Mikrofluidische Herstellung von Core-Shell-Mikrokapseln mit humanen pluripotenten Stammzellsphäroiden

Kihak Gwon; Hye Jin Hong; Alan M. Gonzalez-Suarez; Gulnaz Stybayeva; Alexander Revzin

doi:10.3791/62944

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Methodenartikel

Mikrofluidische Herstellung von Core-Shell-Mikrokapseln mit humanen pluripotenten Stammzellsphäroiden

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DOI:

10.3791/62944

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13. Oktober 2021

Kihak Gwon^*¹ , Hye Jin Hong^*¹ , Alan M. Gonzalez-Suarez¹ , Gulnaz Stybayeva¹ , Alexander Revzin¹

¹Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Verkapselung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einem koaxialen Flussfokussiergerät. Wir zeigen, dass diese mikrofluidische Verkapselungstechnologie eine effiziente Bildung von hPSC-Sphäroiden ermöglicht.

Zusammenfassung

Dreidimensionale (3D) oder sphäroide Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen (hPS-Zellen) bieten die Vorteile verbesserter Differenzierungsergebnisse und Skalierbarkeit. In diesem Artikel beschreiben wir eine Strategie für die robuste und reproduzierbare Bildung von hPSC-Sphäroiden, bei der eine koaxiale Flussfokussierungsvorrichtung verwendet wird, um hPSCs in Kern-Shell-Mikrokapseln einzuschließen. Die Kernlösung enthielt Einzelzellsuspension von hPS-Zellen und wurde durch den Einbau von hochmolekularem Polyethylenglykol (PEG) und Dichtegradientenmedien viskos gemacht. Der Schalenstrom bestand aus PEG-4-Armmaleimid oder PEG-4-Mal und floss entlang des Kernstroms zu zwei aufeinanderfolgenden Ölverbindungen. Die Tröpfchenbildung erfolgte an der ersten Ölverbindung, wobei sich die Schalenlösung um den Kern wickelte. Die chemische Vernetzung der Schale erfolgte am zweiten Ölübergang durch Einbringen eines Dithiol-Vernetzers (1,4-Dithiothreitol oder DTT) in diese Tröpfchen. Der Vernetzer reagiert mit Malemid-funktionellen Gruppen über die Klickchemie, wodurch eine Hydrogelhülle um die Mikrokapseln gebildet wird. Unsere Verkapselungstechnologie produzierte Kapseln mit einem Durchmesser von 400 μm bei einer Rate von 10 Kapseln pro Sekunde. Die resultierenden Kapseln hatten eine Hydrogelhülle und einen wässrigen Kern, der es einzelnen Zellen ermöglichte, sich schnell zu Aggregaten zusammenzusetzen und Sphäroide zu bilden. Der Prozess der Verkapselung wirkte sich nicht negativ auf die Lebensfähigkeit von hPSCs aus, wobei 3 Tage nach der Verkapselung eine Lebensfähigkeit von >95% beobachtet wurde. Zum Vergleich: In festen Gel-Mikropartikeln (ohne wässrigen Kern) verkapselte hPS-Zellen bildeten keine Sphäroide und hatten 3 Tage nach der Verkapselung eine <50%ige Lebensfähigkeit. Die Sphäroidbildung von hPS-Zellen in Kernhüllen-Mikrokapseln erfolgte innerhalb von 48 h nach der Verkapselung, wobei der Sphäroiddurchmesser eine Funktion der Zellimpfdichte war. Insgesamt war die in diesem Protokoll beschriebene mikrofluidische Verkapselungstechnologie für die Verkapselung und Sphäroidbildung von hPSCs gut geeignet.

Einleitung

Aufgrund der verbesserten Pluripotenz und des Differenzierungspotenzials dieses Kulturformats ^1,2,3 besteht ein erhebliches Interesse an 3D-Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen (^hPSCs). hPS-Zellen werden typischerweise mittels Bioreaktoren, Mikrotöpfen, Hydrogelen und polymeren Gerüsten zu Sphäroiden oder anderen 3D-Kulturformaten geformt ^4,5,6. Die Verkapselung bietet eine weitere Möglichkeit, einzelne hPSCs in Sphäroide zu organisieren. Einmal verkapselte hPSC-Sphäroide könne....