Hochdurchsatz-, robuste und hochzeitflexible Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen

Summary

Ein Hochdurchsatzprotokoll für die Oberflächensterilisation von Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) -Samen wird bereitgestellt, das die Liquid-Handling-Schritte mit einer einfachen Absaugvorrichtung, die mit einer Vakuumpumpe konstruiert ist, optimiert. Hunderte von Samenproben können an einem Tag oberflächensterilisiert werden.

Abstract

Arabidopsis ist bei weitem die Pflanzenmodellart, die am häufigsten für funktionelle Studien verwendet wird. Die Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen ist ein grundlegender Schritt, der zu diesem Zweck erforderlich ist. Daher ist es von größter Bedeutung, Arabidopsis-Samenoberflächensterilisationsmethoden mit hohem Durchsatz zu etablieren, um Dutzende bis Hunderte von Proben (z. B. transgene Linien, Ökotypen oder Mutanten) gleichzeitig zu verarbeiten. In dieser Studie wird eine Saatgutoberflächensterilisationsmethode vorgestellt, die auf der effizienten Eliminierung von Flüssigkeit in Röhrchen mit einer selbstgebauten Absaugvorrichtung basiert, die aus einer herkömmlichen Vakuumpumpe besteht. Durch die drastische Reduzierung der arbeitsintensiven Hands-on-Zeit mit dieser Methode ist die Handhabung von mehreren hundert Proben an einem Tag mit wenig Aufwand möglich. Reihen-Zeitverlaufsanalysen zeigten ferner einen hochflexiblen Zeitbereich der Oberflächensterilisation durch Aufrechterhaltung hoher Keimraten. Diese Methode könnte leicht für die Oberflächensterilisation anderer Arten von kleinen Samen mit einfacher Anpassung der Saugvorrichtung an die Samengröße und die gewünschte Geschwindigkeit zur Beseitigung der Flüssigkeit angepasst werden.

Introduction

Arabidopsis ist eine diploide Pflanzenart aus der Familie der Brassicaceae. Sein relativ kurzer Lebenszyklus (zwei Monate pro Generation unter langen Wachstumsbedingungen), die geringe Pflanzengröße und die Selbstbestäubung mit der Produktion von Hunderten von Samen pro Pflanze haben es zur ersten grundlegenden Pflanzenmodellart^{gemacht 1,2}. Darüber hinaus wurde sein Genom vollständig sequenziert^3,umfangreiche reverse genetische Werkzeuge (gesättigte T-DNA, Transposon und chemisch mutagene Populationen) sind verfügbar^4,5^,6

Protocol

1. Reagenzien und Medienvorbereitung

1. 70% ige Ethanollösung zubereiten: Fügen Sie 737 ml 95% technisches Ethanol zu 263 ml destilliertem Wasser hinzu. Gründlich mischen.
   HINWEIS: Bereiten Sie 70% ige Ethanollösung auf einem nicht sterilen Arbeitstisch vor.
   VORSICHT: Ethanol ist leicht entzündlich und kann die Augen ernsthaft reizen. Von Flammen und Wärmequellen fernhalten. Bei Kontakt mit den Augen mit reichlich Wasser abspülen.
2. 5% ige Bleichlösung zubereiten: Fügen Sie 5 ml Haushaltsbleiche (mit ~ 3,5% Natriumhypochlorit, NaClO) zu 95 ml sterilem destilliertem Wasser hinzu. Fügen Sie ein paar Tropfen nichtionisches Reinigungsmittel (z. B. Twe....

Results

Um den Zeitaufwand für das gesamte Saatgutsterilisationsverfahren zu beurteilen, wurden die Zeitunterschiede für liquid handling 96 Proben im aktuellen Protokoll berechnet und mit herkömmlichen Pipettiermethoden verglichen. Das Ergebnis zeigt, dass das aktuelle Protokoll Zeit spart und die Zeit für die Handhabung von Flüssigkeiten auf ein Viertel der Zeit mit den herkömmlichen Protokollen reduziert (Tabelle 1). Die Tabelle hebt weiter hervor, dass die Flüssigkeitsentfernungszeit im aktuellen Protokoll me.......

Discussion

Die Sterilisation von Samen ist der grundlegende Schritt für funktionelle Studien bei Arabidopsis. Obwohl es häufig für viele verschiedene Zwecke durchgeführt wird, sind begrenzte Studien zur Hochdurchsatz-Samenoberflächensterilisation bei Arabidopsis verfügbar.

Bisher ist eine der Methoden mit dem höchsten Durchsatz die Verwendung von Chlorgas, das durch Mischen von Bleichmittel mit konzentriertem HCl erzeugt wird. Obwohl diese Methode nur eine begrenzte praktische Zeit erfordert, verwendet s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquarium Ventil	Amazon	B074CYC5SD	Kit bestehend aus 2 Ventilen und dünnwandigen Schläuchen. Das Ventil verhindert, dass die Flüssigkeiten in die sterile Spitze zurückfließen
Arabidopsis Col-0 Wildtyp-Samen	Nottingham Arabidopsis Stock Center	N1093	Wildtyp-Samen (empfindlich gegenüber Kanamycin)
Arabidopsis transgene Linie AdoIspS-79 Samen	NA	NA	Transgene Linie, die ein Isoprensynthase-Gen aus Arundo donax überexprimiert, das im Col-0-Hintergrund transformiert wurde und gegen Kanamycin resistent ist (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583– 2599). Erhältlich auf Anfrage bei den Autoren
Mikrozentrifuge Eppendorf		EP022628188	Tischmikrozentrifuge zum Schleudern der Samen
Murashige & Skoog Medium mit Vitaminen	Duchefa	M0222	Standardmedium für die sterile Pflanzenkultur
Pipettensteuerung	Marke	26300	Zur Bedienung der serologischen Pipette
Polyethylen-Röhrchen 1	Roth	9591.1	Röhrchen zum Anschluss von Vakuumpumpe an Dekantierflasche (Innendurchmesser: 7 mm; Außendurchmesser: 9 mm)
Polyethylen-Röhrchen 2	Roth	9587.1	Rohr zum Anschluss von der Dekantierflasche an das Aquarienventil  (Innendurchmesser: 5 mm; Außendurchmesser: 7 mm)
Schraubverschluss mit Konnektoren	Roth	PY86.1	2-Wege-Dispenser Schraubverschluss GL45 aus Polypropylen zum Umfüllen von Flaschen
Serologische Pipette	Marke	27823	Serologische Pipette aus Messglas (wiederverwendbar). Anstelle von Shakeret al. können Einwegpipetten verwendet werden
.	Qiagen	85300	TissueLyser II Kugelmühle, die normalerweise für die Gewebehomogenisierung verwendet wird. Ohne die Zugabe von Kügelchen zu den Röhrchen funktioniert es als Shaker.
Technisches Ethanol	ITW Reagenzien (Nova Chimica Srl)	212800	Ethanol 96% v/v teilweise vergällt technische Qualität
Tween 20	Merck Millipore	655205	Nichtionisches Reinigungsmittel, das als Tensid wirkt
Universal-Schlauchverbinder	Roth	Y523.1	Kann zur Verbesserung/Vereinfachung von Schlauchverbindungen verwendet werden
Vakuumpumpe	Merck Millipore	WP6222050	Verwendet für Herstellung der Absaugvorrichtung