Summary
Vetzuur β-oxidatie is een essentiële metabole route die verantwoordelijk is voor het genereren van energie in veel verschillende celtypen, waaronder hepatocyten. Hier beschrijven we een methode om vetzuur β-oxidatie te meten in vers geïsoleerde primaire hepatocyten met behulp van 14C-gelabeld palmitinezuur.
Abstract
Vetzuur β-oxidatie is een belangrijke metabole route om aan de energiebehoeften van de lever te voldoen en substraten en cofactoren te bieden voor aanvullende processen, zoals ketogenese en gluconeogenese, die essentieel zijn om de glucosehomeostase van het hele lichaam te behouden en de extra-leverorgaanfunctie in de nuchtere toestand te ondersteunen. Vetzuur β-oxidatie treedt op in de mitochondriën en peroxisomen en wordt gereguleerd door meerdere mechanismen, waaronder de opname en activering van vetzuren, enzymexpressieniveaus en beschikbaarheid van cofactoren zoals co-enzym A en NAD +. In assays die vetzuur β-oxidatie in leverhomogenaten meten, maskeren cellyse en de gemeenschappelijke toevoeging van suprafysiologische niveaus van cofactoren de effecten van deze regulerende mechanismen. Bovendien is de integriteit van de organellen in de homogenaten moeilijk te controleren en kan deze aanzienlijk variëren tussen preparaten. De meting van vetzuur β-oxidatie in intacte primaire hepatocyten overwint de bovenstaande valkuilen. Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde primaire muizenhepatocyten geïncubeerd met 14C-gelabeld palmitinezuur. Door uren tot dagen cultuur te vermijden, heeft deze methode het voordeel dat de eiwitexpressieniveaus en metabole routeactiviteit van de oorspronkelijke lever beter behouden blijven, inclusief de activering van vetzuur β-oxidatie waargenomen in hepatocyten geïsoleerd uit nuchtere muizen in vergelijking met gevoede muizen.
Introduction
Vetzuur β-oxidatie is een essentieel proces in het lipidenmetabolisme en biedt een katabole route om de vetzuursynthese en inname uit het dieet in evenwicht te brengen. Dit proces genereert energie voor meerdere organen, waaronder de hartspier, de nierschors en de nuchtere lever, en maakt gebruik van vetzuren verkregen uit het dieet, vetweefsellipolie en interne triglyceridenvoorraden 1,2.
Oxidatie van vetzuur door de β-oxidatieroute resulteert in de sequentiële verkorting van de vetacylketen door twee koolstofatomen tegelijk, vrijgegeven als acetyl-CoA, en dit proces vindt zowel in de mitochondriën als in de peroxisomen plaats. Hoewel de meeste vetzuren slechts β-oxidatie ondergaan, worden sommige geoxideerd bij verschillende koolstofatomen voordat ze deze route betreden. Bijvoorbeeld, 3-methyl-gesubstitueerde vetzuren, zoals fytaanzuur, ondergaan verwijdering van één koolstof door α-oxidatie in de peroxisomen voordat ze de β-oxidatieroute betreden. Evenzo worden sommige vetzuren eerst omgezet in dicarbonzuren door oxidatie van de terminale methylgroep (ω-oxidatie) in het endoplasmatisch reticulum voordat ze bij voorkeur worden geoxideerd in de peroxisomen door β-oxidatie3.
Ongeacht het specifieke organel, moet een vetzuur eerst worden omgezet in een co-enzym A (CoA) thioester, of acyl-CoA, om te worden geoxideerd via de β-oxidatieroute. β-oxidatie van lange-keten acyl-CoA's in de mitochondriale matrix vereist de carnitine shuttle voor hun translocatie, waar carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) de omzetting van acyl-CoA's naar acylcarnitines katalyseert en het snelheidsbeperkende enzym in dit proces is4. Eenmaal getransloceerd naar de mitochondriale matrix, worden de acyl-CoA's opnieuw gevormd en dienen ze als substraten voor de mitochondriale β-oxidatiemachines. In nuchtere toestand wordt het acetyl-CoA geproduceerd door β-oxidatie in hepatische mitochondriën voornamelijk gekanaliseerd naar ketogenese. Peroxisomen dienen als de primaire plaats voor de β-oxidatie van zeer lange keten, vertakte keten en dicarbonzuren. Peroxisomen vereisen niet dat de carnitineshuttle vetzuursubstraten importeert, maar importeert in plaats daarvan de correspondent acyl-CoA's via de activiteit van de ATP-binding cassette (ABC) transporters ABCD1-35. Binnen de peroxisomen worden acyl-CoA's vervolgens geoxideerd door een speciale set enzymen, verschillend van de mitochondriale vetzuur- β-oxidatiemachines. Zowel mitochondriën als peroxisomen vereisen ook een voorraad NAD + en vrij CoA om vette acylketens te oxideren. Het is aangetoond dat de CoA-niveaus in de lever toenemen als reactie op vasten, ter ondersteuning van de verhoogde snelheid van vetzuuroxidatie die in deze toestand optreedt6. Bovendien resulteert een verhoogde CoA-afbraak in de peroxisomen in een selectieve afname van peroxisomale vetzuuroxidatie7. Daarom wordt het proces van vetzuuroxidatie in de cel gereguleerd door de expressieniveaus en activiteiten van enzymen die betrokken zijn bij de activering, transport en oxidatie van vetzuren, evenals de concentraties van cofactoren en andere metabolieten in meerdere subcellulaire compartimenten.
Procedures met behulp van weefselhomogenaten om vetzuuroxidatie te meten, vernietigen de cellulaire architectuur die dit proces reguleert en ondersteunt, wat leidt tot een verzameling gegevens die het in vivo metabolisme niet nauwkeurig weergeeft. Hoewel technieken met behulp van vergulde primaire hepatocyten dit systeem behouden, resulteert het kweken van geïsoleerde cellen gedurende langere tijd in een verlies van het in vivo genexpressieprofiel dat aanwezig was in de cellen toen ze nog in het dier leefden 8,9. Het volgende protocol beschrijft een methode om primaire hepatocyten te isoleren en hun capaciteit voor vetzuur β-oxidatie onmiddellijk na isolatie en in suspensie te testen, met behulp van [1-14C] palmitinezuur. De test is gebaseerd op de meting van de radioactiviteit geassocieerd met de zuuroplosbare metabolieten (ASM) of producten, zoals acetyl-CoA, geproduceerd door de β-oxidatie van [1-14C]palmitinezuur10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures op muizen (C57BL/6J, mannetjes, 9-11 weken oud) werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) van de West Virginia University.
1. Hepatocytenisolatie
- Voorbereiding
- Bereid in de dagen vóór de hepatocytenisolatie de buffers en celkweekmedia voor die in tabel 1 zijn vermeld. Richt een waterbad op met de temperatuur ingesteld op 37 °C in de buurt van waar de operatie zal worden uitgevoerd.
- Breng op de dag van de hepatocytenisolatie onder een laminaire stromingskap 35 ml buffer 1 over naar een steriele centrifugebuis van 50 ml en 70 ml buffer 2 naar een steriel bekerglas of fles van 100 ml.
- Voeg antibiotica gentamicine (50 μg / ml) en penicilline / streptomycine (1x) toe aan beide buffers.
- Breng 20 ml buffer 2 zoals bereid in stap 1.1.3 over op een celkweekschaal van 100 mm en plaats op ijs.
- Breng de resterende 50 ml buffer 2 over in een steriele centrifugebuis van 50 ml. Plaats de buisjes van 50 ml met de met antibiotica aangevulde buffers 1 en 2 in een waterbad van 37 °C en laat ze minstens 15 minuten opwarmen voordat de perfusie wordt gestart.
OPMERKING: Als u meerdere hepatocytenisolaties in een sessie uitvoert, schaal dan het aantal met antibiotica aangevulde aliquots van buffers 1 en 2 op om u dienovereenkomstig voor te bereiden. - Ontdooi een aliquot collagenase-oplossing en bewaar op ijs.
OPMERKING: Indien correct bewaard, is er geen significant verlies van enzymactiviteit in collagenase-oplossingen die tot 3 keer zijn bevroren en ontdooid en binnen 3 weken na bereiding worden gebruikt. - Bereid de chirurgische instrumenten en de peristaltische pomp voor. Steriliseer de leidingen van de peristaltische pomp door 15 ml 70% ethanol te laten circuleren, gevolgd door 15 ml steriel water.
- Sluit een naald van 22 G aan op de uitgangslijn (figuur 1A). Het uitgeholde filter van een katheter werkt goed als een connector. Vul de lijnen met Buffer 1 en inspecteer de lijnen, connector en naald om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen vastzitten.
Figuur 1: Perfusieapparaat en geprikte lever. (A) Peristaltische pomp met uitlaatlijn aangesloten op de naald die wordt gebruikt om de lever te cannuleren en te perfuseren. (B) Succesvolle cannulatie wordt aangegeven door onmiddellijk en homogeen blancheren van de lever. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Leverperfusie en dissociatie
- Anesthetie een muis via isofluraaninhalatie met lucht van medische kwaliteit als dragergas, met behulp van 4% isofluraan voor inductie en 1,5% isofluraan om de anesthesie te behouden. Controleer de diepte van de anesthesie door het verlies van de pedaalreflex te beoordelen.
- Wanneer er geen reactie is op teenknijpen, plaatst u de muis in rugligging op een operatiebord, strekt u de ledematen uit en bevestigt u ze met pinnen aan het bord.
- Besproei royaal de buik en borst van de muis met 70% ethanol.
- Trek met behulp van een tang de huid en buikwand op in de buurt van de basis van de buik en snijd zijdelings, aan weerszijden van de middellijn en tot aan het middenrif, om de organen bloot te leggen.
- Stel de inferieure vena cava (IVC) bloot door de darmen naar de rechterkant te verplaatsen en de lobben van de lever voorzichtig om te draaien. Plaats een klein cilindrisch voorwerp, zoals een naalddop, onder de achterkant van de muis om de IVC enigszins te kantelen en de cannulatie te vergemakkelijken (figuur 1B).
- Start de pomp op de laagste snelheid en steek, met buffer 1 stromend, de naald in de IVC.
- Snijd de poortader om de druk te verlichten en laat bloed- en perfusiebuffers afvoeren toe, en verhoog vervolgens onmiddellijk het debiet tot 7 ml / min. Als het goed wordt gedaan, zal de lever binnen enkele seconden gelijkmatig blancheren (figuur 1B).
- Voor meer consistente resultaten houdt u de naald met de hand op zijn plaats gedurende de gehele duur van de perfusie.
- Perfuseer de lever met warme Buffer 1. Om te voorkomen dat luchtbellen ontstaan, moet u ervoor zorgen dat de lijn die in de buis met buffer 1 is geplaatst, continu onder water blijft.
- Terwijl perfusie optreedt, voegt u 130 μL collagenase-oplossing toe aan Buffer 2 en mengt u door op en neer te pipetteren of te roeren met een serologische pipet van 5 ml of 10 ml.
- Naarmate het volume in de buis met buffer 1 afneemt tot ongeveer 5 ml, voegt u langzaam 5 ml buffer 2 toe aan buffer 1 door aan de zijkant van de buis te pipetteren. Het doel is om te voorkomen dat luchtbellen in de lijn worden geïntroduceerd terwijl u overschakelt van Buffer 1 naar Buffer 2.
- Wacht tot het volume weer daalt tot 5 ml en voeg langzaam nog eens 5 ml buffer 2 toe. Herhaal dit nog één keer. Als Buffer 2 Buffer 1 vervangt en de dissociatie begint, zal de lever opzwellen.
- Voeg de resterende buffer 2 toe aan de buis die oorspronkelijk buffer 1 bevat. Stop de perfusie wanneer er nog ongeveer 5-10 ml buffer 2 in de buis zit.
OPMERKING: Terwijl Buffer 2 de lever doordringt, kan de poortader met tussenpozen gedurende 5 s met een tang worden geklemd. Deze stap is optioneel, maar de resulterende toename van de druk in de hele lever kan de dissociatie en dus de uiteindelijke hepatocytenopbrengst verbeteren. - Snijd de lever voorzichtig weg en breng deze over in de kweekschaal van 100 mm met daarin de 20 ml ijskoude Buffer 2 die in stap 1.1.4 opzij is gezet.
- Breek onder de laminaire stromingskap de lever voorzichtig uit elkaar met een chirurgische schaar en een pincet.
- Voeg ongeveer 20 ml ijskoude M199 toe aan de hepatocytensuspensie en filter deze door een celzeef van 100 μm met behulp van de zuiger van een spuit om de afgifte van extra hepatocyten uit grotere leverstukken voorzichtig te bevorderen.
- Was de kweekschaal van 100 mm en de celzeef met extra M199 totdat de opvangbuis vol is.
- Centrifugeer de suspensie bij 50 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant voorzichtig aan en resuspenseer de hepatocytenkorrel voorzichtig in 30 ml koude M199 door te draaien.
- Pelleteer de hepatocyten zoals vermeld in stap 1.2.18. Herhaal de was nog een keer.
- Resuspendeer de hepatocyten in 10 ml warme M199 en bepaal de levensvatbaarheid en opbrengst met behulp van de trypan blue exclusion methode en een hemocytometer12.
- Verdun de cellen in M199 opgewarmd tot 37 ºC tot een eindconcentratie van 1,0 x 106 levensvatbare cellen/ml en start onmiddellijk met de test.
2. Vetzuur β-oxidatietest
OPMERKING: De test wordt uitgevoerd in drievoud en elk reactiemengsel bevat 750.000 cellen, 1,35 mg /ml runderserumalbumine (BSA), 100 μM palmitinezuur en 0,4 μCi [1-14C] palmitinezuur in een eindvolume van 2 ml.
LET OP: Radioactieve verbindingen zijn gevaarlijk. Koop, behandel, bewaar en verwijder radioactief materiaal in overeenstemming met institutionele, staats- en federale voorschriften.
- Voorbereiding
- Bereid in de dagen vóór de test het palmitinezuur en de BSA-oplossingen (tabel 1) en bewaar ze bij -20 °C.
- Voltooi op de dag van de test de stappen 2.1.3-2.1.9 voordat u met de leverperfusie begint.
- Ontdooi het palmitinezuur en de BSA-oplossingen. Bereid het substraatmengsel voor op meerdere reacties plus een overschot van 20%-30%, met een typische testopstelling in tabel 2.
- Aliquot 13,5 μL BSA-oplossing per reactie in een microcentrifugebuis en warm op tot 41 °C, voeg vervolgens 1 μL van de 200 mM palmitinezuuroplossing (BSA: palmitinezuurkiesverhouding = 1:5) per reactie toe.
OPMERKING: Het verdient de voorkeur om oplossingen die zijn bereid met organische oplosmiddelen, zoals de radioactieve en niet-radioactieve palmitinezuuroplossingen, af te geven met een pipet met positieve verplaatsing en geschikte tips. - Vortex krachtig en incubeer bij 41 °C om de vorming van het oplosbare palmitinezuur: BSA-complex te vergemakkelijken. Vortex af en toe tijdens de incubatietijd.
- Het mengsel zal aanvankelijk troebel lijken, maar zal na 20-30 minuten incubatie bij 41 °C volledig verdwijnen. Houd het op 41 °C totdat het klaar is om de reacties te starten.
- Aliquot 133 μL van 1 M perchloorzuur in 1,5 ml microcentrifugebuizen om de reacties te stoppen.
LET OP: Perchloorzuur is een sterk zuur en een sterke oxidant. Geschikte beschermende uitrusting is vereist voor het hanteren van deze verbinding. - Aliquot 485,5 μL M199 per reactie in een buis en houd deze op 37 °C om het radioactieve BSA te verdunnen: palmitinezuurcomplex bereid in stappen 2.1.4-2.1.6 voordat de reacties worden gestart.
- Doseer 750 μL M199 in evenveel buizen met ronde bodem van 14 ml als de monsters. Voeg indien gewenst remmers van vetzuur β-oxidatie toe, zoals etomoxir, rotenon en antimycine, inclusief een voertuigcontrole (tabel 2).
- Breng tijdens de hepatocytenwasstappen, 10-15 minuten voordat de reacties worden gestart, de bij stap 2.1.9 bereide buizen over naar een schuddend waterbad op 37 °C en schudden bij 180-200 tpm.
- Starten, stoppen en analyseren van de vetzuur- β-oxidatiereacties
- Als de levensvatbaarheid van de hepatocyten aanvaardbaar is (doorgaans ≥ 75%, figuur 2), breng dan voor elke reactie 0,8 μL [1-14 C]palmitinezuur (0,5 mCi/ml) over naar de microcentrifugebuis die de geklaarde BSA bevat: palmitinezuuroplossing (stappen 2.1.4-2.1.6). Vortex en terug naar het waterbad bij 41 °C.
- Om de hepatocyten in evenwicht te brengen tot 37 °C en om ze vooraf te incuberen met remmers (indien aanwezig), onmiddellijk na de laatste hepatocytenreuspensie (stap 1.2.21), breng 750 μL van de hepatocytensuspensie over met een pipet van 1 ml naar elk van de 14 ml ronde bodembuizen in het schudwaterbad (stappen 2.1.9-2.1.10) en vortex kort bij lage snelheid om te mengen.
- Verdeel elke toevoeging met 30 s en incubeer gedurende 15 minuten. Om een monster te bewaren voor eiwitbepaling, brengt u nog een aliquot hepatocyten over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en draait u gedurende 5 minuten op 3.000 x g.
OPMERKING: Tijdens het doseren moet de hepatocytensuspensie continu worden gezwenkt of voorzichtig worden geroerd met de doserende pipet van 1 ml om bezinking en grote variabiliteit in het celaantal tussen monsters te voorkomen. - Verwijder het supernatant en bewaar de pellet bij -80 °C totdat het klaar is om de totale hoeveelheid eiwit in het monster te meten om de resultaten te normaliseren (figuur 3).
- Terwijl de hepatocyten onder pre-incubatie bij 37 °C zijn, voegt u het radioactieve BSA: palmitinezuurcomplex toe aan het warme medium in 2.1.8 en houdt u het op 37 °C totdat u klaar bent om de reacties te starten. Dit is de laatste substraatmix.
- Om de reacties te starten, verwijdert u de hepatocyten uit het waterbad en voegt u 500 μL substraatmengsel toe.
- Vortex op lage snelheid gedurende 5 s om de cellen volledig te resuspenderen en terug te keren naar het waterbad. Herhaal dit met alle monsters, verspringend met 30 s.
- Incubeer gedurende 15 min. Start een reeks reacties en stop onmiddellijk (zie stappen 2.2.10-2.2.11) om de achtergrondradioactiviteit te bepalen (tabel 2).
- Breng dubbele aliquots (200-250 μL) van het overgebleven substraatmengsel over naar 6 ml scintillatieflacons en zet opzij om te tellen. Gebruik deze tellingen om de radioactiviteit te berekenen die overeenkomt met de totale nmolen palmitinezuur die beschikbaar zijn voor oxidatie in 500 μL substraatmengsel.
- Om de reacties te stoppen, verwijdert u de hepatocyten uit het waterbad, resuspendeert u de hepatocyten door met matige snelheid te vortexen en brengt u vervolgens 400 μL van de hepatocytensuspensie over naar de microcentrifugebuizen die perchloorzuur bevatten.
- Sluit de buizen onmiddellijk af. Herhaal deze reeks voor alle monsters, met een snelheid van 30 s.
- Vortex de 1,5 ml microcentrifugebuizen krachtig en draai ze gedurende 10 minuten door de 1,5 ml microcentrifugebuizen bij 13.000 x g .
- Breng 300 μL van het supernatant over in een injectieflacon van 6 ml, voeg 4 ml scintillatievloeistof toe en tel de radioactiviteit in de monsters en de substraatmix aliquots (stap 2.2.9) in een scintillatieteller.
LET OP: Open na het centrifugeren de buizen onder een zuurkast om te voorkomen dat u de 14C-CO2 inademt die wordt geproduceerd door de volledige oxidatie van 14C-acetyl-CoA gegenereerd door vetzuur β-oxidatie en vrijgegeven door de zure omstandigheden.
| Buffers/mediacomponenten | Aantal | Eindconcentratie | Aanwijzingen |
| Oplossing C | |||
| Kcl | 1,79 g | 480m | Voeg water toe aan 50 ml. Bewaren bij 4 °C |
| MgSO4 heptahydraat | 1,48 g | 120m | |
| KH2PO4 | 0,81 g | 119m | |
| Krebs-Henseleit Buffer (KHB), calciumvrij | |||
| NaCl | 7,0 g | 120m | Voeg water toe aan 900 ml, stel de pH in op 7,4 en breng het uiteindelijke volume op 1 l. Bewaren bij 4 °C |
| NaHCO3 | 2,0 g | 24mM | |
| 1 M HEPES pH 7,45 | 5 ml | 5mM | |
| Glucose | 1 of 2 g | 5,6 of 11 mM | |
| Oplossing C | 10 ml | ||
| Buffer 1 | |||
| Khb | 500 ml | Meng componenten en filter steriliseer. Bewaren bij 4 °C | |
| EGTA van 50 mM | 1,0 ml | 0,1 mM | |
| Buffer 2 | |||
| Khb | 500 ml | Meng componenten en filter steriliseer. Bewaren bij 4 °C | |
| 1 M CaCl2 dihydraat | 686 μL | 1,4 mM | |
| Gentamicine oplossing | |||
| Gentamicinesulfaat | 0,5 g | 50 mg/ml | Voeg water toe aan 10 ml en filter steriliseer. Aliquot en bewaren bij -20 °C |
| Collagenase oplossing | |||
| Collagenase I en II mengen | 10 mg | 7 mg/ml | Los de volledige inhoud van de injectieflacon op in 1,43 ml water. Aliquot en bewaren bij -20 °C |
| M199 | |||
| M199 | 1 zakje | Voeg water toe aan 900 ml en stel de pH in op 7,2-7,4. Breng het uiteindelijke volume op 1 L en filtreer steriliseer. Bewaren bij 4 °C | |
| NaHCO3 | 2,2 g | 26 mM | |
| 1 M HEPES (celkweekkwaliteit) | 25 ml | 25m | |
| Extra glucose (alleen voor gevoede muizen) | 1 g | 11 mM | |
| BSA-oplossing | |||
| Vetzuurvrij BSA | 400 mg | 20% (zonder v) | Los op in 2 ml water. Aliquot en bewaren bij -20 °C |
| Niet-radioactieve palmitinezuuroplossing | |||
| Palmitinezuur | 103mg | 200m | Oplossen in 2 ml ethanol, bewaren bij -20 °C |
| 1 M Perchloorzuur | |||
| 70% Perchloorzuur | 3,5 ml | 1 meter | Verdun tot 40 ml met water. Bewaren bij kamertemperatuur |
Tabel 1: Buffers, media en andere oplossingen die nodig zijn voor de hepatocytenisolatie en de vetzuur- β-oxidatietest
| Reactienummer | M199 ± remmers | Hepatocytensuspensie (μL) | Substraatmix (μL) | ||||
| Volume (μL) | Etomoxor | ||||||
| 1 | 750 | - | Voorverwarmen bij 37 °C | 750 | Pre-incubeer bij 37 °C gedurende 15 min | 500 | Incubeer bij 37 °C gedurende 15 min |
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | + | ||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | + | Stop onmiddellijk | |||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
Tabel 2: Voorbeeld van de experimentele opstelling voor een hepatocytensuspensie getest in drievoud in aanwezigheid en afwezigheid van etomoxir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven leverperfusie levert doorgaans 30-40 miljoen cellen/lever op met een gemiddelde levensvatbaarheid van 80%, zoals geschat door trypan blue exclusion (figuur 2). De typische concentratie glucose in de Krebs-Henseleit-buffer (KHB), die wordt gebruikt om de perfusiebuffers 1 en 2 te bereiden, is 11 mM. Bij het meten van vetzuur β-oxidatie in hepatocyten geïsoleerd van nuchtere muizen, kan de concentratie van glucose in de KHB worden verlaagd om de nuchtere toestand beter weer te geven. Zoals te zien is in figuur 2, heeft het verlagen van de glucoseconcentratie tot 5,6 mM geen negatief effect op de opbrengst of levensvatbaarheid van de hepatocyten.
Tabel 2 toont een typische experimentele opstelling voor een hepatocytensuspensie getest in drievoud in de aan- en afwezigheid van etomoxir, een krachtige remmer van CPT1 en dus mitochondriale vetzuuroxidatie10,13. In aanwezigheid van deze of andere remmers van mitochondriale vetzuuroxidatie kunnen alle resterende 14C-gelabelde producten gegenereerd door [1-14C] palmitinezuuroxidatie worden toegeschreven aan de eerste cyclus van β-oxidatie in de peroxisomen. Zo kan de bijdrage van mitochondriale vetzuuroxidatie aan totale vetzuur- β-oxidatie worden berekend als het verschil tussen totale (-etomoxir) en peroxisomale (+ etomoxir) vetzuuroxidatie 7,14,15 (figuur 3).
Voor hepatocyten wordt meer dan 95% van de radioactiviteit geassocieerd met de producten van de β-oxidatie van [1-14C] palmitinezuur gevonden in de ASM, en de rest wordt vrijgegeven als 14C-CO210. De tellingen per minuut (CPM) geassocieerd met de achtergrondradioactiviteit variëren met de batch van [1-14C] palmitinezuur. Ze zijn echter nog steeds aanzienlijk lager dan de CPM die wordt verkregen in monsters die gedurende 15 minuten met het substraatmengsel mogen incuberen (figuur 3A). Zoals verwacht vertonen hepatocyten geïsoleerd uit nuchtere muizen een robuuste toename van de snelheid van zowel mitochondriaal als peroxisomaal vetzuur β-oxidatie, consistent met de bekende activering van deze routes 16,17,18,19.
Figuur 2: Levensvatbaarheid en opbrengst van hepatocyten geïsoleerd volgens de hierin beschreven procedure. Hepatocyten werden geïsoleerd uit mannelijke muizen die ad libitum werden gevoerd of 's nachts gedurende 16-18 uur vastten, met vrije toegang tot water. (A) Levensvatbaarheid van hepatocyten en (B) opbrengst per lever. Gegevens worden gerapporteerd als het gemiddelde (bars) van metingen op individuele hepatocytpreparaten (cirkels) ± SEM. Hepatocyten geïsoleerd uit gevoede en nuchtere muizen werden vergeleken met behulp van een ongepaarde tweestaartige Student's t-test. * p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vetzuur β-oxidatiecapaciteit in hepatocyten geïsoleerd van gevoede en nuchtere mannelijke muizen en getest in suspensie. Vers geïsoleerde hepatocyten werden voorgeïncubeerd met etomoxir (45 μM, +Eto) of DMSO (medium, -Eto) vóór de toevoeging van het substraatmengsel. (A) Totale CPM geïntroduceerd in elke test en teruggewonnen in de ASM-fractie van reacties die zijn opgezet om de achtergrondradioactiviteit, totaal (-Eto), peroxisomaal (+Eto) en mitochondriaal vetzuur β-oxidatie te schatten. Deze gegevens worden weergegeven voordat een correctie (voor achtergrond, celnummer of eiwitniveaus) of andere berekeningen werden toegepast. (B) Gegevens in (A) gecorrigeerd voor de achtergrond, het totale volume van de test, genormaliseerd tot 1 miljoen levensvatbare cellen en uitgedrukt als de snelheid waarmee palmitinezuur wordt geoxideerd in hepatocyten geïsoleerd uit gevoede en nuchtere muizen. (C) Totaal eiwit dat overeenkomt met de naar schatting 750 000 gebruikte hepatocyten/assay. (D) Gegevens in (A) gecorrigeerd als in (B), maar genormaliseerd tot mg eiwit. Gegevens worden gerapporteerd als het gemiddelde (bars) van metingen op individuele hepatocytpreparaten (cirkels) ± SEM. Hepatocyten geïsoleerd uit gevoede en nuchtere muizen werden vergeleken met behulp van een ongepaarde tweestaartige Student's t-test. * p < 0,05; ** p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens de leverperfusie is het van cruciaal belang om de introductie van luchtbellen te voorkomen, omdat ze de microcapillairen in de lever blokkeren, de buffercirculatie voorkomen of beperken en over het algemeen de opbrengst en levensvatbaarheid van de hepatocyten verminderen20,21. Voorzorgsmaatregelen, zoals het nauwkeurig inspecteren van de met buffer gevulde inlaatlijn vóór het cannuleren van de IVC en het vermijden van het opheffen van de inlaatlijn van de buis met Buffer 1 om over te schakelen naar Buffer 2, zoals hierin beschreven, kunnen het aantal mislukte perfusies met succes verminderen (levensvatbaarheid <70%). Het gebruik van bubbelvallen in het perfusiesysteem kan dit risico ook aanzienlijk verminderen20,21.
De collagenase-activiteit is een andere kritische parameter voor de isolatie van hepatocyten, die historisch gezien testen en optimalisatie van elke nieuwe batch vereist12,20. Het gebruik van een sterk gezuiverde en gedefinieerde mix van collagenasen vermindert de batch-to-batch variabiliteit drastisch, waardoor het niet nodig is om elke nieuwe batch te testen. Bovendien zijn, wanneer deze mengsels worden gebruikt, kleine aanpassingen in het gebruikte volume (±10-20 μL) meestal voldoende om hoge opbrengsten of levensvatbaarheid van de hepatocytpreparaten te herstellen.
Hepatocyten zijn delicate cellen. Alle resuspensie- en doseerstappen moeten voorzichtig worden uitgevoerd door langzaam te draaien of te pipetteren om afschuifschade en lysis te verminderen. Het gebruik van tips met brede boring kan ook de schade aan hepatocyten verder minimaliseren. Vortexing in stappen 2.2.2 en 2.2.7 van de test moet worden uitgevoerd op de laagst mogelijke instelling die nog steeds zorgt voor een goede menging van de componenten.
In vergelijking met de traditionele protocollen 20,21,22 is een van de belangrijkste veranderingen in de hier beschreven hepatocytenisolatieprocedure de vervanging van de intraveneuze katheterinbrenging en ligatie door het inbrengen van een hypodermische naald die door de operator op zijn plaats wordt gehouden. Deze aanpassing biedt twee belangrijke voordelen. Ten eerste vermindert het het risico op het introduceren van luchtbellen bij het aansluiten van het uiteinde van de intraveneuze katheter op de lijn, omdat de buffer al stroomt wanneer de hypodermische naald in het IVC wordt ingebracht. Ten tweede vermindert het het risico op perforatie van de IVC tijdens manipulaties van de katheter, zoals het intrekken van de naald of het vastzetten ervan met hechtingen. Een van de nadelen van deze wijziging is dat het meestal nodig is om de naald met de hand op zijn plaats te houden voor de duur van de perfusie om het consistente succes van de procedure te garanderen. Dit kan vermoeiend zijn voor de persoon die de operatie uitvoert en kan het aantal opeenvolgende perfusies beperken dat in een sessie kan worden gedaan. Om de bewegingen van de persoon die de naald vasthoudt te beperken, wat onbedoelde perforatie van de IVC kan veroorzaken, is het raadzaam om in paren te werken, waarbij één persoon de operatie uitvoert en een andere persoon de perfusiebuffers verandert zonder onderbrekingen in de perfusie. Meerdere back-to-back perfusies zouden een derde persoon vereisen om de vetzuur- β-oxidatietest te starten binnen 1-2 minuten van elke voltooide hepatocytenisolatie.
Net als bij andere hepatocytenisolatiemethoden levert de hier beschreven procedure hepatocyten op die in suspensie of in cultuur kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid aan andere leverprocessen te beoordelen, waaronder aanvullende metabole routes en veranderingen in genexpressie als gevolg van verschillende behandelingen 23,24,25. Om de hepatocyten te kweken, kunnen stappen 1.2.20-1.2.21 eenvoudig worden gewijzigd door de cellen in het juiste medium te resuspenderen, gevolgd door plating in celkweekschalen en incubatie 20,22,26. Bovendien, hoewel niet vereist voor de β-oxidatietest, kan, indien nodig door andere toepassingen, het percentage levensvatbare hepatocyten worden verhoogd door de dode cellen te verwijderen via een Percoll-laag22,26.
Concluderend beschrijft dit protocol een robuuste test om de snelheid van vetzuur β-oxidatie in intacte hepatocyten en zonder de toevoeging van exogene cofactoren te meten, waardoor de endogene regulerende mechanismen van deze route behouden blijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie R35GM119528 aan Roberta Leonardi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
References
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E.
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
- Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
- Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
- Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107 (2010).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
- Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
- Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), Pt 1 2053-2058 (1984).
- Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, Pt 1 119-122 (1997).
- Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).
- Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
- Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
- Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
- Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528 (2008).
- Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
- Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
