Summary
このプロトコルは、タンパク質分析のためにマウスの桿体光受容体の細胞内区画を単離するための2つの技術を提示する。第1の方法は、生きた網膜とセルロース濾紙を使用してロッドの外側セグメントを分離し、第2の方法は凍結乾燥された網膜と粘着テープを使用してロッドの内側と外側のセグメント層を剥離する。
Abstract
桿体光受容体は、異なる区画を有する高度に偏光された感覚ニューロンである。マウスの桿体は、長く(〜80μm)および薄く(〜2μm)、網膜の最外層である感光体層に横方向に充填され、類似の細胞下区画の位置合わせをもたらす。伝統的に、凍結したフラットマウント網膜の接線方向切片化は、異なる桿体区画内のタンパク質の動きおよび局在を研究するために使用されてきた。しかし、桿体優性マウス網膜の高い曲率は、接線切除を困難にする。コンパートメント間のタンパク質輸送の研究に動機づけられて、我々は、ウエスタンブロット用のロッド外側セグメント(ROS)および他の細胞下コンパートメントを確実に単離する2つの剥離方法を開発した。当社の比較的迅速かつ簡単な技術は、濃縮された細胞内特異的画分を提供し、正常な棒状体における重要な光受容体タンパク質の分布および再分布を定量的に測定する。さらに、これらの単離技術は、健康な網膜および変性網膜の両方内の他の細胞層のタンパク質組成を単離および定量的に調査するために容易に適合させることもできる。
Introduction
神経網膜の最外層にしっかりと詰め込まれた桿体視細胞は、薄暗い光の視覚の不可欠な部分です。忠実な光子カウンターとして機能するために、ロッドは、光変換と呼ばれるGタンパク質ベースのシグナル伝達経路を利用して、単一光子捕捉に対する迅速で増幅された再現可能な応答を生成する。光に対するこの応答は、最終的に原形質膜における電流の変化を引き起こし、その後、視覚系の残りの部分に信号を送る1。その名前が示すように、各桿体細胞は明確な棒状の形状を有し、外側セグメント(OS)、内側セグメント(IS)、細胞体(CB)、およびシナプス末端(ST)からなる高度に分極した細胞形態を示す。各細胞下区画には、特定のタンパク質機構(膜結合および可溶性)、生体分子的特徴、および視覚的光伝達、一般的なハウスキーピングおよびタンパク質合成、シナプス伝達などの重要な役割を果たすタンパク質複合体があります2,3。
30年以上前、細胞内タンパク質、特にトランスデューシン(OSから離れる)とアレスチン(OSに向かう)の光依存的な相互運動が最初に観察されました4,5,6,7。早い段階で、この観察された現象は、エピトープマスキングに対する免疫組織化学の脆弱性のために、懐疑的に受け止められました8。2000年代初頭、刺激依存性のタンパク質転座は、厳格で困難な物理的切片技術を用いて確認された9。凍結したフラットマウントげっ歯類網膜の連続接線切片化とそれに続くイムノブロッティングにより、トランスデューシン9、10、アレステイン11、12、およびrecoverin13はすべて、光に応答して細胞内再分布を受けることが明らかになった。これらの重要なシグナル伝達タンパク質の光駆動転座は、光変換カスケードの感受性を調節するだけでなく9,14,15だけでなく、光損傷に対する神経保護も可能であると考えられている16,17,18。桿体における光駆動タンパク質輸送は、桿体細胞の生物学および生理学にとって非常に重要であるように思われるので、タンパク質分布を決定するために異なる細胞内区画の単離を可能にする技術は貴重な研究ツールである。
現在、桿体細胞下区画を単離することを目的としたいくつかの方法がある。しかしながら、これらの方法は、長くて再現が困難であり得るか、またはかなりの量の網膜分離物を必要とする。ロッドアウターセグメント(ROS)調製物は、密度勾配遠心分離19を介して、例えば、網膜ホモジネートからROSを分離するために一般的に使用される。この方法はウェスタンブロットに広く使用されているが、この手順は非常に時間がかかり、最低8〜12匹のマウス網膜20を必要とする。一方、凍結マウスおよびラット網膜の直列接線切片化は、OS、IS、CB、およびST9、11、13を単離する際に首尾よく実施されている。しかし、この方法は、接線切除の前に網膜層を整列させるために、小さくて高度に湾曲したマウス網膜を完全に平坦化する必要があるため、技術的に困難である。視覚系の疾患を再現するマウスモデルやトランスジェニックマウスは数多く存在するため、個々の桿体コンパートメントを確実に、迅速に、そして容易に分離する技術の創出は、各特殊なコンパートメントで起こる生理学的プロセスと、健康および疾患における視覚プロセスの根底にあるメカニズムを明らかにする上で有望である。
これらの調査を容易にするために、我々は、現在のプロトコルよりも容易に桿体細胞下区画を分離する2つの剥離方法を説明する。第1の剥離方法は、パッチクランプ記録21のために蛍光標識されたバイポーラ細胞を露出させる技術から適合し、セルロース濾紙を使用して、生きた単離されたマウス網膜からROSを順次除去する(図1)。第2の方法は、chick22およびfrog23網膜から3つの一次網膜細胞層を単離する手順から適合し、粘着テープを使用して凍結乾燥網膜からROSおよび桿体内部セグメント(RIS)を除去する(図2)。どちらの手順も1時間で完了でき、かなりユーザーフレンドリーです。我々は、C57BL/6Jマウスからの暗適応および光曝露網膜を利用して、ロッドトランスデューシン(GNAT1)およびアレスチン(ARR1)の光誘発転座を実証することによって、ウェスタンブロットに対するこれら2つの分離プロトコルの有効性の検証を提供する。さらに、テープ剥離法を用いて、我々の技術が免疫細胞化学(ICC)によって取得されたタンパク質局在データとウェスタンブロットとの間の不整合を調べ、対処するために使用することができるという追加の証拠を提供する。具体的には、我々の技術は、1)プロテインキナーゼC-α(PKCα)アイソフォームが双極性細胞だけでなく、マウスROSおよびRISにも低濃度ではあるが24,25存在し、2)ロドプシンキナーゼ(GRK1)が単離されたOSサンプル中に主に存在することを示した。これらのデータは、特定のロッドタンパク質とレチナールタンパク質を分離および定量するための2つの剥離技術の有効性を示しています。
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Protocol
すべての実験は、南カリフォルニア大学(USC)の研究動物ケア委員会の現地機関のガイドラインに従って実施された。
1. 生細胞網膜剥離法
- エイムズのバッファーの準備、紙剥がし、解剖皿
- 鈍い先端の虹彩はさみ(または同等のはさみタイプ)を使用して、セルロースろ紙(グレード413)を約5mm x 2.5mmの長方形に切ります。将来の使用のために挿し木を保管してください。
- エイムズのミディアム、2.38 g HEPES、および0.877 gのNaClのボトルを組み合わせて、エイムズのHEPESバッファー1 Lを準備します。滅菌ガラス瓶に試薬を蒸留超純水で溶解し、浸透圧およびpHをそれぞれ280mOsmおよび7.4に調整する。フィルター(孔径0.2 μm)を滅菌し、蓋をパラフィンフィルムで密封し、4°Cで保存した。
- エイムズの培地の1本のボトルと1.9gのNaHCO3を組み合わせて、エイムズの重炭酸塩緩衝液1Lを調製する。滅菌ガラス瓶に試薬を蒸留超純水で溶解し、浸透圧およびpHをそれぞれ280mOsmおよび7.4に調整する。フィルター(孔径0.2 μm)を滅菌し、蓋をパラフィンフィルムで密封し、4°Cで保存した。
注:エイムズのHEPESおよびエイムズの重炭酸塩緩衝液は、事前に調製し、4°Cで1週間保存することができます。 - 35 x 10 mmのペトリ皿の底に、メス(ブレード番号11、40 mm)で格子または市松模様を作成します。
注:ペトリ皿のテクスチャー加工された底部は、網膜解剖中に孤立した自由に浮遊する眼を所定の位置に保持する。
- 網膜の解剖
メモ: この手順では、バッファを室温(RT)に持ち込んで室温(RT)に保持する必要があります。解剖中は、エイムズの重炭酸塩バッファーを15分ごとに新鮮な炭水化エイムズの重炭酸塩バッファーでリフレッシュします。これは必要な生理学的pHを維持する。- 解剖の約15〜20分前に、チューブキャップアダプタを備えた100mL実験室または培地ボトルでエイムズのHEPES緩衝液を酸素化し、組織インキュベーションチャンバおよびチューブキャップアダプタを備えた100mL実験室または培地ボトル内でエイムズの重炭酸塩緩衝液を95%O2および5 %CO2 で泡立てる。
- C57BL/6Jマウス(生後2~3ヶ月)の両性を同数、イソフルラン吸入または二酸化炭素(CO2)による安楽死、続いて子宮頸部脱臼のいずれかを行う。湾曲したハサミで目を核形成し、泡立てたエイムズの重炭酸塩緩衝液で満たされたテクスチャー加工された35 x 10 mmのペトリ皿に目を置きます。
- 角膜 - 辺縁部の穴を18G針で穿刺して、アイカップ(図1A)を作成します。微小解剖虹彩はさみを使用してこの接合部の周囲に沿って切断し、各眼の角膜を除去した。ピンセットを使ってレンズと硝子体液を各目から離し、捨てます。
- 網膜色素沈着上皮(RPE)-強膜-脈絡膜複合体を神経網膜から慎重に剥離することによって、眼杯から網膜を単離する。RPE-強膜-脈絡膜複合体を破棄する。解剖中に網膜が損傷していないことを確認するために、縁だけを扱います。
- ワイドボアトランスファーピペットを使用して、分離した網膜を、泡立てたエイムズの重炭酸塩緩衝液で満たされた60 x 15 mmディッシュの蓋に移します。
- 半球状の網膜を凹面上に向け(視細胞は皿の底に向かって下を向いている)、虹彩はさみまたはメス(刃番号10、40mm)を使用して各網膜を(視神経を通して)二分する。各半網膜の湾曲したエッジをトリミングして、2つの長方形を作成します(図1A)。
注:半分になった各網膜の曲率を最小限に抑えると、その後の剥離ステップで網膜がよりよく平坦になり、桿体外側セグメント(ROS)層の正確な剥離が生成されます。 - 半分になった網膜を、95%O2 および5%CO2で連続的にバブリングされた組織インキュベーションチャンバーに保管する。
注:単離された網膜は、炭化エイムズの重炭酸塩緩衝液に約24時間保持することができます。
- ろ紙剥離によるロッドアウターセグメント(ROS)回収
注:剥離プロセス中にRT酸素化エイムズのHEPESバッファーを15〜20分ごとにリフレッシュして、必要な生理学的pHを維持します。- 1つの網膜長方形を、広い口径の転写ピペットと5 mm x 2.5 mmのろ紙で組織チャンバーから、100% O2で泡立てたエイムズのHEPESバッファーで満たされた35 x 10 mmのペトリ皿に移します。
- 仕切られた網膜を凹ませ、感光体が皿の底に向かって下を向いていることを確認します。半分になった網膜の側面をピンセットで軽くつかみ、ろ紙の上に動かします。網膜がろ紙の中央に収まったら、半分になった網膜がろ紙に触れるようにろ紙を上方に動かして、ROSとろ紙間の接着を作成します(図1B)。
メモ:感光層がろ紙と直接接触していることを確認してください。 - 網膜が付着したろ紙をエイムズのHEPESバッファーから慎重に持ち上げます。ろ紙の底面側(網膜のない側)をペーパータオルの上に置き、2~3回軽く叩いて乾かします(図1B)。
- 網膜のあるろ紙の側面にエイムズのHEPESを一滴加えます。今説明したように、ペーパータオルの上にろ紙を再び置いて乾かします。このプロセスをさらに 2 回繰り返します。
- 網膜の入ったろ紙をペトリ皿に戻します。ピンセットを使用して、半分になった網膜のすべての端をゆっくりと押し上げ、すべての側面のろ紙から離します。
- 網膜をろ紙から繊細に剥がします。剥離プロセス中に網膜の極端な周囲のみに触れて、網膜の構造的完全性を維持します。
- ペトリ皿からろ紙を持ち上げ、ペーパータオルの余分な液体を取り除きます。網膜に接触していた側がペーパータオルに接触していないことを確認してください。
- 部分ROS層を含むろ紙を氷上のラベル付きチューブに入れます(図1B)。剥離した網膜をエイムズのHEPESバッファーに浸してください。
- この半分になった網膜の剥離工程を約7~8回繰り返し、ROS層全体を除去します。各剥離の後、濾紙を同じチューブに入れ、1つの半分の網膜から単離されたROSを含む。
注:このプロセス中に網膜が薄くなるため、半分になった網膜をろ紙から剥がすときは引き裂かないように注意してください。 - 分離された ROS のすべてのろ紙皮を含むチューブを氷の上に置き、すぐに使用するか、ドライアイス上で直接凍結させて -80 °C で保存します。
- ピンセットを使用して、剥離した残りの網膜(ROSが欠けている)を適切なラベルの付いたチューブに移します。チューブを氷の上に置き、すぐに使用するか、ドライアイスで凍結して -80 °C で保存します。
- 半分に切った網膜ごとに剥離工程を繰り返し、各チューブを正確にラベル付けします。
凍結乾燥網膜剥離法
- バッファー、剥離媒体、解剖皿の準備、凍結乾燥機のセットアップ
- 1Lの保存ボトルに、500mLの蒸留超純水を加えてリンゲル溶液を調製する。試薬を溶解して、最終濃度 130 mM NaCl、3.6 mM KCl、2.4 mM MgCl2、1.2 mM CaCl2、10 mM HEPES、および 0.02 mM EDTA に達するようにします。NaOHでpHを7.4に調整し、超純水を加えて最終体積を1Lにし、オスモル濃度を313mOsmに調整します。
- 使用前に、リンゲル溶液を滅菌フィルター(孔径0.2μm)でろ過し、蓋をパラフィンフィルムで密封し、4°Cで保存してください。
- 鈍い先端の虹彩はさみ(または同等のはさみタイプ)を使用して、セルロースろ紙を約5mm x 2.5mmの長方形に切ります。鉛筆を使ってろ紙の片面に書き、ユニークなラベルを作成します。
- メス(刃番号11、40mm)を使用して、35 x 10 mmのペトリ皿の底に格子または市松模様を作成します。
- 製造元の仕様に従って凍結乾燥機の電源を入れます。
- デュワーフラスコまたは同様の絶縁性真空フラスコで液体窒素を取得します。
- 網膜解剖
- プロトコルのセクション1(図1A)に記載されているように網膜解剖を完了します。エイムズのバッファーの代わりにコールドリンガーの溶液を使用してください。
- 解剖後、半分の長方形の網膜を冷たいリンゲル溶液で満たされた35 x 10 mmのペトリ皿に保管し、氷の上に置きます。
- 凍結乾燥のための網膜サンプル調製
- 5 x 2.5 mmのろ紙を置き、半分にした網膜を冷たいリンガーのバッファーで満たされたテクスチャー加工された35 x 10 mmのペトリ皿に移します。ワイドボアトランスファーピペットを使用して、各網膜を皿間で移動させます。
- ピンセットを使用して、網膜が凹状になるように慎重に裏返し(感光体が上を向いています)、ろ紙の上に載るように動かします(図2A)。
注:感光体がろ紙に接触していないこと(網膜神経節細胞層がろ紙と直接接触している必要があります)、および固有のラベルが表示されていることを確認してください。網膜分離株を簡単かつ迅速に同定するには、独自のラベルをろ紙の下側に配置することをお勧めします。 - 半分になった網膜がろ紙に触れるようにろ紙の端を上方に持ち上げ、リンゲルの溶液からろ紙を持ち上げて取り出します。
- ろ紙の底面(網膜が付いていない側)をペーパータオルの上に置き、2~3回丁寧に軽くたたいて余分な液体を取り除きます(図2A)。
- ピンセットでろ紙を拾い上げ、網膜のあるろ紙の側面に冷たいリンガーの滴を加えます。ペーパータオルの上にろ紙を再び置き、余分な液体を取り除きます。このプロセスをさらに 2 回繰り返します。
注:これらの交互の濡れと乾燥のステップは、組織がろ紙にしっかりと付着していることを保証します。 - 付着した各網膜/ろ紙サンプルを、すべてのサンプルを凍結する準備ができるまで、冷たいリンガーで満たされたペトリ皿に保管してください。すべての半分の網膜についてこのプロセスを繰り返します。
- 清潔で乾燥した35 x 10 mmのペトリ皿(底のみ)と3.5 x 3.5インチの正方形にカットされたアルミホイルを手に入れます。
- ピンセットで冷たいリンガーのバッファーから各サンプルを持ち上げます。ピンセットがろ紙の端だけに接触し、網膜が半分になるのを避けてください。
- 各ろ紙の底面(網膜がない側)をペーパータオルの上に置き、余分な液体を取り除きます。
- 網膜が付着しているろ紙の側面に冷たい1x PBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、pH 7.4)を滴下します。ペーパータオルにろ紙を塗り、余分な液体を取り除きます。
メモ:凍結する前に、ろ紙の水分が十分に除去されていることを確認してください。 - すべてのろ紙片を35 x 10 mmのペトリ皿に入れます。糸くずの出ないティッシュペーパーを使用して、ろ紙を囲む余分な液体を吸い取ります。
注:サンプルでペトリ皿を混雑させないでください。4つ以上のマウスの目を使用する場合は、網膜/ろ紙のサンプルを保持するために、より大きなペトリ皿または複数の小さなペトリ皿を使用することを検討してください。 - 皿全体をアルミホイルでしっかりと包みます。アルミホイルの端が固定され、ペトリ皿の底にスムーズに押し込まれていることを確認します。アルミホイルの蓋に0.1~0.2mmの穴を数個穿刺します(図2A)。
- 金属トングを用いて、アルミ箔で覆われたシャーレを液体窒素中に徐々に下げる。凍結乾燥の準備が整うまで、サンプルを液体窒素(<10分)に保管してください。
- 凍結 乾燥
- アルミホイルで覆われたペトリ皿を凍結乾燥フラスコに入れ、製造業者のプロトコルに従って凍結乾燥機に取り付ける。網膜を30分間凍結乾燥する。
- フラスコを凍結乾燥機から取り外し、製造元に応じて機械を遮断します。
- アルミホイルを取り出し、凍結乾燥したサンプルを同じ日に処理するか、適切にラベル付けされた1 mLマイクロ遠心チューブに保管してください。これらのチューブを無水乾燥剤で満たされた容器(50mL円錐管など)に入れ、サンプルを-80°Cで保存する。
- ロッド外側と内側のセグメントは粘着テープ剥離による収集。
- 透明な粘着テープ(1〜2cm)のストリップをカットし、テープディスペンサー/ラボベンチなどの端にストリップを保管して、すばやく使用できるようにします。
- 1つの網膜サンプルをプラスチック製の60 x 15 mmペトリ皿の蓋に移動して剥離します。ろ紙の最外縁だけをつかみ、網膜に触れないようにしてください。
- 鈍い先端の虹彩はさみ(または同等のはさみタイプ)を使用して、組織のおおよそのサイズ(1.5 x 2.5 mm)に小さな長方形のテープを切断します。
- 凍結乾燥網膜の上に小さなテープを慎重に置き(図2B)、ピンセットでわずかな圧力をかけて、感光層(オレンジ/ピンク色の最上層)と接着することを確認します。
- テープをゆっくりとはがします。ロッドアウターセグメント(ROS)とロッドインナーセグメント(RIS)の両方がテープに接着されます(図2B)。
- 破断面に薄い白い膜があることを確認します。これは、RISを分離し、別のテープを置 RIS.To、テープを破断面に押し下げることです(図2B)。
メモ:薄い白い層全体を取り外すには、複数のテープが必要になる場合があります。 - オレンジ/ピンクの層だけを含むテープを、+ROSとラベルの付いた微量遠心管に入れます。
- 薄い白い層が付いたテープを、+RISとラベルの付いた微量遠心管に入れます。
注:凍結乾燥された網膜をテープで分離するには練習が必要です。テープに加えられる圧力の量は、凍結乾燥されたサンプルがどのように分画されるかに影響します。サンプル上のテープに過度の圧力がかかると、凍結乾燥された網膜全体がろ紙を剥がし、テープにくっつきます。テープに加える圧力が少なすぎると、オレンジ/ピンクの最上層(+ROS)がテープにくっつきません。 - ろ紙上に位置する残りの網膜組織(ROS層とRIS層を失った、-OIS)をテープを用いてろ紙から厚く白い層を剥がして集める。分離液を -OIS とラベルの付いたチューブに入れます。
- 半分にした網膜サンプルごとにこれらの手順を繰り返します。
- 凍結乾燥網膜から単離した層を、タンパク質定量、ゲル電気泳動、およびタンパク質イムノブロットを同じ日に行う場合は室温で保存するか、後で使用するために-80°Cの無水乾燥剤を充填した容器(50mL円錐管など)に保管する。
3. 剥離単離のためのウェスタンブロットサンプル調製
- RIPA溶解バッファーの調製
- 100 mL の保存ボトルに試薬を加え、終濃度 50 mM トリス塩酸 pH 7.4、150 mM NaCl、1% トリトン X-100、1% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、および 1 mM EDTA を得た。脱イオンした超純水100mLを加え、よく混ぜる。
注:RIPA溶解緩衝液は、2〜8°Cで2〜3週間保存することができる。より長い保存のために、アリコートして-20°Cの冷凍庫に保管してください。 - 実験当日、プロテアーゼ阻害剤カクテル(0.1M PMSF、1:1000アプロチニン、1:1000ロイペプチン)をRIPA溶解バッファーに加え、氷上に保管する。
- 100 mL の保存ボトルに試薬を加え、終濃度 50 mM トリス塩酸 pH 7.4、150 mM NaCl、1% トリトン X-100、1% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、および 1 mM EDTA を得た。脱イオンした超純水100mLを加え、よく混ぜる。
- ウェスタンブロット用濾紙剥離溶解液調製
- ろ紙の皮と剥がれた残りの網膜を含むチューブが氷上に維持されていることを確認するか(同日の実験用)、-80°Cの冷凍庫保管から取り出して氷上に置きます。
- ろ紙が剥がれた微量遠心管の底部から余分な液体を取り除きます。ミニ遠心分離機で2〜4秒間素早く回転させ、残りの液体を捨てます。
- 45~55 μLの冷RIPA緩衝液を濾紙を含むチューブにピペットで分離する。
- 各サンプルを清潔なオートクレーブ処理乳棒ミキサーで1分間均質化します。ろ紙が乳棒ミキサーに接触していることを確認します。ろ紙は、各チューブの底面ではなく側面に保管してください。
- ピンセットで、ろ紙を各チューブの側面に移動し、ミニ遠心分離機で2〜4秒間回転させます。これにより、ろ紙からRIPAバッファーが除去されます。
- 乾燥したろ紙を取り出し、必要に応じて各チューブ内のすべてのろ紙について繰り返します。
- ホモジネートを新しいチューブに移し、適切にラベル付けします。
注:これは最も時間のかかるステップであり、適切に完了しないと、サンプルの大部分がろ紙に吸収されます。 - 60-80 μLの冷たいRIPA緩衝液を個々のチューブにピペットし、残りの剥離した網膜を入れた。
- 各サンプルを清潔なオートクレーブ処理乳棒ミキサーで1分間均質化します。
- ウェスタンブロットのためのテープ剥離ライセート調製
- RT凍結乾燥サンプルまたは-80°Cサンプルを氷上に置く。
- +ROSおよび+RISを含む各チューブに50〜70μLの冷たいRIPA緩衝液のピペットが剥がれる。
- 残りの凍結乾燥網膜を含む-OISチューブに60〜80μLの冷溶解緩衝液をピペットし、ROSおよびRISを除去した。
- 各サンプルを清潔な乳棒ミキサーで1分間均質化します。個々のチューブ内のテープが乳棒ミキサーおよび溶解バッファーに接触していることを確認します。
- 滅菌ピンセットで、テープをチューブの側面に移動し、ミニ遠心分離機で2〜4秒間回転させます。これにより、テープから液体が除去されます。乾燥したテープをチューブから取り出します。
注:この時点で、ビシンコニン酸アッセイ(BCA)を実行するのに十分な体積を確保するために、「ろ紙剥離」または「テープ剥離」法のいずれかのために、同じ網膜からの2つの半網膜分離株を組み合わせることができます。
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Representative Results
本戦略は、ウェスタンブロット分析のために特定の桿体細胞下区画間のタンパク質を単離および分析するための比較的迅速かつ簡単な方法を提供するために開発された。我々は、2つの逐次剥離技術(図1および図2)に続いてイムノブロッティングを適用し、これらの方法を使用して、暗適応動物および光適応動物の両方におけるロッドトランスデューシン(GNAT1)およびアレスチン(ARR1)の既知の分布を確実に検出できることを実証した。他の細胞層からの汚染なしに桿体細胞下区画を正確に単離する上での我々の2つのプロトコルの有効性を検証するために、イムノブロットはシトクロムC(Cyt C)、アクチン、およびGß5S/Gß5L26に対する抗体でプローブされた。使用した抗体および希釈液のリストを表1に示します。Cyt Cおよびアクチンは、近位網膜には豊富なタンパク質であるがROSには存在しないため、ROS純度を示した。GNAT127のGTPase活性化タンパク質(GAP)の成分であるGß5Lは、ROSおよびRISに存在し、これらの単離のための対照として役立った。Gß5Sは、ROSまたはRISには存在しないが他のすべてのロッドコンパートメントに存在する短いスプライスアイソフォームであり、非ROS/RIS単離された細胞下コンパートメントの対照として役立った。
まず、我々の逐次生細胞網膜剥離法の有効性を、暗および光適応マウスのロッドにおけるGNAT1およびARR1の分布を分析することによって評価した(図3)。ROS(+ROS)を含むろ紙を合計1つの網膜全体からプールし、対応する残留組織(-ROS)も結合した。示されたタンパク質からのシグナルは、その後、+ROSサンプルと-ROSサンプルの間で比較され、単離された網膜全体が入力対照として役立った。これらのサンプルについてのタンパク質濃度および均質化体積を表2に提示する。図3Aに示された結果は、暗適応動物において、GNAT1およびARR128の分布が、GNAT1信号が+ROS分離において目に見えて最も強であったのに対し、ARR1信号が-ROS分離においてより堅牢であった既知の暗状態分布と密接に一致したことを示している。したがって、光ばく露された網膜では、GNAT1シグナルは+ROS分離において顕著に減少し、-ROSサンプルではシグナルが増加し、光誘発性ARR1転座は+ROSおよび-ROSサンプルで可視化することができた。6つの異なる実験の結果が定量化され、+ROSおよび-ROSサンプルにおけるGNAT1およびARR1の暗/明条件間に統計的に有意な差が認められた(図3B)。これらの知見は、桿体細胞下区画内で以前に知られていたタンパク質の明暗運動と一致しており、この技術が濃縮+ROS画分を単離できることを強く示している。
生細胞剥離法をさらに検証するために、+ROSサンプルと-ROSサンプルの両方で既知のROS純度マーカー分布を調査しました。暗適応サンプルと明適応サンプルの両方で、Gß5S、Cyt C、およびアクチンシグナルは+ROSサンプルから除外され(図3A)、他の細胞層からの汚染がないことを示しています。さらに、Gß5L信号は+ROSサンプルではっきりと見えました(図3A)。さらに、アクチンおよびGß5Lシグナルは、+ROSおよび-ROS画分の純度を確認しただけでなく、+ROSサンプルからのシグナルがGß5Lに対して正規化され、-ROSサンプルからのシグナルがアクチンに対して正規化され、正規化のための対照としても作用した。 図3Aに示されているように、生細胞剥離分離株は、最適なイムノブロッティングの正規化および分析のために、ローディングコントロール、特に網膜ホモジネート全体と一緒にロードすることをお勧めします。これらのデータを組み合わせることで、当社の生細胞剥離法は、タンパク質分析のためにROS細胞下層を桿体および網膜の残りの部分から単離するための迅速かつ再現性のあるアプローチを提供できることを検証します。
次に、凍結乾燥剥離技術を評価し、この方法がROSおよびRISコンパートメントを再現性よく分離できることを検証しました。イムノブロット法に先立ち、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて凍結乾燥したマウス網膜をそのまま剥離して表面を画像化し、テープ剥離が得られたどの感光体細胞下層を解析した(図4)。粘着テープで剥離する前に、無傷の凍結乾燥網膜(オレンジ色/ピンク色を帯びた層)の表面は、特徴的な円筒形ROSのプロファイルと密接に一致していた(図4A)。最初のテープ剥離の後、ROSおよびRISは、剥離された凍結乾燥網膜の残りの表面に存在する均一な核層によって証明されるように、完全に除去されたように見えた(図4C)。その後のテープ剥離は、剥離層のフリー表面からRIS(薄い白色層、図4B)を除去し、このプロセスは、内側および外側のセグメントを連結する狭くて壊れやすい連結繊毛によって助けられやすい。これらの結果から、凍結乾燥網膜組織由来の桿体細胞下層をテープを用いて特異的に分画できることが確認された。
この方法の有効性を視覚的に検証した後、暗および光適応の剥離網膜は、生細胞剥離法で概説したように、異なる区画のタンパク質マーカーを使用する同じアプローチを使用してイムノブロッティングを行った(図3)。ROS単離(+ROS)、RIS単離(+RIS)、および残りの網膜層(-OIS)のためのタンパク質濃度およびホモジナイズ体積を 表2に提示する。予想通り、GNAT1のROSからRISへの、およびARR1のRISからROSへの明らかな光誘起シフトがありました(図5A)。GNAT1は暗所の+ROSサンプルと光の+RISサンプルで最も豊富でしたが、ARR1の信号は逆転していました(図5A)。次に、+ROS、+RIS、および-OIS単離からの転座タンパク質シグナルを、ライブピーリング法と同じ対照およびアプローチを使用して正規化し、定量化しました(図5B)。また、+RISサンプルと-OISサンプル(図5C)を組み合わせて、生細胞ろ紙剥離法(図3B)とより直接的に比較しました。両方のグラフは、GNAT1とARR1の両方の十分に確立された特徴的な光誘発転座を示しています。これらの観察結果に基づいて、テープ剥離調製物は、これらの単離におけるARR1およびGNAT1のタンパク質組成によって証明されるように、濃縮ROSおよびRIS画分を生じるようである。
次に、個々の細胞内単離の純度を評価した。 図3Aに示した結果と同様に、+ROSサンプルにはアクチン、シトクロムC、およびGß5Sのシグナルが欠けていましたが、強いGß5Lシグナルが表示されていました(図5)。この知見は、我々の+ROSサンプル調製における他の細胞内区画からの汚染の欠如を示している。その後の桿体の細胞下層のタンパク質含量を、+RIS単離により、次いで評価した。+RISサンプルはCyt C、Gß5L、およびアクチンに対して陽性であることがわかった。この知見は、ミトコンドリアおよび細胞骨格要素に富むRISの既知の組成と一致する。最終層である-OIS分離株は、 図3Aに示された-ROSサンプルと一致するタンパク質分布を有していた。
桿体細胞下区画のタンパク質組成を調べる際の粘着テープ剥離法の有用性をさらに評価するために、我々は、+ROS、+RIS、および-OISサンプルにおけるロドプシンキナーゼ(GRK1)およびプロテインキナーゼC-α(PKCα)の免疫反応性を具体的に調べた。免疫細胞化学(ICC)やウェスタンブロットなどの異なる実験方法は、しばしば桿体および網膜におけるこれらのタンパク質の正確な局在化について矛盾する結果をもたらす。GRK1は、例えば、光活性化オプシン29のリン酸化を媒介するロッドおよびコーンOSに比較的豊富に存在すると考えられている。しかしながら、網膜スライスの免疫標識は、OS30、31または感光体層全体32全体にわたって特異的にGRK1の局在を明らかにした。一方、PKCαは、ICCが双極性細胞を標識するために一般的に使用されるタンパク質である。網膜スライスにおける桿体特異的PKCα免疫標識の明確な証拠はないにもかかわらず25、ROSにおけるPKCαの存在およびリン酸化の役割を支持するかなりの生化学的24,25および機能的33,34,35の証拠がある。我々の技術を利用して、GRK1免疫反応性は、光曝露網膜の+ROSサンプルで最も強く、-OISサンプルでは存在しないことを見出した(図6A)。逆に、+ROSおよび+RISサンプルはPKCαに対してかすかなシグナルを示したことを示す。図6Bに見られるように、PKCαは、網膜切片の免疫蛍光染色によるROSまたはRISでは一般に検出されない。しかしながら、PKCαはウェスタンブロットにより免疫検出された(図6A、D)。+ROSおよび+RIS絶縁は強力なGß5L信号とGß5Sの不在を示すため(図6A)、ROSサンプルとRISサンプルの両方の薄暗いPKCα信号は本物であり、他の層からの汚染によるものではないと確信しています。+ROS、+RIS、および-OIS絶縁における個々のシグナルを視覚化するために、GRK1およびPKCαブロットを結合し、比較のためにプロットしました(図6C)。
最後に、最適でない剥離セッションの例(図6D)は、異なるサブ層からの汚染が結果をいかに歪めるかを示し、実験的な剥離誤差をスクリーニングするためのデータ解釈および適切な対照抗体の包含の重要性をさらに示す。このテープ剥離アイソレーションの例では、RISアイソレーションレーンにかすかなGß5S信号が見られ、-OISサンプルからのわずかな汚染を示しています。ユーザーの目標によっては、このわずかな汚染が問題にならない場合があります。しかし、今回のケースでは、+ROSサンプルと+RISサンプルのPKCαシグナルを調べたところ、汚染が原因かもとく、RISレーンではROSレーンに比べてPKCαシグナルがやや高くなっています(図6A、D)。したがって、剥離プロセス中は、正確な分離を確保し、汚染を最小限に抑えるように注意する必要があります。個々のエラーによる汚染は最小限に抑えられていますが、これらのデータは、テープ剥離法がタンパク質分析のためにロッド感光体層の正確なシーケンシャル分離をもたらすことができるという説得力のある証拠を提供します。
図1:生細胞剥離工程の概略図 。 (A)図は、単離された眼球を解剖および半化学化するための主な工程を示す。(b)感光体外側セグメントは、ろ紙を用いた逐次剥離により漸進的に除去される。まず、感光層がろ紙に接するように網膜が配向する。次に、ペーパータオルでろ紙を吸い取って乾燥させ、網膜をろ紙から剥離する。この剥離した分離液は、氷上に保たれたチューブに集められる。このプロセスを7〜8回繰り返して、ロッドアウターセグメント(+ROS)を完全に除去する。この図は BioRender.com で作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:凍結乾燥網膜剥離工程。網膜は、網膜神経節細胞層がろ紙と接触し、光受容体が上を向くように配向している。(b)凍結乾燥後、凍結乾燥網膜をテープの上部に僅かな圧力を加えた後にテープ片に接着させる。テープを剥離し、ロッド外側セグメント(ROS)およびロッド内側セグメント(RIS)層を除去する。RIS層は、ROS層(オレンジ/ピンク層)が見えるまで、より多くのテープ剥離によって除去される。この図は BioRender.com で作成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:逐次ろ紙剥離後の単離された桿体感光体におけるGNAT1およびARR1の発現。 (A)暗および光適応網膜から取得したろ紙剥離法によって収集された+ROSおよび-ROS(ROS枯渇)サンプルのイムノブロット。ブロットは、光誘発タンパク質(トランスデューシン(GNAT1)およびアレスチン(ARR1))および品質管理マーカー(GTPase活性化タンパク質(Gß5L/S)、シトクロムC(Cyt C)、およびアクチン)に対する抗体でプローブされた。2つの半分の網膜をこれらの代表的なブロットのために組み合わせた。(B)暗および光適応網膜からのGNAT1およびARR1の定量化されたシグナル。GNAT1 と ARR は +ROS 分離体と -ROS 分離体から相互に光トリガーの動きをしています。ヴァイオリンプロットは、+ROSサンプルと-ROSサンプルの正規化された式を示しています。この図はRoseら36から修正されたものである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:凍結乾燥網膜の走査型電子顕微鏡像。 (a)テープ剥離前の凍結乾燥網膜の表面(感光体側を上へ)。(b)内セグメント層をポストテープ剥離する。(c)ポストテープ剥離した細胞体層は均一な核外観を示す。この図はRoseら36 から修正され、BioRender.com で作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:凍結乾燥網膜からROSおよびRISを分離するためのテープ剥離法の検証 。 (A)テープ剥離法によって収集された+ROS、+RIS、および-OIS(ROS/RIS-枯渇)サンプルのウェスタンブロット。イムノブロットをトランスデューシン(GNAT1)、アレスチン(ARR1)、GTPase活性化タンパク質(Gß5L/S)、シトクロムC(Cyt C)、およびアクチン抗体でプローブした。サンプルは、暗および光に適応した網膜から得られ、半分にされた網膜分離株(+ROS、+RIS、-OIS)を、より濃縮された材料のために組み合わせた。(B)GNAT1およびARR1の定量化されたシグナルは、暗および光適応網膜から得られた異なる単離網膜層のバイオリンプロットとしてプロットされる。(C)+RISおよび-OISからの正規化された発現レベルを組み合わせ、プロットして、テープおよびろ紙剥離法を比較した。暗黒および光に適応したサンプルは、主要な光形質導入タンパク質の既知の動きを示した。この図はRoseら36から修正されたものである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:光受容体におけるGRK1およびPKCαの細胞内局在を調べるための凍結乾燥網膜のテープ剥離。 (A)ロドプシンキナーゼ(GRK1)、プロテインキナーゼC-α(PKCα)、GTPase活性化タンパク質(Gß5L/S)、およびアクチンの相対レベルを示す、光適応C57BL/6Jマウスからの剥離サンプルの代表的なウェスタンブロット。(b)PKCα抗体と共にインキュベートした光曝露マウスから調製した凍結網膜切片(緑、1:100)。RPE、網膜色素沈着上皮;OS、外側セグメント;IS, 内部セグメント;CB, 細胞体;ST、シナプス終末。(C)+ROS、+RIS、-OISサンプルに対するPKCαおよびGRK1正規化発現レベルをバイオリンプロットとしてプロットする。(D)最適でないテープ剥離は、わずかに汚染されたサンプルを生じる可能性がある。赤い四角は、一部の-OISサンプルで汚染された+RISサンプルを強調し、Gß5L/Sバンドとより高いPKCα信号の両方を生成します。2つの半分の網膜をすべてのブロットについて組み合わせた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ターゲット | 抗体 | 希釈 | 生産者 |
| アレスティン | ウサギアンチARR1 | 1:1000 | 陳, ら, 2006. |
| トランスデューシン | マウスアンチGNAT(TF-15) | 1:1000 | サイトシグナル。 |
| ß アクチン | ウサギアンチßアクチン | 1:5000 | 株式会社ジェネテックス |
| シトクロムC | ウサギ抗シトクロムC | 1:500 | サンタクルーズ、sc-7159。 |
| ギャップ (Gß5L/S) | ウサギアンチGß5L / S(CT2-15) | 1:2000 | ワトソン, ら, 1996. |
| プロテインキナーゼCアルファ(PKC) | ウサギアンチPKC (#2050) | 1:1000 | 細胞シグナル伝達技術。 |
| ロドプシンキナーゼ(GRK1) | マウスアンチGRK1(G-8) | 1:200 | サンタクルーズ、sc-8004。 |
表1:分離技術のウェスタンブロット検証に使用した抗体のリスト。
| ろ紙網膜分離 | ||||||
| +ロス* | -ロス* | 網膜全体 | ||||
| 平均タンパク質濃度(μg/mL) | 700 | 1,500 | 1,500 | |||
| RIPA バッファー容量 (μL) | 90 | 150 | 200 | |||
| 網膜隔離を剥離するテープ | ||||||
| +ロス* | +RIS* | -ロス* | 網膜全体 | |||
| 平均タンパク質濃度(μg/mL) | 520 | 440 | 1,200 | 1,600 | ||
| RIPA バッファー容量 (μL) | 100 | 100 | 125 | 150 | ||
| *2つの半分の網膜分離を組み合わせました。 | ||||||
表2:網膜単離ホモジネート中のタンパク質濃度。
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Discussion
多くの網膜疾患は桿体視細胞に影響を及ぼし、桿体死、そして最終的には完全な視力喪失につながります37。ヒト網膜変性の遺伝的および機械的起源のかなりの部分は、長年にわたって多数のマウスモデルで首尾よく再現されてきた。その文脈において、個々の桿体細胞下区画を小さなマウス網膜から容易かつ選択的に分離する能力は、網膜疾患の局在する生化学的および分子的基盤の理解を大幅に強化するであろう。さらに、神経網膜の層状の性質は、桿体光受容体のユニークで高度に偏光された配置と相まって、選択的剥離による桿体区画の単離を可能にする。この原稿は、イムノブロッティングのために桿体視細胞の個々の細胞下区画を単離するために使用される2つのプロトコールを記述する。どちらの方法も、既存の接線方向断面法9と比較してかなり高速で技術的に困難ではないだけでなく、密度勾配を使用したROSの一般的な生化学的単離よりもサンプルサイズも大幅に小さくする必要があります19。このようなROS勾配精製技術は、十分なROSを確実に回収するために8〜10匹のマウス網膜を必要とするが、ここで提示されたプロトコルは単一の網膜に適している。
提案された技術の全体的な単純さにもかかわらず、両方のプロトコルに共通する主な課題の1つは、異なる細胞下区画の適切な単離に必要な濾紙上の湾曲した網膜の平坦化に関するものである。孤立した網膜は丸まってアサリのような形をとる傾向があります。網膜が濾紙上(感光体側が上下のいずれか)に置かれたときに折り畳まれた縁を有する場合、これは所望の単離された棒層の収率を低下させる可能性がある。さらに重要なことは、網膜が適切に平坦化されていない場合、他の細胞下区画および網膜細胞からの層のずれおよび汚染が起こり得る結果である(図6D)。半分になった網膜矩形の湾曲を制限し、桿体層と網膜層の不完全な位置合わせを補正するために、網膜矩形を半分に切断して2つの網膜正方形を生成することができる。神経網膜をより小さな断片に切断することによって、網膜の自然な湾曲が減少し、組織がろ紙の上に平らに置かれる可能性が高くなります。
異なるロッドコンパートメントが物理的に分離された時期を認識することは、これらの技術の経験の浅い人にとっては難しい場合があります。生物学的に有意な実験を開始する前に、ユーザーはサンプル網膜でプロセスを1〜2時間実行する必要があります。練習は、オペレータのスキルと方法の習熟度を大幅に向上させるはずです。ろ紙を使用して生きた網膜からROSを剥離する場合、ROS層がいつ単離されたかを示す明白な視覚的手がかりはない。網膜が薄くなり壊れやすくなる一方で、ROSを正確に分離するために、ユーザーは剥離の数を自己監視して検証する必要があります。さらに、繊維の太さと粗さが異なるろ紙を使用すると、ROS剥離時間が変化します。より太い繊維(VWRグレード413など)を含む濾紙は、網膜層をより速く分離しますが(6〜8枚の皮)、選択的ではない可能性があり、他の層からの汚染につながる可能性があります。より薄い繊維(Whatman Grade 1など)を含む濾紙は、網膜層をゆっくりと(12〜15枚の皮)分離し、感光体層をきれいに分離します。剥離時間を最小限に抑え、収集純度を確保するために、厚いろ紙と薄いろ紙の両方を使用することをお勧めします。
同時に、視覚的近似とテープサンプルの取り扱いは、凍結乾燥網膜から細胞内区画を単離することの成功の鍵です。テープに過度の圧力を加えると、凍結乾燥された網膜全体がテープに付着します。これが起こると、ROSの分離はより長く、より困難になるが、不可能ではない:網膜の自由表面(神経節細胞側)に2枚目のテープを置き、最初のテープ片にオレンジ色/ピンクがかった層だけが見えるまでテープで層をゆっくりと引き離す。ただし、この時点で RIS を分離することは不可能です。テープに加える圧力が少なすぎると、ROSの大部分がテープに付着しません。ROSテープの適切な接着を確保するために、テープにくっついていない部分をピンセットで優しく押すことをお勧めします。典型的には、わずかな圧力はROSおよびRIS層の除去をもたらすが、圧力の量は経験に基づいて決定されなければならない。孤立したRISの存在は、薄い白い層(雪の軽い粉落ちのようなもの)が最初のROSテープの剥離に見えるかどうかを確認することによって確認することができ、孤立したROSの存在は、テープ上のロッド感光体層の色(暗適応の場合はオレンジ色、光適応の場合はピンクがかった色)を確認することによって容易に判断することができる。
最後の課題は、活網膜からろ紙剥離(+ROS)を均質化するときに発生します。ろ紙は液体を容易に吸収し、かなりの量の均質化バッファーがプロトコルのこのステップ中に吸収されます。剥離紙を各チューブの側面に置いた後、ミニ遠心分離機で液体を回転させると、サンプルの損失を防ぐのに役立ちます。残念ながら、複数のろ紙をスピンダウンすることは時間のかかるプロセスであり、サンプルの損失は避けられません。この問題に対処するには、ろ紙片の一部を取り除き、一度により少ない部分を均質化することに焦点を当てます。さらに、このステップ中のサンプルの損失を避けるために、ROSの分離に使用されるろ紙の総量を最小限に抑えることを検討してください。
どちらの方法も、大きなサンプルサイズや網膜を切断するためのブレードの正確な位置合わせを必要としませんが、光受容体剥離技術には注目すべきいくつかの制限があります。第1に、凍結乾燥されたマウス網膜は、ROSおよびRISを超えて後続の感光体層を剥離するために従順でなくてもよい。第二に、当社の剥離方法は個々の網膜の処理に適しており、一度に大規模なバッチ処理には適していません。第三に、実験の成功は、ウェスタンブロットで使用された抗体の感度限界に依存する。これらの制限にもかかわらず、我々の代表的な結果は、我々の2つの絶縁剥離技術が特定の棒状感光体区画を効率的に分離できることを実証する。さらに、これら2つの方法は、安価で一般的なラボ材料(ろ紙と粘着テープ)を使用し、アクセス性が高くなります。我々の研究では、他の網膜細胞をイムノブロッティングのために単離できるかどうかを直接評価しなかった。しかし、これらの方法は、網膜研究コミュニティの幅広い断面のニーズに利益をもたらすように簡単に変更できると考えています。
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Disclosures
著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。
Acknowledgments
この作業は、NIH Grant EY12155、EY027193、およびEY027387からJCへの支援を受けました。原稿の校正をしてくれたSpyridon Michalakis博士(米国パサデナ州Caltech)とNatalie Chen氏(USC、米国ロサンゼルス)に感謝しています。また、著者が提供した映像を収集するために必要な機器を提供してくれたSeth Ruffins博士(USC、米国ロサンゼルス)とJanos Peti-Peterdi博士(USC、米国ロサンゼルス)にも感謝します。出典:Kasey Roseら、タンパク質分析のためのマウス網膜における視細胞区画の分離、分子神経変性、出版[2017]、[Springer Nature]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter | N/A | N/A | |
| 100% O2 tank | N/A | N/A | |
| 1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 and 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
| Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, dihydrate) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pellet pestle | Sigma | z359971 | |
| Labconco Fast-Freeze Flasks | Labconco | N/A | |
| LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/de-ionized water | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (powder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Aluminum Foil | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Tissue incubation chamber (purchased or custom made) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Wide bore transfer pipet, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
References
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