Methodenartikel

Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse

DOI:

10.3791/62977

⸱

7. Dezember 2021

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1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll stellt zwei Techniken vor, um die subzellulären Kompartimente von murinen Stäbchen-Photorezeptoren für die Proteinanalyse zu isolieren. Die erste Methode verwendet lebendes Netzhaut- und Zellulosefilterpapier, um die äußeren Segmente der Stäbchen zu trennen, während die zweite Methode lyophilisierte Netzhaut und Klebeband verwendet, um die inneren und äußeren Segmentschichten der Stäbchen abzuziehen.

Zusammenfassung

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Stäbchen-Photorezeptoren sind hochpolarisierte sensorische Neuronen mit unterschiedlichen Kompartimenten. Mausstäbchen sind lang (~80 μm) und dünn (~2 μm) und sind seitlich in der äußersten Schicht der Netzhaut, der Photorezeptorschicht, verpackt, was zu einer Ausrichtung analoger subzellulärer Kompartimente führt. Traditionell wurde der tangentiale Schnitt der gefrorenen, flach montierten Netzhaut verwendet, um die Bewegung und Lokalisation von Proteinen in verschiedenen Stäbchenkompartimenten zu untersuchen. Die hohe Krümmung der stäbchendominanten Mausnetzhaut macht die tangentiale Sektionierung jedoch zu einer Herausforderung. Motiviert durch die Untersuchung des Proteintransports zwischen Kompartimenten haben wir zwei Peeling-Methoden entwickelt, die das äußere Stäbchensegment (ROS) und andere subzelluläre Kompartimente für westliche Blots zuverlässig isolieren. Unsere relativ schnellen und einfachen Techniken liefern angereicherte und subzellulär-spezifische Fraktionen, um die Verteilung und Umverteilung wichtiger Photorezeptorproteine in normalen Stäbchen quantitativ zu messen. Darüber hinaus können diese Isolationstechniken auch leicht angepasst werden, um die Proteinzusammensetzung anderer Zellschichten sowohl in gesunden als auch in degenerierenden Netzhäuten zu isolieren und quantitativ zu untersuchen.

Einleitung

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Stäbchen-Photorezeptorzellen, dicht gepackt in der äußersten Schicht der neuronalen Netzhaut, sind ein integraler Bestandteil des Dimmlichts. Um als treue Photonenzähler zu fungieren, verwenden Stäbchen einen G-Protein-basierten Signalweg, der als Phototransduktion bezeichnet wird, um schnelle, verstärkte und reproduzierbare Reaktionen auf den Einfang einzelner Photonen zu erzeugen. Diese Reaktion auf Licht löst letztendlich eine Änderung des Stroms an der Plasmamembran aus und wird anschließend dem Rest des visuellen Systems signalisiert1. Wie der Name schon sagt, hat jede Stäbchenzelle eine ausgeprägte stäbchenartige Form und weist eine stark....

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Protokoll

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Alle Experimente wurden gemäß den lokalen institutionellen Richtlinien des Ausschusses für Forschung Tierpflege der University of Southern California (USC) durchgeführt.

1. Lebendzell-Netzhautpeeling-Methode

  1. Zubereitung von Ames' Puffern, Peelingpapieren und Sezierschale
    1. Schneiden Sie das Zellulosefilterpapier (Grade 413) mit stumpfer Spitze (oder einem gleichwertigen Scherentyp) in Rechtecke mit den Maßen ca. 5 mm x 2,5 mm. Lagern Sie die Stecklinge für die zukünftige Verwendung.
    2. Bereiten Sie 1 l HEPES-Puffer von Ames vor, indem Sie eine Flasche Ames' Medium, 2,38 g HEPES und 0,877 g NaCl kombi....

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Ergebnisse

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Die vorliegenden Strategien wurden entwickelt, um relativ schnelle und einfache Methoden zur Isolierung und Analyse von Proteinen unter spezifischen subzellulären Stäbchenkompartimenten für die Western-Blot-Analyse bereitzustellen. Wir wandten zwei sequentielle Peeling-Techniken (Abbildung 1 und Abbildung 2) an, gefolgt von Immunoblotting, um zu zeigen, dass diese Methoden zuverlässig verwendet werden können, um die bekannte Verteilung von Stäbchentransducin (GN.......

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Diskussion

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Viele Netzhauterkrankungen betreffen Stäbchen-Photorezeptorzellen, was zum Tod des Stäbchens und letztendlich zum vollständigen Verlust des Sehvermögens führt37. Ein bedeutender Teil der genetischen und mechanistischen Ursprünge der menschlichen Netzhautdegeneration wurde im Laufe der Jahre in zahlreichen Mausmodellen erfolgreich rekapituliert. In diesem Zusammenhang würde die Fähigkeit, einzelne subzelluläre Stäbchenkompartimente einfach und selektiv von der kleinen Mausnetzhaut zu trennen, unser.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von NIH Grant EY12155, EY027193 und EY027387 to JC unterstützt. Wir danken Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) und Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) für das Korrekturlesen des Manuskripts. Wir möchten uns auch bei Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) und Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) für die Bereitstellung der notwendigen Ausrüstung bedanken, um das vom Autor bereitgestellte Filmmaterial zu sammeln. Material aus: Kasey Rose et al, Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, veröffentlicht [2017], [Springer Nature].

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 mL Labor- oder Medienflasche ausgestattet mit einem SchlauchdeckeladapterN/AN/A
100% O2 TankN/AN/A
1000mL Flaschenaufsatzfilter, PES Filtermaterial, 0,22 μ mGenesee Scientific25-235
4X SDS ProbenpufferMillipore Sigma70607-3
50 mL Falcon TubeFisher Scientific14-432-22
95% O2 und 5% CO2 TankN/AN/A
Ames' Medium mit L-Glutamin, ohne BicarbonatSigma-AldrichA1420
CaCl2 (99%, Dihydrat)SigmaC-3881
Drierit (wasserfreies Calciumsulfat, >98% CaSO4, >2% CoCl2)WA Hammond Drierite Co LTD21005
Falcon Easy-Grip Petrischale (Polystyrol, 35 x 10 mm)Falcon-Corning08-757-100A
Falcon Easy-Grip Gewebekulturschale (60 x 15 mm)Falcon-Corning08-772F
Federskalpell (Nr. 10, 40 mm)VWR100499-578
Federskalpell (Nr. 11, 40 mm)VWT100499-580
KCl (99%)SigmaP-4504
Kimble Kontes PelletstößelSigmaz359971
Labconco SchnellgefrierkolbenLabconcoN/A
LN2 (flüssiger Stickstoff) + Dewarkolben oder ähnlicher VakuumkolbenN/AN/A
MgCl2SigmaM-9272
Milli-Q/entionisiertes WasserEMD MilliporeN/A
Na2HPO4 (Pulver)J.T. Baker4062-01
NaCl (Kristall)EMD MilliporeSx0420-3
NaHCO3Amresco0865
OmniPur EDTAEMD4005
OmniPur HEPES, freie SäureEMD5320
Parafilm MSigma-AldrichP7793
Reynolds Wrap AluminiumfolieReynolds BrandsN/A
Scotch Magic Tape (12,7 mm x 32,9 m)Scotch-3MN/A
NatriumdesoxycholatSigma-AldrichD67501
Spectrafuge MinizentrifugeLabnet International, IncC1301
Gewebeinkubationskammer (gekauft oder Sonderanfertigung)N/AN/A
Tris-HClJ.T.Baker4103-02
Triton X-100Signma-AldrichT8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilisator oder gleichwertige MaschineSP ScientificN/A
VWR Grade 413 Filerpapier (Durchmesser 5,5 cm, Porengröße 5 μ m)VWR28310-015
Whatman Grade 1 Qualitatives Filterpapier (Durchmesser 9 cm, Porengröße 11 μ m)Whatman/GE Healthcare1001-090
Transferpipette mit breiter Bohrung, Global ScientificVWR76285-362

Referenzen

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  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Photoreceptor IsolationRod Outer SegmentRetina PeelingProtein AnalysisMouse RetinaSubcellular CompartmentTape Peeling MethodLyophilization TechniqueWestern BlotPhotoreceptor Proteins

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