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Methodenartikel

Nachweis der G-Protein-gekoppelten Rezeptorexpression in vagalen afferenten Neuronen der Maus mittels Multiplex-In-situ-Hybridisierung

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DOI:

10.3791/62945

⸱

20. September 2021

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Multiplex in situ Hybridisierung (ISH) wurde verwendet, um gleichzeitig die Transkripte für zwei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und einen Transkriptionsfaktor im gesamten vagalen ganglionären Komplex der erwachsenen Maus zu visualisieren. Dieses Protokoll könnte verwendet werden, um genaue Karten der Transkriptionsprofile von vagalen afferenten Neuronen zu erstellen.

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt ein Protokoll für die Multiplex-in-situ-Hybridisierung (ISH) der Maus-Jugular-Nodose-Ganglien, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Nachweis der Expression von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Formalin-fixierte Jugular-Nodose-Ganglien wurden mit der RNAscope-Technologie verarbeitet, um gleichzeitig die Expression von zwei repräsentativen GPCRs (Cholecystokinin- und Ghrelin-Rezeptoren) in Kombination mit einem Markergen entweder der Nodose (paarartige Homöobox 2b, Phox2b) oder jugularen afferenten Neuronen (PR-Domäne Zinkfingerprotein 12, Prdm12) nachzuweisen. Markierte Ganglien wurden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet, um die Verteilungs- und Expressionsmuster der oben genannten Transkripte zu bestimmen. Kurz gesagt, phox2b afferente Neuronen wurden gefunden, um reichlich den Cholecystokinin-Rezeptor (Cck1r) zu exprimieren, aber nicht den Ghrelin-Rezeptor (Ghsr). Es wurde auch festgestellt, dass eine kleine Untergruppe von Prdm12-afferenten Neuronen Ghsr und / oder Cck1r exprimiert. Der in diesem Artikel beschriebene Ansatz kann Wissenschaftlern helfen, genaue Karten der Transkriptionsprofile vagaler afferenter Neuronen zu erstellen.

Einleitung

Die Zellkörper der vagalen Afferenzen sind in den Jugular-, Petrosal- und Nodose-Ganglien1,2,3enthalten. Ihre Axone wandern zusammen über mehrere Äste des Vagusnervs zu den kraniozervikalen, thorakalen und abdominalen Territorien4,5,6,7. Von ihren viszeralen Enden aus können vagale Afferenzen auf eine Breite von physiologischen und schädlichen Reizen reagieren8,9,10. Die Verteilung von Signalmolekülen und Rezeptoren, die an der Vaguserfassung beteiligt sind, ist jedoch nach wie vor schlecht charakterisiert. Dies liegt zum Teil daran, dass die Vagusganglien trotz ihrer geringen Größe ein breites Spektrum von Rezeptoren exprimieren, darunter eine große Anzahl von GPCRs8,11,12,13. Darüber hinaus sind vagale afferente Neuronen von Natur aus heterogen und weisen unterschiedliche molekulare Profile auf14. Um die Sache zu komplizieren, sind die Jugular-, Petrosal- und Nodose-Ganglien in der Maus befestigt und bilden dadurch eine einzige ganglionäre Masse. Schließlich ist bei einer Untergruppe von Tieren das Knotenganglion an das sympathische Ganglion cervicalis superior15gebunden.

In der Vergangenheit haben sich die Forscher der Immunhistochemie zugewandt, um die neurochemische Zusammensetzung der vagalen afferenten Neuronen zu untersuchen16,17,18. Während die Immunhistochemie mit validierten Antikörpern nützlich ist, müssen die Ergebnisse immunhistochemischer Studien mit Vorsicht interpretiert werden. Zum Beispiel sind zahlreiche Bemühungen, spezifische Antikörper gegen GPCRs zuidentifizieren,gescheitert 19,20,21,22,23,24,25, was die Forscher zu dem Schluss führte, dass die Mehrheit der Antikörper gegen GPCRs unzuverlässig ist. Um diese Probleme zu umgehen, wurde die quantitative PCR (qPCR) weit verbreitet zur Beurteilung der Genexpression in der vagalen Ganglionmasse des Nagetiers26,27,28,29. Die Untersuchung der Genexpression mittels qPCR erfolgt jedoch auf Kosten eines Verlusts räumlicher Informationen. Insbesondere kann nicht vorhergesagt werden, wie viele Zellen oder welche Zelltypen ein bestimmtes Gen von Interesse exprimieren (z. B. Schlinge vs. Jugularzellen). Zu den wiederkehrenden Problemen gehören auch die Kontamination mit benachbarten Geweben und die Einbeziehung variabler Längen des Vagusnervs, des oberen Gebärmutterhalses und der Jugularganglien während der Dissektion15. Infolge der oben genannten Schwierigkeiten gibt es Kontroversen um die Expression und Verteilung mehrerer GPCRs in vagalen afferenten Neuronen. Ein besonders rätselhaftes Beispiel betrifft den Ghrelin-Rezeptor (Ghsr). Während einige Studien eine weit verbreitete Expression dieses Rezeptors in vagalen afferenten Neuronen30,31,32gefunden haben, haben andere festgestellt, dass Ghsr mRNA im Nodose Ganglion11,14fast nicht nachweisbar ist . Eine detaillierte Kartierung der Ghsr-mRNA in der vagalen ganglionären Masse ist daher gerechtfertigt.

Die In-situ-Hybridisierung (ISH) wurde auch verwendet, um Genexpressionsmuster in der vagalen ganglionären Masse7,11,12,33,34,35zubewerten. Da RNA-basierte Techniken unter den meisten Umständen zuverlässiger und spezifischer bleiben als Antikörper-basierte Techniken36,37, ISH-Studien haben sich als wertvoll für ein besseres Verständnis der neurochemischen Kodierung von vagalen afferenten Neuronen erwiesen. Nichtsdestotrotz sind traditionelle ISH-Techniken selbst nicht ohne Vorbehalte. Radioaktives ISH ist empfindlich, erzeugt aber Hintergrund und bleibt umständlich38. Nicht-radioaktive ISH ist weniger kompliziert, aber auch weniger empfindlich38. Im Gegensatz dazu ist die kürzlich entwickelte RNAscope ISH-Methode hochempfindlich und erzeugt minimalen Hintergrund39. Die aktuelle Studie wandte multiplex fluoreszierendes RNAscope zum Nachweis von GPCRs in vagalen afferenten Neuronen der Maus an. Wir konzentrierten uns auf die Kartierung der Verteilung von Ghsr und verglichen seine Verteilung mit der des Cholecystokinin-Rezeptors (Cck1r), einer anderen GPCR, von der bekannt ist, dass sie im Knotenganglion34exprimiert wird. Schließlich wurden die beiden Transkriptionsfaktoren, die paarartige Homöobox 2b (Phox2b) und das PR-Domänen-Zinkfingerprotein 12 (Prdm12), als selektive Marker für nodose und jugular afferente Neuronen verwendet14. Ohne die Visualisierung von Phox2b oder Prdm12 wäre es schwierig, Jugular vs. Nodose Afferents mit Sicherheit zu identifizieren. Mögliche technische Fallstricke werden ebenfalls im gesamten Artikel diskutiert.

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Protokoll

HINWEIS: Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden, waren Wildtyp-Männchen auf einem reinen C57BL / 6J-Hintergrund. Insgesamt wurden 4 Mäuse für Multiplex-ISH verwendet. Alle Mäuse waren zum Zeitpunkt des Opfers etwa 8 Wochen alt. Eine männliche Maus (etwa ein Jahr alt) wurde auch verwendet, um endogene Fluoreszenz im Zusammenhang mit dem Altern nachzuweisen. Die Tiere wurden in belüfteten Käfigen in einer Barriereeinrichtung mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Das UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee überprüfte und genehmigte die unten beschriebenen Verfahren. Details zu Reagenzien und Werkzeugen finden Sie in der Materialtabelle.

1. Probenentnahme

  1. Am Tag des Opfers eine Überdosis Chloralhydrat (500 mg/kg, i.p.) an die Mäuse verabreichen. Perfundieren Sie die tief betäubten Mäuse transkardiell mit einer peristaltischen Pumpe mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 50 ml 10% Formalin bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Dies geschieht in einem Abzug, um das Einatmen von Formalin zu verhindern.
  2. Da die Knoten-, Petrosal- und Jugularganglien in der Maus15zu einer einzigen ganglionischen Masse verschmolzen sind, sammeln Sie vorsichtig die gesamte vagale ganglionäre Masse von jeder Seite (links und rechts) mit Hilfe eines Sezierfernrohrs und einer feinen Federschere und Pinzette (siehe Materialtabelle).
  3. Wenn Sie die Maus mit einer großen Schere enthaupten (siehe Materialtabelle),vermeiden Sie es, den Hirnstamm zu zerquetschen.
  4. Nach einem zuvor bei der Ratte40beschriebenen Dissektionsansatz werden die sternohyoiden und omohyoiden Muskeln lateral zur Luftröhre mit einer kleinen Pinzette (Materialtabelle) entfernt, um den Hinterhauptbein freizulegen. Reinigen Sie die gesamte Region von Muskeln, Fettgewebe und Bindegewebe, bis die Halsschlagader, der Vagusnerv, der Hypoglossusnerv und das Foramen magnum sichtbar sind. Schneiden Sie den gesamten Hypoglossusnerv mit einer kleinen Federschere ab (Materialtabelle).
  5. Suchen Sie nach dem Schnatterganglion als durchscheinende Masse in der Nähe des Foramen magnum15. Mit einer kleinen Schere(Tabelle der Materialien)wird der Hinterhauptbein vorsichtig gebrochen, um das Halsganglion weiter freizulegen. Suchen Sie nach schwarzen Melanozyten an der Oberfläche des Jugulars als visuelle Landmarke.
  6. Schneiden Sie Nervenanhänge zwischen der vagalen ganglionären Masse ab und extrahieren Sie die gesamte ganglionäre Masse, indem Sie sanft am peripheren Ende des Vagusnervs ziehen, während Sie gleichzeitig das Jugularganglion mit einer kleinen Federschere in Richtung Hirnstamm schneiden (Materialtabelle).
  7. Entfernen Sie das Bindegewebe und das Fett, das am Vagusnerv und der ganglionären Masse haftet, so weit wie möglich.
  8. Da es leicht ist, ein Ganglion während des Transfers von einem Schlauch zum anderen zu verlieren, halten Sie ~ 0,5 cm des Vagusnervs, um die Handhabung und Lokalisierung von Proben zu erleichtern.
  9. Ganglien mit Hilfe einer feinen Pinzette in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei 4 °C 24 h in Formalin und weitere 24 h mit 30% Saccharose inkubieren.
  10. Positionieren Sie Ganglien in einem kleinen Tropfen (~ 4 mm Ø) des Mediums mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) auf einem Stück Aluminiumfolie. Als nächstes frieren Sie die Probe auf einem Trockeneisbett ein.
  11. Schneiden Sie die Proben mit einem Kryostaten bei -20 °C in Abschnitte von 14 μm Dicke und sammeln Sie sie auf Glasmikroskopobjektträgern im Abstand von 3 Serien 42 μm.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, Abschnitte nahe an den Rändern der Folie zu platzieren. Um Reagenzien zu sparen, halten Sie die Gewebeabschnitte so dicht wie möglich, aber ohne Überlappung.
  12. Lagern Sie die Proben in einem -80 °C Gefrierschrank, bis sie für ISH benötigt werden, für mindestens 6 Monate.
    HINWEIS: In Abbildung 1 finden Sie Informationen zur Fehlerbehebung bei endogener Fluoreszenz.

2. Vorbehandlung und ISH

  1. Vor dem Tag der Experimente Autoklav-Laborgläser für ISH, einschließlich Färbegeschirr und Waschen von Puffergläsern.
    HINWEIS: Während das Arbeiten unter RNase-freien Bedingungen nicht kritisch ist, tragen Sie immer Handschuhe. Halten Sie RNase Dekontaminationslösungsflaschen (Tabelle der Materialien) in Reichweite, falls eine Kontamination vermutet wird.
  2. Bringen Sie die Folien am ersten Tag auf einer speziell für die ISH gewidmeten Bank auf Raumtemperatur. Spülen Sie die Objektträger in 1x PBS und backen Sie sie 30 Minuten bei 60 °C im Backofen (Table of Materials).
  3. Fixieren Sie die Folien in 4% Formalin für 15 min bei 4 °C.
  4. Bringen Sie die Reagenzien im Multiplex-Kit (Table of Materials) auf Raumtemperatur.
  5. Dehydrieren Sie die Objektträger in 50%, 70% und 100% Ethanol für jeweils 5 min. H2O2-Lösung für 10 min auf die Proben auftragen und dann in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O)abspülen.
  6. Behandeln Sie die Proben mit dem Zielentnahmereagenz für 5 min, spülen Sie sie in ddH2O gefolgt von 100% Ethanol und trocknen Sie sie an der Luft. Erzeugen Sie mit einem hydrophoben Pen eine Barriere um die Proben.
    HINWEIS: Wenden Sie die hydrophobe Barriere nicht zu nahe an den Gewebeabschnitten an.
  7. Protease 30 min bei 40 °C in einemHybridisierungsofen auftragen( Materialtabelle ).
  8. In der Zwischenzeit die Sonden bei 40 °C vorwärmen und vor Gebrauch bei Raumtemperatur abkühlen. Inkubieren Sie die Objektträger mit der gewünschten Kombination von Zielsonden (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; oder Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) für 2 h bei 40 °C in einem Hybridisierungsofen.
  9. Negativkontrollgewebe mit der Dihydrodipicolinatreduktase (DapB) Ziel-C1-Sonde für 2 h bei 40 °C in einem Hybridisierungsofen inkubieren.
  10. Spülen Sie die Objektträger in Waschpuffer und lagern Sie sie über Nacht in 5x salzhaltigem Natriumcitrat (SSC) bei Raumtemperatur. Teilen Sie das Experiment der Einfachheit halber in zwei Tage auf. Spülen Sie am nächsten Tag die Objektträger mit Waschpuffer ab und inkubieren Sie sie mit den unten aufgeführten Amplifikationsreagenzien (siehe Benutzerhandbuch in der Materialtabelle).
  11. Amp1 (30 min bei 40 °C), AMP2 (30 min bei 40 °C) und AMP 3 (15 min bei 40 °C) auftragen. Spülen Sie den Waschpuffer zwischen den einzelnen Schritten ein.
  12. Lösen Sie jeden Opalfarbstoff (Materialtabelle) in Dimethylsulfoxid auf und lagern Sie die Lösungen bei 4 °C, bis sie benötigt werden.
  13. Für Kanal 1 die Objektträger mit HRP-C1 (15 min bei 40 °C) und Opal 520 (grüne Farbe; Verdünnung 1/1.500; 30 min bei 40°C) inkubieren. Spülen Sie den Waschpuffer zwischen den einzelnen Schritten ein.
  14. Für Kanal 2 werden die Objektträger mit HRP-C2 (15 min bei 40 °C) und Opal 570 (gelbe Farbe; Verdünnung 1/1.500; für 30 min bei 40 °C) inkubiert. Spülen Sie den Waschpuffer zwischen den einzelnen Schritten ein.
  15. Für Kanal 3 werden die Objektträger mit HRP-C3 (15 min bei 40 °C) und Opal 690 (fernrote Farbe; Verdünnung 1/1.500; für 30 min bei 40 °C) inkubiert. Spülen Sie den Waschpuffer zwischen den einzelnen Schritten ein.
  16. Die Objektträger waschen und 30 s lang 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) aussetzen.
  17. Tragen Sie sofort das Befestigungsmedium auf jeden Objektträger auf und legen Sie einen Deckglas über den Gewebeabschnitt.
  18. Halten Sie das Gewebe horizontal in einem Objektträgerhalter bei 4 °C bis zur Bildgebung.

3. Mikroskopie und Datenanalyse

HINWEIS: Multiplex-ISH-Daten können mit einer Vielzahl von Instrumenten mit den entsprechenden Filtern abgebildet werden. Ein bevorzugtes bildgebendes Verfahren ist jedoch die konfokale Mikroskopie mit 20-fachen und 63-fachen (Öl-)Objektiven; beziehen Sie sich auf die Diskussion für die Gründe. Die Bestimmung des optimalen Signal-Rausch-Verhältnisses ist Abbildung 2 zu entnehmen.

  1. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, das mit 488,561 und 633 nm Laserlinien ausgestattet ist. Verwenden Sie die folgenden Erfassungsparameter (siehe Tabelle 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, Erfassungsbereich 668-696 nm, Leistung 2.0, Verstärkung 724); Opal 570 (DPSS-Laser 561 nm, Erfassungsbereich 579-627 nm,
  2. Um die Qualität der Bilder zu verbessern, erfassen Sie mit einer Linienmittelung von 4 und einer Pixelgröße von mindestens 1024 x 1024.
    HINWEIS: Die oben genannten Parameter werden nur als Beispiel angegeben, und Modifikationen werden in Abhängigkeit von einem Instrument, Vergrößerung (20x oder 63x), Expressionsniveaus und endogenen Fluoreszenzwerten für ein bestimmtes Gewebe empfohlen.
  3. Sobald Sie mit den Aufnahmeparametern zufrieden sind, sammeln Sie Bilder mit den gleichen Einstellungen. Weisen Sie jedem Kanal falsche Farben zu, um die Visualisierung zu erleichtern.
    HINWEIS: Zum Beispiel Rot (Phox2b oder Prdm12), Cyan (Cck1r), Gelb (Ghsr) und Grau (DAPI).
  4. Führen Sie die Zellzählung anhand der digitalen Bilder durch, indem Sie die Umrisse von RNAscope-positiven Profilen mit einem Kern identifizieren, der leicht mit DAPI gefärbt ist. Berechnen Sie den Prozentsatz der RNAscope-positiven Profile, die jedes Transkript ausdrücken [Abbildung 3A-C].
  5. Um die Genauigkeit und Genauigkeit der Schätzungen zu verbessern, zählen Sie mindestens 2.000 neuronale Profile von mindestens 4 verschiedenen Tieren. Führen Sie die Zählung von linken und rechten Ganglien getrennt durch.
  6. Geben Sie die Daten in ein Kreisdiagramm mit der Gesamtzahl der gezählten Profile ein.
  7. Verwenden Sie Imaging-Software, um Bilder zu erfassen und 20-fache Bilder zusammenzusetzen. Verwenden Sie ImageJ-Fiji und eine andere Foto- und Designsoftware, um die endgültigen Platten zu generieren. Wenden Sie Anpassungen an Kontrast und Helligkeit gleichmäßig auf alle Bilder an.

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Ergebnisse

Während RNAScope bei Tieren jeden Alters, Geschlechts oder genetischen Hintergrunds angewendet werden kann, ist es ratsam, mit jungen Erwachsenen (<3 Monate alt) zu arbeiten. Dies liegt daran, dass fluoreszierende Artefakte (z. B. Lipofuscin) häufige Befunde in Neuronen älterer Tiere sind41. Die formalinfixierten Ganglien älterer Mäuse enthalten oft eine überraschend intensive endogene Fluoreszenz, die leicht mit einer echten Färbung verwechselt werden kann (Abbildung 1A

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Diskussion

Die Technik der ISH wurde in den späten 1960er Jahren erfunden42. Erst Mitte der 1980er Jahre wurde es jedoch zum Nachweis von mRNAs im zentralen und peripheren Nervensystem eingesetzt43,44. In Anbetracht der Heterogenität des Nervensystems und wiederkehrender Probleme mit Antikörpern bleibt die Lokalisierung eines bestimmten Transkripts auf zellulärer Ebene ein unschätzbares Werkzeug. Dennoch sind die traditionellen ISH-Methoden mühsam un...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core unterstützt, der durch den NIH-Zuschuss #5P01DK119130-02 finanziert wurde. Die Autoren möchten die Unterstützung der UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (unter der Leitung von Dr. Phelps) und ihrer Mitarbeiter (Abhijit Bugde und Marcel Mettlen) würdigen, die zum Teil durch den NIH Grant #1S10OD021684-01, eine gemeinsame Ressource des Harold C. Simmons Cancer Center, unterstützt zum Teil durch einen NCI Cancer Center Support Grant, unterstützt wird. P30 CA142543.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10x PBSFisher ScientificBP399-4
20x SSCInvitrogenAM9763-80
° C GefrierschrankPHCBIMDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021AdobeFoto- und Designsoftware
Thermo ScientificModell:658
Konfokales MikroskopZeissLSM880 Airyscan
DeckglasBrain Research Laboratories2460-1.5D
KryostatLeicaCM 3050 S
Dumont #5 PinzetteF.S.T.11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897LEindeckmedium
HybEZ OfenHybridisierungsofen
HydrophoberStift Vector LaboratoriesH-4000
ImageJ-FijiNIH
Große SchereHenry Schein100-7561
MikrozentrifugenröhrchenVWR20170-333
Minipumpe mit variablem DurchflussFisher Scientific13-876-1
Opal 520Akoya biosciencesFP1 1487001KTFluoreszierender Biomarker
Opal 570Akoya biosciencesFP1 1488001KTFluoreszierender Biomarker
Opal 690Akoya biosciencesFP1 1497001KTFluoreszierender Biomarker
ProLong Gold Antifade EindeckmittelEindeckmedium für fluoreszenzmarkierte Zellen
RNAscope Multiplex Fluoreszierendes Reagenzienkit v2ACD /Bio-Techne323100Multiplex-Kit
RNAscope Sonde Maus Cck1r-C3ACD /Bio-Techne313751-C3
RNAscope Sonde Maus DapBACD /Bio-Techne310043
RNAscope Sonde Maus GhsrACD /Bio-Techne
RNAscope Sonde Maus Phox2b-C2ACD /Bio-Techne407861-C2
RNAscope Sonde Maus Prdm12-C2ACD /Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020Rnase Dekontaminationslösung
Kleine PräparierschereMillipore SigmaZ265977
Superfrost Plus ObjektträgerFisherbrand1255015
Tissue Tek OCT mediumSakura4583
BedienungsanleitungACD323100 USM
Vannas FederschereRobozRS 5620
ZEN Imaging SoftwareZeiss
Backofen 426141

Referenzen

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G Protein gekoppelte RezeptorenMultiplex ISHJugularnodose GanglienRNAscope TechnologieKonfokalmikroskopieCholecystokinin RezeptorGhrelin RezeptorPhox2b Marker
Nachweis der G-Protein-gekoppelten Rezeptorexpression in vagalen afferenten Neuronen der Maus mittels Multiplex-In-situ-Hybridisierung
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