie eine Seite des zentralen T-Sperrschichtventils an ein Gasmanometer an.
    7. Schließen Sie die andere Seite des Gasdruckmessgeräts an einen sterilen Spritzenfilter mit einem Durchmesser von 25 mm und einer Porengröße von 0,22 μm an.
    8. Befestigen Sie einen zweiten Spritzenfilter mit einem Durchmesser von 25 mm an einer Spritze ohne Kolben, der während des Spargings als Gasfreisetzung verwendet werden kann.
    9. Schließen Sie die letzte Seite des zentralen T-Junction-Ventils an ein zweites T-Junction-Ventil für den Sauerstoffmonitor an.
    10. Schließen Sie einen Spritzenfilter mit einem Durchmesser von 25 mm an eine Seite dieses zweiten T-Junction-Ventils an, zusammen mit einem Schlauch, um 18 G-Nadeln anzubringen.
    11. Schließen Sie die letzte Seite des zweiten T-Sperrschichtventils an die Sauerstoffüberwachungsvorrichtung an.
    12. Schließen Sie ein Trennrohr an die andere Seite der Sauerstoffüberwachungsvorrichtung an, das während der Überwachung als Gasfreisetzung verwendet werden soll.
      VORSICHT: Achten Sie beim Testen/Verwenden des Sauerstoffsparsystems sorgfältig auf die Position der T-Übergänge und stellen Sie sicher, dass sie mit dem beabsichtigten Weg durch das System übereinstimmt. Andernfalls kommt es zu einem Druckaufbau im System und dazu führt, dass Komponenten ausfallen und auseinanderfallen.
    13. Für die Wartung des Systems und um es mit optimaler Leistung arbeiten zu lassen, sind die folgenden Praktiken von Vorteil.
      1. Verstärken Sie die Verbindungen mit großzügigen Mengen an Teflonband, um ihre Abdichtung erheblich zu verbessern und die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass Komponenten vom Innendruck getrennt werden.
      2. Halten Sie die kombinierte Durchflussrate unter 10 l /min, um den maximalen Druck zu verringern und Ausfälle zu vermeiden.
      3. Wenn ein Leck vermutet wird, verwenden Sie eine Reinigungsmittellösung wie handelsübliche Flüssigkeitslecksuchgeräte, um seinen Standort leicht zu identifizieren, da er über Gaslecks sprudelt. Patchlecks mit einem Polytetrafluorethylen-Tape (z. B. Teflon).
      4. Ersetzen Sie die Spritzenfilter mit einem Durchmesser von 25 mm im Sauerstoffsparsystem alle zwei Wochen, dies variiert jedoch mit der Häufigkeit der Anwendung. Im Laufe der Zeit reduzieren Partikel, die sich im Filter verfangen, die Gasdurchflussrate und verursachen Druckaufbau.
      5. Kalibrieren Sie den Sauerstoffmonitor vor der Durchführung von Messungen auf 21% Sauerstoffdruckluft.
      6. Schalten Sie nach Abschluss des Systemeinsatzes die Tanks aus und entlüften Sie das überschüssige Gas aus den Reglern, bis der Durchfluss vollständig stoppt.
  2. Serumflaschenkultur schonend
    1. Etikettieren Sie 500 ml autoklavierte Serumflaschen mit Probenidentifikatoren, Datum/Uhrzeit der Impfung und Zielsauerstoffanteil.
    2. Geben Sie in einer biologischen Haube 24 ml des künstlichen Sputummediums zu jeder aufzustellenden Serumflasche hinzu.
    3. Geben Sie 1 ml des Mit einer 18-G-Nadel homogenisierten Auswurfs des Patienten (gegebenenfalls mit steriler Kochsalzlösung verdünnt, um für jede Kulturbedingung ein ausreichendes Probenvolumen zu erhalten) in jede Serumflasche.
    4. Legen Sie die autoklavierten Gummistopfen mit einer sterilen Pinzette auf die Oberseite jeder Serumflasche.
    5. Drücken Sie die Gummistopfen nach unten, achten Sie darauf, die Unterseite des Stopfens nicht mit den Händen zu berühren.
    6. Entfernen Sie die Flaschen von der Haube, tragen Sie die Aluminiumdichtungen auf und crimpen Sie sie. Entfernen Sie das Mittelstück von den Dichtungen.
    7. Wischen Sie die Oberseite der Flaschen mit einem Alkoholtuch ab und führen Sie sie durch eine Bunsenbrennerflamme.
    8. Befestigen Sie eine sterile 18-G-Nadel mit einem Filter auf einer taucherlosen Spritze. Setzen Sie diese Gasfreisetzung zuerst in die Flasche ein.
    9. Befestigen Sie eine sterile 18-G-Nadel am Gasausgang des Systems und führen Sie die Gasausgangsnadel ebenfalls in die Flasche ein.
    10. Leiten Sie die T-Kreuzungen von den Tanks durch den Sauerstoffmonitor. Stellen Sie sicher, dass die Zielsauerstoffkonzentration durch das System fließt. Ziel ist ein Gasdurchfluss von ca. 5 l/min.
    11. Leiten Sie die T-Übergänge von den Tanks bis zum Gasausgang um. Das Gas beginnt durch die Serumflasche zu fließen.
      VORSICHT: Achten Sie beim Sauerstoffsparen genau auf das Manometer. Wenn der Druck unerwartet ansteigt, schalten Sie das System sofort aus.
    12. 1 Min. Sauerstoff durch die Serumflasche laufen lassen. Bei 5 L/min ermöglicht dies 10 Luftwechsel und sorgt dafür, dass die Innenatmosphäre den gewünschten Partialdruck erreicht.
    13. Entfernen Sie die 18-G-Nadel mit Gasfreisetzung.
    14. Lassen Sie den Druck in der Serumflasche auf +1 Atmosphäre (2 Atmosphären auf Meereshöhe) aufbauen und entfernen Sie dann sofort die Gasausgangsnadel.
      HINWEIS: Die Aufrechterhaltung des Drucks unterstützt die Beibehaltung hyperoxischer Bedingungen im Laufe der Zeit.
    15. Legen Sie die Serumflasche bei 150 U/min in einen 37 °C Inkubator-Shaker. Inkubieren Sie die Proben für drei 24-Stunden-Intervalle. Nehmen Sie in jedem 24-Stunden-Intervall ein Aliquot für die nachgeschaltete Analyse, schonen Sie die Proben erneut und bringen Sie sie für eine Gesamtinkubationszeit von 72 h zur Inkubation zurück.
  3. Abflusssauerstoffmessung
    1. Kalibrieren Sie das Sauerstoffmessgerät auf 21% Druckluft und schalten Sie dann den Tank aus.
    2. Führen Sie die Serumflaschenaufnahme durch den Sauerstoffmonitor und befestigen Sie eine sterile Nadel am Ende.
    3. Führen Sie die Nadel durch den Gummistopfen in die Serumflasche ein.
    4. Warten Sie, bis sich der Abflusswert stabilisiert hat. Eine geringe Durchflussrate aus den Serumflaschen bedeutet, dass dies bis zu 2 Minuten dauern kann. Geben Sie die Spitzendifferenz zur Raumluft an (Zahl am weitesten von 21%).
    5. Wenn Sie mehrere Messwerte durchführen, spülen Sie das System zwischen den Messwerten mit Druckluft.

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Ergebnisse

Diese Protokolle wurden auf 50 expektorierte Sputumproben von pwCF angewendet, die einer ambulanten Mukoviszidose-Klinik am Massachusetts General Hospital in Boston, Massachusetts, zur Routineversorgung vorgelegt wurden. Das Sputum jedes Patienten wurde unter 21%, 50% und 100% Sauerstoffbedingungen unter Verwendung des künstlichen Sputummediums kultiviert, wobei 0,5 ml Aliquots aus jeder Kultur nach 24 h, 48 h und 72 h Kulturzeit zum Testen entnommen wurden. Kulturen wurden fotografiert, als Extraktionen vorgenommen wurd...

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Diskussion

In dieser Studie wurde ein In-vitro-Modell entwickelt, um die Wirkung von Hyperoxie auf mikrobielle Lungengemeinschaften zu untersuchen. Dieses Modell, das auf künstlichem Sputummedium und täglichem Sparging von Serumflaschen basiert, hält erhöhte Sauerstoffkonzentrationen aufrecht und unterstützt das Wachstum von Mikroben, die im Sputum von pwCF identifiziert wurden.

Es gibt mehrere kritische Schritte dieses Ansatzes. Erstens ist die Wahl, Filter-Sterilisation anstelle von Hitze-Ster...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Ein Teil dieser Arbeit wurde im Marine Biological Lab mit Unterstützung des Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (Fördernummer 5600373) und einem Geschenk der Simons Foundation durchgeführt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BME Vitamins (100x) LösungMilliporeSigmaB6891Konzentrierte Lösung von ergänzenden Vitaminen.
Crimpzange, 30 mmDWK Life Sciences224307Crimpzange zum Anbringen von Aluminiumdichtungen an Serumflaschen.
D-(+)-GlucoseMilliporeSigmaG7021Festes Glukosepulver (rechtsdrehendes Isomer).
Membranpumpe ME 2 NTVACUUBRAND20730003Vakuumpumpe für die Vakuumfiltration.
Eigelb-EmulsionHiMediaFD045Sterile Emulsion aus 30% Eigelb in Kochsalzlösung.
Ferritin, kationisiert ausder Milz von PferdemilzSigmaF7879Ferritin (Eisenspeicherprotein) Lösung.
FIREBOY plus Sicherheits-BunsenbrennerIntegra Biosciences144000Bunsenbrenner mit Benutzeroberfläche und Sicherheitsfunktionen.
Hydrion pH Papier (1,0– 14.0)Micro Essential Laboratory94pH-Testpapier für den Bereich von 1.0–14.0.
Hydrion pH Papier (4.0– 9.0)Micro Essential Laboratory55pH-Testpapier für den Bereich von 4.0–9.0.
Hydrion pH Papier (6.0– 8.0)Micro Essential Laboratory345pH-Testpapier für den Bereich von 6,0 bis 8,0.
Injektionsnadel-Pro EDGE Sicherheitsvorrichtung, 18 gSmiths Medical40181518 G Nadeln mit Sicherheitskappen.
Inline-ManometerMilliporeSigma20469Gasdruckmessgerät zur Überwachung des Flaschendrucks.
Innova 42 InkubationsschüttlerEppendorf2231000756Kombination Inkubator/Orbitalschüttler.
Luer-Lok Spritze mit aufgesetzter NadelBecton Dickinson309580Kombination 3 mL Spritze und 18 G Nadel.
Luer-Ventil-SortimentWorld Precision Instruments14011Ventile für Gasdurchflussschläuche.
LSE OrbitalschüttlerThermoFisher Scientific6780-NPOrbitalschüttler zum Rühren von Medien während der Filtration.
Magnesiumsulfat-HeptahydratMilliporeSigmaM2773Festes Bittersalz (Magnesiumsulfat-Heptahydrat).
Einstufiger Regler für medizinische Luft mit DurchflussmesserWestern EnterprisesM1-346-15FMLuftdurchsatzregler mit 15 L/min Meter.
MEM Aminosäuren (50x) LösungMilliporeSigmaM5550Konzentrierte Lösung aus essentiellen Aminosäuren.
MEM nicht-essentielle Aminosäuren (100x) LösungMilliporeSigmaM7145Konzentrierte Lösung aus nicht-essentiellen Aminosäuren.
Millex-GP Filter, 0,22 &Mikro; mMilliporeSigmaSLMP25SS0,22 µ M Steriler Spritzenvorsatzfilter mit Polyethersulfonmembran.
Milli-Q AcademicMilliporeSigmaZMQS60E01Milli-Q Sterilwasser-Filtersystem.
MiniOX 3000 SauerstoffmonitorMSA814365Gasdurchfluss-Sauerstoffprozentmonitor.
MOPS-Puffer (1 M, pH 9,0)Boston BioProductsBBM-90MOPS-Puffer zur Einstellung des pH-Werts von Medien.
Mucin aus SchweinemagenMilliporeSigmaM2378Mucin (glykosyliertes gelbildendes Protein) Pulver.
Natürliches Polypropylen mit WiderhakenHarvard Apparatus72-1413Verbinder für Gasdurchflussschläuche.
Nextera XT DNA-BibliotheksvorbereitungskitIlluminaFC-131-1096Vorbereitung der Bibliothek zur Identifizierung während der Sequenzierung.
NovaSeq 6000 SequenziersystemIllumina770-2016-025-NRichtrohr-Sequenzierplattform zur Generierung von Proben-Reads.
Einstufiger Sauerstoffregler mit DurchflussmesserWestern EnterprisesM1-540-15FMSauerstoffdurchflussregler mit 15 L/min Messgerät.
Sauerstoffschlauch mit 2 StandardanschlüssenSunMed2001-01Schlauch zum Anschluss von Komponenten des Gassystems.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 10x, pH 7,4Molecular Biologicals InternationalMRGF-6235Konzentrierte phosphatgepufferte Kochsalzlösung.
PC 420 Heizplatte/RührerMarshall ScientificCO-PC420Kombination Heizplatte/Rührer.
KaliumchloridMilliporeSigmaP9541Festes Kaliumchloridsalz.
PTFE-Einweg-RührstäbchenThermoFisher Scientific14-513-95Einweg-Magnetrührstäbchen.
PTFE-Gewindedichtung TeflonbandVWR470042-938Teflonband zur Verstärkung von Gassystemanschlüssen.
Q-Gard 2 AufreinigungskartuscheMilliporeSigmaQGARD00D2Aufreinigungskartusche für das Milli-Q System.
Wiederverwendbare VorratsflaschenThermoFisher Scientific06-423AFlaschen zum Mischen und Aufbewahren von Nährmedien.
Gummistopfen, 30 mm, Grau BromobutylDWK Life Sciences224100-331Gummistopfen für Serumflaschen.
Serumflasche mit geformten Graduierungen, 500 mLDWK Life Sciences223952Glasserumflaschen für die versiegelte Kultivierung.
Small Bore Extension SetBraun Medical471960Schlauchverlängerung mit Luer-Lock-Anschlüssen.
NatriumchloridMilliporeSigmaS3014Festes Natriumchloridsalz.
Spike-in-Kontrolle I (hohe mikrobielle Belastung)ZymoBIOMICSD6320Spike-in-Mikroben (I. Halotolerane und A. halotolerans) für die Berechnung der absoluten mikrobiellen Belastung
Stericup Quick Release Steriles VakuumfiltrationssystemMilliporeSigmaS2GPU02RE250 mL 0,22 &Mikro; m Vakuum-Filterkammer.
Super Sani-Cloth keimtötende EinwegtücherProfessionelle Einwegtücher InternationalH04082keimtötende Einwegtücher zur Sterilisation.
Spurenmetall-Mischung, 1000xThermoFisher ScientificNC0112668Konzentrierte Lösung physiologischer Spurenmetalle.
Ungefütterte Aluminiumdichtung, 30 mmDWK Life Sciences224187-01Aluminiumdichtungen, die über Gummistopfen gecrimpt sind.
USP Medical Grade Air TankAirgasAI USP200Drucklufttank für den Eingang zum Entstörsystem.
USP Medical Grade Sauerstofftank AirgasOX USP200Komprimierter Sauerstofftank für den Eingang zum Sparging-System.

Referenzen

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