Synthese und Charakterisierung von mRNA-beladenen Poly(beta-Aminoestern) Nanopartikeln für Impfzwecke

Zusammenfassung

Hier wird ein einfaches Protokoll zur Herstellung von mRNA-Nanopartikeln auf Basis von Poly(beta-Aminoester)-Polymeren vorgestellt, das einfach durch Änderung der verkapselten mRNA angepasst werden kann. Der Workflow für die Synthese der Polymere, der Nanopartikel und deren in vitro essentielle Charakterisierung werden ebenfalls beschrieben. Ein Proof-of-Concept zur Immunisierung wird ebenfalls hinzugefügt.

Zusammenfassung

Die Impfung ist einer der größten Erfolge der modernen Gesellschaft und unverzichtbar bei der Kontrolle und Vorbeugung von Krankheiten. Traditionelle Impfstoffe bestanden aus ganz oder aus Bruchteilen des Infektionserregers. Es bleiben jedoch Herausforderungen bestehen, und neue Impfstofftechnologien sind obligatorisch. In diesem Zusammenhang hat die Verwendung von mRNA zu Immunisierungszwecken eine verbesserte Leistung gezeigt, wie die schnelle Zulassung von zwei mRNA-Impfstoffen zeigt, die eine SARS-CoV-2-Infektion verhindern. Neben dem Erfolg bei der Prävention von Virusinfektionen können mRNA-Impfstoffe auch für therapeutische Krebsanwendungen eingesetzt werden.

Dennoch macht die Instabilität der mRNA und ihre schnelle Clearance aus dem Körper aufgrund der Anwesenheit von Nukleasen ihre nackte Abgabe nicht möglich. In diesem Zusammenhang sind Nanoarzneimittel und insbesondere polymere Nanopartikel kritische mRNA-Abgabesysteme. Ziel dieses Artikels ist es daher, das Protokoll für die Formulierung und den Test eines mRNA-Impfstoffkandidaten auf Basis der proprietären polymeren Nanopartikel zu beschreiben. Die Synthese und chemische Charakterisierung der verwendeten Poly(beta-aminoester)-Polymere, ihre Komplexierung mit mRNA zu Nanopartikeln und ihre Lyophilisierungsmethodik werden hier diskutiert. Dies ist ein entscheidender Schritt zur Senkung der Lager- und Verteilungskosten. Schließlich werden die erforderlichen Tests zum Nachweis ihrer Fähigkeit, dendritische Modellzellen in vitro zu transfizieren und zu reifen, angezeigt. Dieses Protokoll wird der wissenschaftlichen Gemeinschaft, die an der Impfung arbeitet, aufgrund seiner hohen Vielseitigkeit zugute kommen, die es diesen Impfstoffen ermöglicht, eine Vielzahl von Krankheiten zu verhindern oder zu heilen.

Einleitung

Infektionskrankheiten stellen eine ernsthafte Bedrohung für Millionen von Menschen auf der ganzen Welt dar und sind in einigen Entwicklungsländern immer noch eine der häufigsten Todesursachen. Die prophylaktische Impfung war eine der wirksamsten Interventionen der modernen Gesellschaft zur Vorbeugung und Bekämpfung von Infektionskrankheiten^1,2. Diese entscheidenden Meilensteine der Wissenschaft in der Relevanz des^20.Jahrhunderts wurden durch die jüngste weltweite Covid-19-Pandemie, die durch das SARS-CoV-2-Virus verursacht wurde, hervorgehoben³. In Anerkennung der Bedeutung e....

Protokoll

1. Synthese von pBAE-Polymer mit Endoligopeptiden (OM-pBAE)

1. Polymerisation von C6-pBAE
   1. 5-Amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-Hexylamin (38 mmol; MW = 101,19 Da) in einen Glaskolben mit rundem Boden (100 ml). Dann fügen Sie 1,4-Butandioldiacrylat (82 mmol; MW = 198,22 Da).
   2. Das Silikonölbad bei 90 °C vorheizen, den Rundkolben in das Ölbad stellen und die Mischung mit Hilfe eines Magnetrührbalkens über Nacht (~18 h) umrühren. Nehmen Sie dann das Produkt aus dem Rundkolben und legen Sie es bei -20 °C in den Gefrierschrank.
      HINWEIS: Das Produkt liegt in Form eines klebrigen Pulvers vor und wird mit Hilfe eines Spatels aus dem Kolben....

Ergebnisse

Polymersynthese und -charakterisierung
Das OM-pBAE-Syntheseverfahren ist in Abbildung 2 dargestellt. Wie Abbildung 2A zeigt, besteht der erste Schritt zur Gewinnung des OM-pBAE darin, das C6-pBAE durch Zugabe der Amine (1-Hexylamin und 5-Amino-1-pentanol, Verhältnis 1:1) zum Diakrylat (1,4-Butandioldiacrylat) zu synthetisieren. Diese Reaktion wird bei 90 °C für 20 h und unter ständigem Rühren durchgeführt. Danach wird eine Lösung von Oligopep.......

Diskussion

Nach dem Ausbruch der Covid-19-Pandemie im vergangenen Jahr hat sich die Bedeutung von Impfstoffen für die Bekämpfung von Infektionskrankheiten als kritische Komponente manifestiert⁸. Bemühungen von Wissenschaftlern weltweit haben die Markteinführung vieler Impfstoffe ermöglicht. Zum ersten Mal in der Geschichte haben mRNA-Impfstoffe ihren bisher hypothetischen Erfolg gezeigt, dank ihres schnellen Designs aufgrund ihrer Fähigkeit, sich innerhalb einiger Monate an jedes neue Antigen anzupassen

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,4-Butandiol-Diacrylat	Sigma Aldrich	123048
1-Hexylamin	Sigma Aldrich	219703
5-Amino-1-pentanol	Sigma Aldrich	411744
Aceton	Panreac	141007
CD11b-Antikörper	BD	550993
CD86-Antikörper	Bioligend	105007
Chlorhydroxhyd	Panreac	181023
Chloroform-d	Sigma Aldrich	151823
Cys-His-His-Peptid	Ontores	Custom
Cys-Lys-Lys-Peptid	Ontores	Custom
D2O	Sigma Aldrich	151882
DEPC-Reagenz für rnasefreies Wasser	Sigma Aldrich	D5758	Dieses Reagenz ist wichtig für die Behandlung von MilliQ-Wasser, um RNasen der Puffer zu entfernen:
Diethyl eter	Panreac	212770
Dimethylsulfoxid	Sigma Aldrich	276855
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
mRNA, EGFP	TriLink Technologies	L-7601
mRNA, OVA	TriLink Technologien	L-7610
RiboGreen Kit	ThermoFisher	R11490
Natriumacetat	Sigma Aldrich	71196
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Trifluoressigsäure	Sigma Aldrich	302031
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	11570626
α- Maus AlexaFluor488 Antikörper	Abcam	Ab450105
Equipment
Nanoparticle Tracking Analyzer	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer	Varian	400 MHz
ZetaSizer	Malvern Panalytical	Nano ZS	Für Zetapotenzial und hydrodynamische Größenbestimmung
SoftwareNanoSight NTA-Software
	Malvern Panalytical	MAN0515-02-DE-00
NovoExpress Software	Agilent	Nicht angegeben
ZetaSizer-Software	Malvern Panalytical	DTS Anwendung	Zur Analyse von Oberflächenladung und hydrodynamischen Größen

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