Methodenartikel

Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse

DOI:

10.3791/62977

⸱

7. Dezember 2021

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll stellt zwei Techniken vor, um die subzellulären Kompartimente von murinen Stäbchen-Photorezeptoren für die Proteinanalyse zu isolieren. Die erste Methode verwendet lebendes Netzhaut- und Zellulosefilterpapier, um die äußeren Segmente der Stäbchen zu trennen, während die zweite Methode lyophilisierte Netzhaut und Klebeband verwendet, um die inneren und äußeren Segmentschichten der Stäbchen abzuziehen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stäbchen-Photorezeptoren sind hochpolarisierte sensorische Neuronen mit unterschiedlichen Kompartimenten. Mausstäbchen sind lang (~80 μm) und dünn (~2 μm) und sind seitlich in der äußersten Schicht der Netzhaut, der Photorezeptorschicht, verpackt, was zu einer Ausrichtung analoger subzellulärer Kompartimente führt. Traditionell wurde der tangentiale Schnitt der gefrorenen, flach montierten Netzhaut verwendet, um die Bewegung und Lokalisation von Proteinen in verschiedenen Stäbchenkompartimenten zu untersuchen. Die hohe Krümmung der stäbchendominanten Mausnetzhaut macht die tangentiale Sektionierung jedoch zu einer Herausforderung. Motiviert durch die Untersuchung des Proteintransports zwischen Kompartimenten haben wir zwei Peeling-Methoden entwickelt, die das äußere Stäbchensegment (ROS) und andere subzelluläre Kompartimente für westliche Blots zuverlässig isolieren. Unsere relativ schnellen und einfachen Techniken liefern angereicherte und subzellulär-spezifische Fraktionen, um die Verteilung und Umverteilung wichtiger Photorezeptorproteine in normalen Stäbchen quantitativ zu messen. Darüber hinaus können diese Isolationstechniken auch leicht angepasst werden, um die Proteinzusammensetzung anderer Zellschichten sowohl in gesunden als auch in degenerierenden Netzhäuten zu isolieren und quantitativ zu untersuchen.

Einleitung

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Stäbchen-Photorezeptorzellen, dicht gepackt in der äußersten Schicht der neuronalen Netzhaut, sind ein integraler Bestandteil des Dimmlichts. Um als treue Photonenzähler zu fungieren, verwenden Stäbchen einen G-Protein-basierten Signalweg, der als Phototransduktion bezeichnet wird, um schnelle, verstärkte und reproduzierbare Reaktionen auf den Einfang einzelner Photonen zu erzeugen. Diese Reaktion auf Licht löst letztendlich eine Änderung des Stroms an der Plasmamembran aus und wird anschließend dem Rest des visuellen Systems signalisiert1. Wie der Name schon sagt, hat jede Stäbchenzelle eine ausgeprägte stäbchenartige Form und weist eine stark polarisierte zelluläre Morphologie auf, die aus einem äußeren Segment (OS), einem inneren Segment (IS), einem Zellkörper (CB) und einem synaptischen Terminal (ST) besteht. Jedes subzelluläre Kompartiment hat spezifische Proteinmaschinen (membrangebunden und löslich), biomolekulare Merkmale und Proteinkomplexe, die eine entscheidende Rolle spielen, wie visuelle Phototransduktion, allgemeine Haushaltsführung und Proteinsynthese sowie synaptische Übertragung2,3.

Vor über 30 Jahren wurde erstmals die lichtabhängige reziproke Bewegung subzellulärer Proteine, insbesondere Transducin (weg vom OS) und Arrestin (in Richtung OS), beobachtet4,5,6,7. Schon früh wurde dieses beobachtete Phänomen mit Skepsis aufgenommen, was zum Teil auf die Anfälligkeit der Immunhistochemie für die Epitopmaskierung zurückzuführen ist8. In den frühen 2000er Jahren wurde die stimulusabhängige Proteintranslokation durch die Verwendung einer rigorosen und mühsamen physikalischen Schnitttechnik bestätigt9. Serielle tangentiale Abschnitte der gefrorenen flach montierten Nagetiernetzhaut, gefolgt von Immunoblotting, zeigten, dass Transducin9,10, Arrestin11,12 und Recoverin13 alle eine subzelluläre Umverteilung als Reaktion auf Licht erfahren. Es wird angenommen, dass die lichtgetriebene Translokation dieser wichtigen Signalproteine nicht nur die Empfindlichkeit der Phototransduktionskaskade reguliert9,14,15, sondern auch neuroprotektiv gegen Lichtschäden16,17,18 sein kann. Da der lichtgetriebene Proteintransport in Stäbchen für die Biologie und Physiologie der Stäbchenzellen von großer Bedeutung zu sein scheint, sind Techniken, die die Isolierung verschiedener subzellulärer Kompartimente zur Bestimmung der Proteinverteilung ermöglichen, wertvolle Forschungsinstrumente.

Derzeit gibt es einige Methoden, die darauf abzielen, die subzellulären Kompartimente des Stäbchens zu isolieren. Diese Methoden können jedoch langwierig und schwer zu reproduzieren sein oder eine beträchtliche Menge an Netzhautisolat erfordern. ROS-Präparate (Rod Outer Segment) über Dichtegradientenzentrifugation19 werden beispielsweise häufig verwendet, um das ROS vom retinalen Homogenat zu trennen. Diese Methode wird häufig für Western Blot verwendet, aber das Verfahren ist sehr zeitaufwendig und erfordert mindestens 8-12 murine Retinae20. Auf der anderen Seite wurde die serielle tangentiale Schnittführung von gefrorenen murinen und Rattennetzhaut erfolgreich bei der Isolierung von OS, IS, CB und ST9,11,13 implementiert. Diese Methode ist jedoch technisch anspruchsvoll, da die kleine und stark gekrümmte murine Netzhaut vollständig abgeflacht werden muss, um die Netzhautschichten vor dem tangentialen Schnitt auszurichten. Da es eine Fülle von Mausmodellen und transgenen Mäusen gibt, die Krankheiten des visuellen Systems rekapitulieren, ist die Schaffung einer Technik, die zuverlässig, schnell und einfach einzelne Stäbchenkompartimente trennt, vielversprechend, um die physiologischen Prozesse aufzudecken, die in jedem spezialisierten Kompartiment auftreten, und die Mechanismen, die visuellen Prozessen in Gesundheit und Krankheit zugrunde liegen.

Um diese Untersuchungen zu erleichtern, beschreiben wir zwei Peeling-Methoden, die subzelluläre Kompartimente von Stäbchen leichter isolieren als aktuelle Protokolle. Die erste Peeling-Methode, die von einer Technik zur Freilegung fluoreszierend markierter bipolarer Zellen für die Aufzeichnung von Patch-Clampen21 angepasst wurde, verwendet Zellulosefilterpapier, um das ROS nacheinander aus einer lebenden, isolierten murinen Netzhaut zu entfernen (Abbildung 1). Die zweite Methode, angepasst an ein Verfahren, das die drei primären retinalen Zellschichten von einer Chick22- und frog23-Netzhaut isoliert, verwendet Klebeband, um das ROS- und Stäbcheninnensegment (RIS) von einer lyophilisierten Netzhaut zu entfernen (Abbildung 2). Beide Verfahren können in 1 h abgeschlossen werden und sind erheblich benutzerfreundlich. Wir bieten eine Validierung der Wirksamkeit dieser beiden Trennprotokolle für Western Blot, indem wir dunkel angepasste und lichtexponierte Netzhaut von C57BL/6J-Mäusen verwenden, um die lichtinduzierte Translokation von Stäbchentransducin (GNAT1) und Arrestin (ARR1) zu demonstrieren. Darüber hinaus liefern wir mit der Tape-Peeling-Methode zusätzliche Beweise dafür, dass unsere Technik verwendet werden kann, um Inkonsistenzen zwischen Proteinlokalisierungsdaten, die durch Immunzytochemie (ICC) und westliche Blots gewonnen wurden, zu untersuchen und zu beheben. Insbesondere zeigte unsere Technik, dass: 1) die Proteinkinase C-alpha (PKCα) Isoform nicht nur in bipolaren Zellen, sondern auch in murinem ROS und RIS vorhanden ist, wenn auch in niedrigen Konzentrationen24,25, und 2) Rhodopsinkinase (GRK1) ist überwiegend in der isolierten OS-Probe vorhanden. Diese Daten zeigen die Wirksamkeit unserer beiden Peeling-Techniken zur Trennung und Quantifizierung spezifischer Stäbchen- und Netzhautproteine.

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Protokoll

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Alle Experimente wurden gemäß den lokalen institutionellen Richtlinien des Ausschusses für Forschung Tierpflege der University of Southern California (USC) durchgeführt.

1. Lebendzell-Netzhautpeeling-Methode

  1. Zubereitung von Ames' Puffern, Peelingpapieren und Sezierschale
    1. Schneiden Sie das Zellulosefilterpapier (Grade 413) mit stumpfer Spitze (oder einem gleichwertigen Scherentyp) in Rechtecke mit den Maßen ca. 5 mm x 2,5 mm. Lagern Sie die Stecklinge für die zukünftige Verwendung.
    2. Bereiten Sie 1 l HEPES-Puffer von Ames vor, indem Sie eine Flasche Ames' Medium, 2,38 g HEPES und 0,877 g NaCl kombinieren. Lösen Sie die Reagenzien in einer sterilen Glasflasche mit destilliertem Reinstwasser auf und stellen Sie die Osmolarität und den pH-Wert auf 280 mOsm bzw. 7,4 ein. Zum Sterilisieren filtern (Porengröße 0,2 μm), den Deckel mit Paraffinfolie verschließen und bei 4 °C lagern.
    3. Bereiten Sie 1 l Ames' Bicarbonatpuffer vor, indem Sie eine Flasche Ames' Medium und 1,9 g NaHCO3 kombinieren. Lösen Sie die Reagenzien in einer sterilen Glasflasche mit destilliertem Reinstwasser auf und stellen Sie die Osmolarität und den pH-Wert auf 280 mOsm bzw. 7,4 ein. Zum Sterilisieren filtern (Porengröße 0,2 μm), den Deckel mit Paraffinfolie verschließen und bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Die BICARBONATPUFFER von Ames und Ames können im Voraus vorbereitet und 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
    4. Erstellen Sie am Boden einer 35 x 10 mm großen Petrischale ein Gitter- oder Schachbrettmuster mit einem Skalpell (Klinge Nr. 11, 40 mm).
      HINWEIS: Der strukturierte Boden der Petrischale hält das isolierte, frei schwebende Auge während der Netzhautdissektion an Ort und Stelle.
  2. Dissektion der Netzhaut
    HINWEIS: Für dieses Verfahren sollte der Puffer gebracht und bei Raumtemperatur (RT) aufbewahrt werden. Erfrischen Sie den Bicarbonatpuffer von Ames während der Dissektion alle 15 Minuten mit frischem karbogeniertem Ames-Bicarbonatpuffer. Dadurch bleibt der notwendige physiologische pH-Wert erhalten.
    1. Etwa 15-20 Minuten vor der Dissektion den HEPES-Puffer von Ames in einer 100-ml-Labor- oder Medienflasche, die mit einem Schlauchverschlussadapter ausgestattet ist, mit Sauerstoff versorgen und den Ames-Bicarbonatpuffer mit 95% O2 und 5% CO2 in einer Gewebeinkubationskammer und in einer 100-ml-Labor- oder Medienflasche mit einem Schlauchverschlussadapter blasen.
    2. Euthanasieren Sie eine gleiche Anzahl beider Geschlechter von C57BL / 6J-Mäusen (2-3 Monate alt), entweder durch Isofluran-Inhalation oder Kohlendioxid (CO2), gefolgt von zervikaler Dislokation. Enukleieren Sie die Augen mit einer gebogenen Schere und legen Sie die Augen in die strukturierte 35 x 10 mm große Petrischale, die mit dem Bicarbonatpuffer von Ames gefüllt ist.
    3. Erstellen Sie eine Augenmuschel (Abbildung 1A), indem Sie ein Loch an der Hornhaut-Limbus-Verbindung mit einer 18-G-Nadel punktieren. Schneiden Sie entlang des Umfangs dieser Verbindung mit einer Mikrodissektions-Irisschere, um die Hornhaut jedes Auges zu entfernen. Trennen Sie die Linse und den Glaskörper mit einer Pinzette von jedem Auge und werfen Sie sie weg.
    4. Isolieren Sie die Netzhaut von der Augenmuschel, indem Sie den retinalen pigmentierten Epithelkomplex (RPE) vorsichtig von der neuronalen Netzhaut abziehen. Verwerfen Sie den RPE-Sklera-Aderhaut-Komplex. Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut während der Dissektion nicht beschädigt wird, indem Sie nur die Kanten behandeln.
    5. Isolierte Netzhaut wird mit einer breiten Transferpipette in den Deckel einer 60 x 15 mm großen Schale gebracht, die mit dem Bicarbonatpuffer von Ames gefüllt ist.
    6. Richten Sie die hemisphärenförmige Netzhaut konkav aus (die Photorezeptoren sind nach unten zum Boden der Schale gerichtet) und halbieren Sie jede Netzhaut (durch den Sehnerv) mit einer Irisschere oder einem Skalpell (Klinge Nr. 10, 40 mm). Schneiden Sie die gekrümmten Kanten jeder halben Netzhaut zu, um zwei Rechtecke zu bilden (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Durch die Minimierung der Krümmung jeder halbierten Netzhaut kann die Netzhaut in nachfolgenden Schälschritten besser abflachen und erzeugt eine genaue Schalung der ROS-Schicht (Rod Outer Segment).
    7. Lagern Sie die halbierte Netzhaut in der Gewebeinkubationskammer, die kontinuierlich mit 95% O2 und 5% CO2 gesprudelt ist.
      HINWEIS: Isolierte Netzhaut kann im karbogenierten Ames-Bicarbonatpuffer für ~ 24 h gehalten werden.
  3. Rod Outer Segment (ROS) Kollektion durch Filterpapierpeeling
    HINWEIS: Aktualisieren Sie den mit RT angereicherten HEPES-Puffer von Ames während des Peeling-Prozesses alle 15-20 Minuten, um den erforderlichen physiologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten.
    1. Übertragen Sie ein retinales Rechteck aus der Gewebekammer mit einer breiten Bohrungstransferpipette und einem 5 mm x 2,5 mm großen Stück Filterpapier in eine 35 x 10 mm große Petrischale, die mit Ames' HEPES-Puffer gefüllt ist, der mit 100% O2 aufgeblasen ist.
    2. Richten Sie die unterteilte Netzhaut konkav aus und stellen Sie sicher, dass die Photorezeptoren nach unten zum Boden der Schale zeigen. Greifen Sie die Seiten der halbierten Netzhaut leicht mit einer Pinzette und bewegen Sie sie auf das Filterpapier. Sobald die Netzhaut auf dem Filterpapier zentriert ist, bewegen Sie das Filterpapier nach oben, so dass die halbierte Netzhaut das Filterpapier berührt, um die ROS-zu-Filter-Papierhaftung zu erzeugen (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Photorezeptorschicht direkten Kontakt mit dem Filterpapier hat.
    3. Heben Sie das Filterpapier mit der angebrachten Netzhaut vorsichtig aus dem HEPES-Puffer von Ames heraus. Legen Sie die Unterseite des Filterpapiers (die Seite ohne Netzhaut) auf ein Papiertuch und tupfen Sie es 2-3 Mal zum Trocknen ab (Abbildung 1B).
    4. Fügen Sie einen Tropfen von Ames' HEPES auf die Seite des Filterpapiers mit der Netzhaut hinzu. Legen Sie das Filterpapier wieder zum Trocknen auf das Papiertuch, wie gerade beschrieben. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei weitere Male.
    5. Legen Sie das Filterpapier mit der Netzhaut zurück in die Petrischale. Drücken Sie mit einer Pinzette alle Kanten der halbierten Netzhaut vorsichtig nach oben und weg vom Filterpapier auf allen Seiten.
    6. Ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig vom Filterpapier ab. Berühren Sie während des Peeling-Prozesses nur den extremen Umfang der Netzhaut, um die strukturelle Integrität der Netzhaut zu erhalten.
    7. Heben Sie das Filterpapier aus der Petrischale und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit auf einem Papiertuch. Stellen Sie sicher, dass die Seite, die mit der Netzhaut in Berührung kam, das Papiertuch nicht berührt.
    8. Legen Sie das Filterpapier mit der partiellen ROS-Schicht in ein beschriftetes Rohr auf Eis (Abbildung 1B). Halten Sie die geschälte Netzhaut in Ames' HEPES-Puffer getaucht.
    9. Wiederholen Sie den Peeling-Vorgang für diese halbierte Netzhaut ca. 7-8 Mal, um die gesamte ROS-Schicht zu entfernen. Legen Sie nach jedem Peeling das Filterpapier in das gleiche Röhrchen, das das isolierte ROS aus einer halbierten Netzhaut enthält.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die halbierte Netzhaut nicht zu zerreißen, wenn Sie sie vom Filterpapier abziehen, da die Netzhaut während dieses Vorgangs dünner wird.
    10. Das Röhrchen mit allen Filterpapierschalen des isolierten ROS zur sofortigen Verwendung auf Eis legen oder direkt auf Trockeneis einfrieren und bei -80 °C lagern.
    11. Verwenden Sie eine Pinzette, um die übrig gebliebene geschälte Netzhaut (ohne ROS) in eine entsprechend gekennzeichnete Tube zu übertragen. Das Rohr zur sofortigen Verwendung auf Eis legen oder mit Trockeneis einfrieren und bei -80 °C lagern.
    12. Wiederholen Sie den Peeling-Vorgang für jede halbierte Netzhaut und kennzeichnen Sie jede Tube genau.

2. Lyophilisierte Netzhautpeeling-Methode

  1. Puffer, Schälmedium, Dissektionsschalenzubereitung und Lyophilisatoraufbau
    1. Bereiten Sie in einer 1-Liter-Vorratsflasche die Ringer-Lösung vor, indem Sie 500 ml destilliertes Reinstwasser hinzufügen. Die Reagenzien werden aufgelöst, um eine Endkonzentration von 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES und 0,02 mM EDTA zu erreichen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 ein, fügen Sie Reinstwasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 1 l zu bringen, und stellen Sie die Osmolarität auf 313 mOsm ein.
    2. Vor dem Gebrauch die Ringerlösung mit einem sterilen Filter (Porengröße 0,2 μm) filtrieren, den Deckel mit Paraffinfolie verschließen und bei 4 °C lagern.
    3. Schneiden Sie das Zellstofffilterpapier mit stumpfer Spitze (oder einem gleichwertigen Scherentyp) in Rechtecke mit den Maßen ca. 5 mm x 2,5 mm. Verwenden Sie einen Bleistift, um auf eine Seite des Filterpapiers zu schreiben, um ein einzigartiges Etikett zu erstellen.
    4. Erstellen Sie ein Gitter- oder Schachbrettmuster im Boden einer 35 x 10 mm großen Petrischale mit einem Skalpell (Klinge Nr. 11, 40 mm).
    5. Schalten Sie den Lyophilisator gemäß den Herstellerangaben ein.
    6. Flüssigen Stickstoff in einem Dewar-Kolben oder einem ähnlichen Isoliersaugkolben erwerben.
  2. Netzhautdissektion
    1. Schließen Sie die Netzhautdissektion wie in Abschnitt 1 des Protokolls beschrieben ab (Abbildung 1A). Verwenden Sie die Lösung von Cold Ringer anstelle des Puffers von Ames.
    2. Nach der Dissektion die halbierte, rechteckige Netzhaut in einer 35 x 10 mm großen Petrischale aufbewahren, die mit kalter Ringerlösung gefüllt ist, und auf Eis legen.
  3. Netzhautprobenvorbereitung für die Lyophilisation
    1. Legen Sie ein 5 x 2,5 mm großes Stück Filterpapier und geben Sie eine halbierte Netzhaut in die texturierte 35 x 10 mm Petrischale, die mit kaltem Ringerpuffer gefüllt ist. Verwenden Sie eine Transferpipette mit breiter Bohrung, um jede Netzhaut zwischen den Schalen zu bewegen.
    2. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Netzhaut vorsichtig so umzudrehen, dass sie konkav ausgerichtet ist (die Photorezeptoren zeigen nach oben) und bewegen Sie sie, so dass sie auf dem Filterpapier aufliegt (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Photorezeptoren das Filterpapier nicht berühren (die retinale Ganglienzellschicht sollte in direktem Kontakt mit dem Filterpapier stehen) und das eindeutige Etikett sichtbar ist. Um das Netzhautisolat einfach und schnell zu identifizieren, wird empfohlen, dass sich das eindeutige Etikett auf der Unterseite des Filterpapiers befindet.
    3. Heben Sie das Filterpapier an den Rändern nach oben, so dass das halbierte Stück Netzhaut das Filterpapier berührt, und heben Sie das Filterpapier weiterhin aus der Lösung des Ringers heraus.
    4. Legen Sie die Unterseite des Filterpapiers (die Seite ohne Netzhaut) auf ein Papiertuch und tupfen Sie vorsichtig 2-3 Mal ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen (Abbildung 2A).
    5. Nehmen Sie das Filterpapier mit einer Pinzette auf und fügen Sie einen Tropfen kalter Ringer auf die Seite des Filterpapiers mit der Netzhaut hinzu. Legen Sie das Filterpapier erneut auf das Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang noch zwei weitere Male.
      HINWEIS: Diese abwechselnden Benetzungs- und Trocknungsschritte sorgen dafür, dass das Tissue fest mit dem Filterpapier verbunden ist.
    6. Lagern Sie jede geklebte Retina-/Filterpapierprobe in einer Petrischale, die mit kalten Ringern gefüllt ist, bis alle Proben eingefroren werden können. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle halbierten Netzhäute.
    7. Besorgen Sie sich eine saubere und trockene 35 x 10 mm Petrischale (nur unten) und ein Stück Aluminiumfolie, das in ein 3,5 x 3,5 Zoll großes Quadrat geschnitten ist.
    8. Heben Sie jede Probe mit einer Pinzette aus dem kalten Ringerpuffer heraus. Stellen Sie sicher, dass die Pinzette nur die Filterpapierränder berührt und die halbierte Netzhaut vermeidet.
    9. Legen Sie die Unterseite jedes Filterpapiers (die Seite ohne Netzhaut) auf ein Papiertuch und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit.
    10. Geben Sie einen Tropfen kaltes 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) auf die Seite des Filterpapiers, wo die Netzhaut haftet. Tupfen Sie das Filterpapier auf das Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Feuchtigkeit aus dem Filterpapier vor dem Einfrieren ausreichend entfernt ist.
    11. Legen Sie alle Filterpapierstücke in die 35 x 10 mm große Petrischale. Verwenden Sie ein fusselfreies Seidenpapier, um überschüssige Flüssigkeit, die das Filterpapier umgibt, abzuleiten.
      HINWEIS: Überfüllen Sie die Petrischale nicht mit Proben. Wenn mehr als vier Mausaugen verwendet werden, sollten Sie eine größere Petrischale oder mehrere kleinere Petrischalen verwenden, um die Netzhaut- / Filterpapierproben zu halten.
    12. Wickeln Sie die gesamte Schale mit Alufolie ein. Stellen Sie sicher, dass die Kanten der Aluminiumfolie gesichert und sanft in den Boden der Petrischale gedrückt werden. Eine Handvoll 0,1-0,2 mm große Löcher werden in den Deckel der Aluminiumfolie eingraviert (Abbildung 2A).
    13. Mit einer Metallzange die mit Aluminiumfolie überzogene Petrischale allmählich in den flüssigen Stickstoff absenken. Bewahren Sie die Proben im flüssigen Stickstoff (<10 min) auf, bis sie zur Lyophilisation bereit sind.
  4. Gefriertrocknung
    1. Legen Sie die mit Aluminiumfolie überzogene Petrischale in einen Gefriertrocknungskolben und befestigen Sie sie gemäß dem Protokoll des Herstellers an der Lyophilisatormaschine. Lyophilisieren Sie die Netzhaut für 30 min.
    2. Lösen Sie den Kolben vom Lyophilisator und schalten Sie die Maschine laut Hersteller aus.
    3. Entfernen Sie die Aluminiumfolie und arbeiten Sie entweder noch am selben Tag mit den gefriergetrockneten Proben oder lagern Sie sie in ordnungsgemäß beschrifteten 1-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie diese Röhrchen in einen Behälter (z. B. ein 50 ml konisches Rohr), der mit einem wasserfreien Trockenmittel gefüllt ist, und lagern Sie die Proben bei -80 ° C.
  5. Stab-Außen- und Innensegmentsammlung durch Klebeband-Peeling.
    1. Schneiden Sie Streifen aus klarem Klebeband (1-2 cm) und lagern Sie die Streifen am Rand des Bandspenders / Labortischs / etc. für eine schnelle Verwendung.
    2. Bewegen Sie eine Netzhautprobe zum Schälen auf den Deckel einer 60 x 15 mm großen Petrischale aus Kunststoff. Achten Sie darauf, nur die äußersten Kanten des Filterpapiers zu greifen und die Netzhaut nicht zu berühren.
    3. Schneiden Sie mit einer Irisschere mit stumpfer Spitze (oder einem gleichwertigen Scherentyp) ein kleines rechteckiges Stück Klebeband auf die ungefähre Größe des Gewebes (1,5 x 2,5 mm).
    4. Legen Sie vorsichtig ein kleines Stück Klebeband auf die lyophilisierte Netzhaut (Abbildung 2B) und üben Sie leichten Druck mit der Pinzette aus, um sicherzustellen, dass sie sich mit der Photorezeptorschicht (der orange / rosa getönten obersten Schicht) verbindet.
    5. Ziehen Sie das Klebeband langsam ab. Sowohl das äußere Segment (ROS) als auch das innere Segment des Stabs (RIS) werden auf das Band geklebt (Abbildung 2B).
    6. Stellen Sie sicher, dass sich an der gebrochenen Oberfläche ein dünner weißer Film befindet. Dies ist RIS.To den RIS trennen, ein weiteres Stück Klebeband platzieren und das Band auf die gebrochene Oberfläche drücken (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Es kann mehr als ein Stück Klebeband benötigen, um die gesamte dünne weiße Schicht zu entfernen.
    7. Legen Sie das Stück Klebeband nur mit der orange/rosa Schicht in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit der Aufschrift +ROS.
    8. Legen Sie das Band oder die Klebebänder mit der dünnen weißen Schicht in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit der Aufschrift +RIS.
      HINWEIS: Das Trennen der lyophilisierten Netzhaut mit Klebeband erfordert Übung. Die Menge an Druck, die auf das Band ausgeübt wird, beeinflusst, wie die lyophilisierte Probe fraktioniert wird. Wenn zu viel Druck auf das Band über die Probe ausgeübt wird, löst sich die gesamte lyophilisierte Netzhaut vom Filterpapier ab und haftet am Band. Wenn zu wenig Druck auf das Band aufgebracht wird, haftet die orange/rosa oberste Schicht (+ROS) nicht am Band.
    9. Sammeln Sie das übrig gebliebene Netzhautgewebe (ohne ROS- und RIS-Schichten, -OIS), das sich auf dem Filterpapier befindet, indem Sie die dicke, weiße Schicht mit Klebeband vom Filterpapier abziehen. Legen Sie das Isolat in ein Röhrchen mit der Bezeichnung -OIS.
    10. Wiederholen Sie diese Schritte für jede halbierte Netzhautprobe.
    11. Lagern Sie die isolierten Schichten der lyophilisierten Netzhaut entweder bei Raumtemperatur, wenn Sie am selben Tag eine Proteinquantifizierung, Gelelektrophorese und Proteinimmunoblots durchführen, oder lagern Sie sie in einem Behälter (z. B. 50 ml konischem Röhrchen), der mit wasserfreiem Trockenmittel bei -80 ° C für die spätere Verwendung gefüllt ist.

3. Western Blot Probenvorbereitung für Peeling-Isolierungen

  1. RIPA-Lysepuffer vorbereiten
    1. In einer 100-ml-Lagerflasche fügen Sie Reagenzien hinzu, um eine Endkonzentration von 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS und 1 mM EDTA zu erhalten. Fügen Sie 100 ml deionisiertes Reinstwasser hinzu und mischen Sie es gründlich.
      HINWEIS: RIPA Lysepuffer kann bei 2-8 °C für 2-3 Wochen gelagert werden. Für längere Lagerung aliquotieren und im -20 °C Gefrierschrank lagern.
    2. Am Tag des Experiments einen Proteasehemmer-Cocktail (0,1 M PMSF, 1:1000 Aprotinin und 1:1000 Leupeptin) in den RIPA-Lysepuffer geben und auf Eis halten.
  2. Filterpapier abblätternde Lysatzubereitung für Western Blot
    1. Stellen Sie sicher, dass Röhrchen, die die Filterpapierschalen und übrig gebliebene geschälte Netzhaut enthalten, auf Eis gehalten werden (für das Experiment am selben Tag) oder aus dem Gefrierlager von -80 ° C entfernt und auf Eis gelegt werden.
    2. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit vom Boden der Mikrozentrifugenröhrchen, die die Filterpapierschalen enthalten. Schnell in einer Mini-Zentrifuge für 2-4 s drehen und verbleibende Flüssigkeit entsorgen.
    3. Pipette 45-55 μL kalter RIPA-Puffer in Röhrchen, die das Filterpapierisolat enthalten.
    4. Homogenisieren Sie jede Probe mit einem sauberen, autoklavierten Stößelmischer für 1 min. Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier mit dem Stößelmischer in Kontakt bleibt. Bewahren Sie das Filterpapier an der Seite jedes Rohres auf und nicht auf der Unterseite auf.
    5. Bewegen Sie mit einer Pinzette die Filterpapiere an die Seite jedes Rohres und drehen Sie sie in der Minizentrifuge für 2-4 s. Dadurch wird der RIPA-Puffer aus dem Filterpapier entfernt.
    6. Entfernen Sie getrocknetes Filterpapier und wiederholen Sie dies bei Bedarf für alle Filterpapiere in jedem Röhrchen.
    7. Übertragen Sie das Homogenat auf ein neues Röhrchen und kennzeichnen Sie es entsprechend.
      HINWEIS: Dies ist der zeitaufwendigste Schritt, und wenn er nicht ordnungsgemäß abgeschlossen wird, wird ein Großteil der Probe vom Filterpapier absorbiert.
    8. Pipette 60-80 μL kalten RIPA-Puffer in die einzelnen Röhrchen mit den übrig gebliebenen geschälten Netzhäuten.
    9. Homogenisieren Sie jede Probe mit einem sauberen, autoklavierten Stößelmischer für 1 min.
  3. Tape Peeling Lysat-Zubereitung für Western Blot
    1. Die lyophilisierten RT-Proben oder die -80 °C-Proben auf Eis legen.
    2. Pipette 50-70 μL kalten RIPA-Puffer in jedes Röhrchen, das +ROS- und +RIS-Klebebandschalen enthält.
    3. Pipette 60-80 μL kalter Lysepuffer in die -OIS-Röhrchen, die die verbleibende lyophilisierte Netzhaut enthalten, wobei ROS und RIS entfernt werden.
    4. Homogenisieren Sie jede Probe mit einem sauberen Stößelmischer für 1 min. Stellen Sie sicher, dass das Band in den einzelnen Röhrchen in Kontakt mit dem Stößelmischer und dem Lysepuffer bleibt.
    5. Bewegen Sie das Klebeband mit einer sterilisierten Pinzette an die Seite der Röhrchen und drehen Sie es mit einer Minizentrifuge für 2-4 s. Dadurch wird die Flüssigkeit vom Band entfernt. Entfernen Sie das getrocknete Klebeband aus den Röhrchen.
      HINWEIS: An dieser Stelle können Sie zwei halbe retinale Isolate aus derselben Netzhaut kombinieren, um entweder die Methode "Filterpapierablösung" oder "Bandpeeling" durchzuführen, um sicherzustellen, dass Sie genügend Volumen haben, um einen Bicchinchinsäure-Assay (BCA) durchzuführen.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die vorliegenden Strategien wurden entwickelt, um relativ schnelle und einfache Methoden zur Isolierung und Analyse von Proteinen unter spezifischen subzellulären Stäbchenkompartimenten für die Western-Blot-Analyse bereitzustellen. Wir wandten zwei sequentielle Peeling-Techniken (Abbildung 1 und Abbildung 2) an, gefolgt von Immunoblotting, um zu zeigen, dass diese Methoden zuverlässig verwendet werden können, um die bekannte Verteilung von Stäbchentransducin (GN...

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Diskussion

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Viele Netzhauterkrankungen betreffen Stäbchen-Photorezeptorzellen, was zum Tod des Stäbchens und letztendlich zum vollständigen Verlust des Sehvermögens führt37. Ein bedeutender Teil der genetischen und mechanistischen Ursprünge der menschlichen Netzhautdegeneration wurde im Laufe der Jahre in zahlreichen Mausmodellen erfolgreich rekapituliert. In diesem Zusammenhang würde die Fähigkeit, einzelne subzelluläre Stäbchenkompartimente einfach und selektiv von der kleinen Mausnetzhaut zu trennen, unser...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von NIH Grant EY12155, EY027193 und EY027387 to JC unterstützt. Wir danken Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) und Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) für das Korrekturlesen des Manuskripts. Wir möchten uns auch bei Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) und Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) für die Bereitstellung der notwendigen Ausrüstung bedanken, um das vom Autor bereitgestellte Filmmaterial zu sammeln. Material aus: Kasey Rose et al, Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, veröffentlicht [2017], [Springer Nature].

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 mL Labor- oder Medienflasche ausgestattet mit einem SchlauchdeckeladapterN/AN/A
100% O2 TankN/AN/A
1000mL Flaschenaufsatzfilter, PES Filtermaterial, 0,22 μ mGenesee Scientific25-235
4X SDS ProbenpufferMillipore Sigma70607-3
50 mL Falcon TubeFisher Scientific14-432-22
95% O2 und 5% CO2 TankN/AN/A
Ames' Medium mit L-Glutamin, ohne BicarbonatSigma-AldrichA1420
CaCl2 (99%, Dihydrat)SigmaC-3881
Drierit (wasserfreies Calciumsulfat, >98% CaSO4, >2% CoCl2)WA Hammond Drierite Co LTD21005
Falcon Easy-Grip Petrischale (Polystyrol, 35 x 10 mm)Falcon-Corning08-757-100A
Falcon Easy-Grip Gewebekulturschale (60 x 15 mm)Falcon-Corning08-772F
Federskalpell (Nr. 10, 40 mm)VWR100499-578
Federskalpell (Nr. 11, 40 mm)VWT100499-580
KCl (99%)SigmaP-4504
Kimble Kontes PelletstößelSigmaz359971
Labconco SchnellgefrierkolbenLabconcoN/A
LN2 (flüssiger Stickstoff) + Dewarkolben oder ähnlicher VakuumkolbenN/AN/A
MgCl2SigmaM-9272
Milli-Q/entionisiertes WasserEMD MilliporeN/A
Na2HPO4 (Pulver)J.T. Baker4062-01
NaCl (Kristall)EMD MilliporeSx0420-3
NaHCO3Amresco0865
OmniPur EDTAEMD4005
OmniPur HEPES, freie SäureEMD5320
Parafilm MSigma-AldrichP7793
Reynolds Wrap AluminiumfolieReynolds BrandsN/A
Scotch Magic Tape (12,7 mm x 32,9 m)Scotch-3MN/A
NatriumdesoxycholatSigma-AldrichD67501
Spectrafuge MinizentrifugeLabnet International, IncC1301
Gewebeinkubationskammer (gekauft oder Sonderanfertigung)N/AN/A
Tris-HClJ.T.Baker4103-02
Triton X-100Signma-AldrichT8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilisator oder gleichwertige MaschineSP ScientificN/A
VWR Grade 413 Filerpapier (Durchmesser 5,5 cm, Porengröße 5 μ m)VWR28310-015
Whatman Grade 1 Qualitatives Filterpapier (Durchmesser 9 cm, Porengröße 11 μ m)Whatman/GE Healthcare1001-090
Transferpipette mit breiter Bohrung, Global ScientificVWR76285-362

Referenzen

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Schlagwörter

Photoreceptor IsolationRod Outer SegmentRetina PeelingSubcellular CompartmentTape Peeling MethodLyophilization TechniqueWestern BlotPhotoreceptor Proteins

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