Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter Maus-Hepatozyten

Zusammenfassung

Fettsäure-β-Oxidation ist ein essentieller Stoffwechselweg, der für die Energieerzeugung in vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Hepatozyten, verantwortlich ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung der Fettsäure-β-Oxidation in frisch isolierten primären Hepatozyten unter Verwendung ^{von 14}C-markierter Palmitinsäure.

Zusammenfassung

Die Fettsäure-β-Oxidation ist ein wichtiger Stoffwechselweg, um den Energiebedarf der Leber zu decken und Substrate und Cofaktoren für zusätzliche Prozesse wie Ketogenese und Glukoneogenese bereitzustellen, die für die Aufrechterhaltung der Ganzkörper-Glukosehomöostase unerlässlich sind und die extrahepatische Organfunktion im nüchternen Zustand unterstützen. Die Fettsäure-β-Oxidation erfolgt in den Mitochondrien und Peroxisomen und wird durch mehrere Mechanismen reguliert, einschließlich der Aufnahme und Aktivierung von Fettsäuren, der Enzymexpression und der Verfügbarkeit von Cofaktoren wie Coenzym A und NAD ^+. In Assays, die die Fettsäure-β-Oxidation in Leberhomogenaten messen, maskieren die Zelllyse und die übliche Zugabe supraphysiologischer Cofaktorenspiegel die Auswirkungen dieser Regulationsmechanismen. Darüber hinaus ist die Integrität der Organellen in den Homogenaten schwer zu kontrollieren und kann zwischen den Präparaten erheblich variieren. Die Messung der Fettsäure- β-Oxidation in intakten primären Hepatozyten überwindet die oben genannten Fallstricke. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter primärer Maushepatozyten, die mit ¹⁴C-markierter Palmitinsäure inkubiert wurden. Durch die Vermeidung von Stunden bis Tagen der Kultur hat diese Methode den Vorteil, dass die Proteinexpressionsniveaus und die Stoffwechselwegaktivität der ursprünglichen Leber besser erhalten bleiben, einschließlich der Aktivierung der Fettsäure-β-Oxidation, die in Hepatozyten beobachtet wird, die von nüchternen Mäusen isoliert wurden, verglichen mit gefütterten Mäusen.

Einleitung

Fettsäure-β-Oxidation ist ein essentieller Prozess im Fettstoffwechsel und bietet einen katabolen Weg, um die Fettsäuresynthese und -aufnahme aus der Nahrung auszugleichen. Dieser Prozess erzeugt Energie für mehrere Organe, einschließlich des Herzmuskels, der Nierenrinde und der nüchternen Leber, und verwendet Fettsäuren, die aus der Nahrung, der Fettgewebelipolyse und den internen Triglyceridspeichern^{gewonnen werden 1,2}.

Die Oxidation von Fettsäuren durch den β-Oxidationsweg führt zur sequentiellen Verkürzung der Fettacylkette um zwei Kohlenstoffe gleichzeitig, die als Acetyl-CoA f....

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren an Mäusen (C57BL/6J, Männer, 9-11 Wochen alt) wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) der West Virginia University genehmigt.

1. Hepatozyten-Isolierung

1. Präparat
   1. Bereiten Sie in den Tagen vor der Hepatozytenisolierung die in Tabelle 1 aufgeführten Puffer und Zellkulturmedien vor. Stellen Sie ein Wasserbad mit einer Temperatur von 37 ° C in der Nähe des Ortes auf, an dem die Operation durchgeführt wird.
   2. Am Tag der Hepatozytenisolierung werden unter einer laminaren Durchflusshaube 35 ml Puffer 1 in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen und....

Ergebnisse

Die hier beschriebene Leberperfusion ergibt typischerweise 30-40 Millionen Zellen / Leber mit einer durchschnittlichen Lebensfähigkeit von 80%, wie durch den Trypanblau-Ausschluss geschätzt (Abbildung 2). Die typische Konzentration von Glucose im Krebs-Henseleit-Puffer (KHB), der zur Herstellung der Perfusionspuffer 1 und 2 verwendet wird, beträgt 11 mM. Bei der Messung der Fettsäure-β-Oxidation in Hepatozyten, die von gefasteten Mäusen isoliert wurden, kann die Glukosekonzentration im KHB g.......

Diskussion

Während der Leberdurchblutung ist es wichtig, die Einführung von Luftblasen zu vermeiden, da sie die Mikrokapillaren in der Leber blockieren, die Pufferzirkulation verhindern oder einschränken und insgesamt die Hepatozytenausbeute und Lebensfähigkeit verringern^20,21. Vorsichtsmaßnahmen, wie die genaue Inspektion der mit Puffern gefüllten Einlassleitung vor der Kanülierung des IVC und das Vermeiden des Abhebens der Einlassleitung von dem Rohr, das Puffer 1 enthält.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
(R)-(+)-Etomoxir-Natriumsalz	Tocris Bioscience	4539/10
[1-14C]-Palmitinsäure, 50– 60 mCi/mmol, 0,5 mCi/mL	Amerikanische radioaktiv markierte Chemikalien	ARC 0172A
1 M HEPES, steril	Corning	25060CI
10 & Mikro; L Einwegkapillaren/-kolben für Verdrängerpipette	Mettler Toledo	17008604
1000 µ L, 200 & Mikro; L und 10 µ L-Pipetten und -Spitzen
5 ml, 10 mL und 25 mL serologische Pipetten
50 mL sterile Zentrifugenröhrchen	CellTreat	229421
70 % Perchlorsäure	Fisher Scientific	A2296-1LB
BSA, fettsäurefrei	Fisher Scientific	BP9704100
CaCl2 Dihydrat	MilliporeSigma	223506
D-(+)-Glukose	MilliporeSigma	G7021
EGTA	Gold Biotechnologie	E-217
Ethanol	Pharmco	111000200CSPP
Filtersystem, 0,22 μ m PES-Filter, 500 ml, steril	CellTreat	229707
Gentamicinsulfat	Gold Biotechnology	G-400-25
HDPE, 6,5 mL Szintillationsfläschchen	Fisher Scientific	03-342-3
Hämozytometer
Injektionsnadeln 22 G, 1,5 Zoll	BD Biosciences	305156
Isofluran	VetOne
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
KH2PO4	MilliporeSigma	P5655
Liberase TM Research Grade	MilliporeSigma	5401119001	Definierte Mischung aus gereinigter Kollagenase I und II mit einer mittleren Konzentration von Thermolysin
M199 Medium	MilliporeSigma	M5017
MgSO4 Heptahydrat	MilliporeSigma	M1880
Mikrozentrifuge	Fisher Scientific		accuSpin Micro 17
Mikrodisparierschere	Roboz Chirurgisches Instrument Co	RS-5980
NaCl	Chem-Impex International	30070
NaHCO3	Acros Organics
Palmitinsäure	MilliporeSigma	P0500
Penicillin/Streptomycin (100x)	Gibco	15140122
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Cytiva Life Sciences	SH30256.01
Direktverdrängerpipette MR-10, 10 & micro; L	Mettler Toledo	17008575
Kühlzentrifuge mit Einsätzen für konische 50-ml-Röhrchen	Eppendorf		5810 R
Reagenzgläser aus Polypropylen-Kultur mit rundem Boden und 14 mL	Fisher Scientific	14-956-9A
Szintillationszähler	Perkin Elmer		TriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD Cocktail	Fisher Scientific	SX18-4
Schüttelwasserbad, 30 L Fassungsvermögen	New Brunswick Scientific		Modell G76
Sterile Zellsiebe, 100 & Mikro; m	Fisher Scientific	22363549
Daumenverbandzange	Roboz Chirurgisches Instrument Co	RS-8120
Trypan Blue	Corning	25900CI
Schlauchpumpe mit variablem Durchfluss	Fisher Scientific	138762
Wasserbäder, 2– 2,5 l Fassungsvermögen

502017424270010