Methodenartikel

Isolierung und Kultur primärer humaner Zahnfleischepithelzellen mit Y-27632

DOI:

10.3791/62978

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6. November 2021

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1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Isolierung und Kultur menschlicher Zahnfleischepithelzellen vor, indem wir den Rock-Inhibitor Y-27632 zur traditionellen Methode hinzufügen. Diese Methode ist einfacher, weniger zeitaufwendig, verbessert die Stammzelleigenschaften und produziert eine größere Anzahl von Epithelzellen mit hohem Potenzial sowohl für das Labor als auch für klinische Anwendungen.

Zusammenfassung

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Das Zahnfleischgewebe ist die erste Struktur, die parodontales Gewebe schützt und bei vielen oralen Funktionen eine bedeutende Rolle spielt. Das Zahnfleischepithel ist eine wichtige Struktur des Zahnfleischgewebes, insbesondere bei der Reparatur und Regeneration von Parodontalgewebe. Die Untersuchung der Funktionen von Zahnfleischepithelzellen hat einen entscheidenden wissenschaftlichen Wert, wie die Reparatur von mundlichen Defekten und die Erkennung der Kompatibilität von Biomaterialien. Da es sich bei menschlichen Zahnfleischepithelzellen um hochdifferenzierte keratinisierte Zellen handelt, ist ihre Lebensdauer kurz und sie sind schwer zu durchlassen. Bisher gibt es nur zwei Möglichkeiten, Zahnfleischepithelzellen zu isolieren und zu kulturieren, eine direkte Explantierungsmethode und eine enzymatische Methode. Die Zeit, die benötigt wird, um Epithelzellen mit der Direktentpflanzungsmethode zu erhalten, ist jedoch länger und die Zellüberlebensrate der enzymatischen Methode ist niedriger. Klinisch ist der Erwerb von Zahnfleischgewebe begrenzt, so dass ein stabiles, effizientes und einfaches In-vitro-Isolations- und Kultursystem erforderlich ist. Wir haben die traditionelle enzymatische Methode verbessert, indem wir Y-27632 hinzugefügt haben, einen Rho-assoziierten Kinase(ROCK)-Inhibitor, der selektiv das Wachstum von Epithelzellen fördern kann. Unsere modifizierte enzymatische Methode vereinfacht die Schritte der traditionellen enzymatischen Methode und erhöht die Effizienz der Kultivierung von Epithelzellen, was erhebliche Vorteile gegenüber der Direktentregungsmethode und der enzymatischen Methode hat.

Einleitung

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Die menschliche Gingiva, die erste Verteidigungsstruktur, die Parodontalgewebe schützt, ist nicht nur eine physikalische und chemische Barriere1,sondern sezerniert auch verschiedene Klassen von Entzündungsmediatoren, die an Immunantworten beteiligt sind und eine Immunbarriere bilden2,3. Das Zahnfleischepithel spielt eine wichtige Rolle bei der Reparatur und Regeneration von Parodontalgewebe. Daher ist die Untersuchung der Abwehr und Immunität des Zahnfleischepithels von großer Bedeutung für das Verständnis des Auftretens, der Diagnose und der Behandlung von Parodontitis. Die Isolierung und Kultur von Zahnfleischepithelzellen aus menschlichem Zahnfleischgewebe ist der erste Schritt, der für die Untersuchung des Zahnfleischepithels erforderlich ist. Ein solches Verfahren erfordert grundlegende Operationen wie die Herstellung von Samenzellen für das Tissue Engineering, In-vitro-Modelle von parodontalen assoziierten Erkrankungen und Materialien zur Reparatur von Parodontaldefekten.

Primäre Zahnfleischepithelzellen zeichnen sich durch eine geringe Teilungsrate in vitro4aus, Forscher suchen seit Jahrzehnten nach einer optimalen Isolations- und Kultivierungsmethode. Bis heute werden zwei verschiedene Techniken, eine Direktexplantenmethode und eine enzymatische Methode, üblicherweise in Laboratorien verwendet, um primäre Zahnfleischepithelzellen in vitrozu erhalten4,5. Die Direktexplant-Methode hat Vorteile wie die Anforderung einer geringeren Menge an Gewebeproben und ein einfaches Isolationsverfahren, hat jedoch die Nachteile einer längeren Kulturzeit und Kontaminationsanfälligkeit5. Obwohl die enzymatische Methode die benötigte Kulturzeit verkürzt, ist die Effizienz relativ gering und variiert je nach verwendeten Enzymen und Medium. Kedjarune et al.6 zeigten, dass die Direktentpflanzungsmethode, die mehr Zeit vor der Subkultur (2 Wochen) benötigt, für die Kultivierung von Zahnfleischepithelzellen erfolgreicher zu sein schien als die enzymatische Methode. Beim Vergleich dieser beiden Methoden fanden Klingbeil et al.7 jedoch heraus, dass die enzymatische Methode die besten Ergebnisse für Primärkulturen oraler Epithelzellen erzielte und es möglich war, die optimale Zellausbeute innerhalb kürzester Zeit zu erzielen (11,9 Tage gegenüber 14,2 Tagen).

Daher war es wichtig, eine bequemere und effektivere Methode zur Isolierung und Kultur oraler Epithelzellen zu entwickeln4. Wir haben bereits berichtet, dass die Zugabe von Y-27632, einem Inhibitor der Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK), das Isolationsverfahren von menschlichen primären epidermalen Zellen und Keratinozyten aus adultem Hautgewebe vereinfacht8,9,10. Wir entwickelten G-Medium, ein neues konditioniertes Impfmedium, das spontan epidermale von dermalen Zellen trennt und das Wachstum und dieAusbeuteprimärer epidermaler Zellen unterstützt 8,9,10. In der vorliegenden Studie haben wir eine neue serumfreie Isolations- und Kulturtechnik für Zahnfleischepithelzellen entwickelt, indem wir G-Medium mit Y-27632 kombiniert haben. Im Wesentlichen basiert unsere Methode auf einer Vereinfachung der traditionellen zweistufigen enzymatischen Methode, daher haben wir unsere neue Methode mit der Direktentstechtungsmethode verglichen. Diese modifizierte enzymatische Methode verkürzt signifikant die Zeit, die benötigt wird, um Zahnfleischepithelzellen vom Zahnfleischgewebe zu trennen, und erhöht die Effizienz der Kultivierung von Zahnfleischepithelzellen.

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Protokoll

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Menschliche Gewebe, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind frisches erwachsenes Zahnfleischgewebe, das aus Extraktionen betroffener Zähne in der Abteilung für Kiefer- und Gesichtschirurgie gemäß den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung der Institution (Protokoll Nr. GR201711, Datum: 27.02.2017).

1. Zubereitungen

  1. Sammeln Sie frisches erwachsenes Zahnfleischgewebe in 15-ml-Röhrchen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 3% Penicillin / Streptomycin (P / S) und halten Sie das Gewebe bei 4 ° C.
    HINWEIS: Behandeln Sie das Gewebe wie unten beschrieben innerhalb von 24 Stunden nach der Exzision.

2. Reagenzien und Kulturmedium vorbereiten

  1. Bereiten Sie die Waschlösung vor: 3% P / S. Mischen Sie 50 ml PBS mit 1,5 ml Penicillin (100 U / ml) und 1,5 ml Streptomycin (100 mg / L).
  2. Bereiten Sie 500 ml Wachstumsfaktor-haltiges Medium (G-Medium genannt) vor: DMEM/F12 (3:1) Medium mit 1% P/S, 2% B27-Ergänzung, 20 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 40 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) und 40 μg/ml Fungizon.
  3. Bereiten Sie Enzymaufschlusslösungen für die neue Methode vor: 125 mg Dispasepulver und 125 mg Kollagenasepulver Typ I in 50 ml DMEM auflösen.
    HINWEIS: Filtern Sie alle Enzymlösungen durch ein 0,22 μm Sieb und lagern Sie sie bei 4 °C.
  4. Bereiten Sie 500 ml des Mediums vor, um die enzymatische Verdauung zu neutralisieren: 10% fetales Rinderserum (FBS) und 1% P / S im DMEM-Medium.

3. Direkte Explant-Methode

  1. Zahnfleischgewebe Vorbehandlung
    1. Zahnfleischgewebe mit 5 ml 75% Ethanol für 30 s waschen. Anschließend zweimal mit 5 ml der Waschlösung (Schritt 2.1) für 5 min abspülen.
      HINWEIS: Führen Sie alle Waschungen in Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 50 mm durch.
  2. Zahnfleischepithelzellkultur
    1. Schneiden Sie das Zahnfleischgewebe in 1 mm3 Stücke und streuen Sie es in eine 100 mm Zellkulturschale. Verwenden Sie feine spitze Zinnen und Augenscheren für die Schneidoperationen.
    2. Das G-Medium (Schritt 2.2) in die Kulturschale geben. Anschließend wird die Kulturschale in einem 5%igen CO2-Inkubator bei 37 °C inkubiert. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop (40x), um das Gewebe alle 24 Stunden zu untersuchen.
    3. Entfernen Sie die Zahnfleischgewebestücke, wenn sich die Epithelzellen auf einen Durchmesser von 2-5 mm um die Gewebestücke herum vermehrt haben. Wechseln Sie das G-Medium alle 2-4 Tage.

4. Die neue modifizierte enzymatische Methode

  1. Zahnfleischgewebe Vorbehandlung
    1. Führen Sie dazu die gleichen Schritte aus, die für die Direktentstechtungsmethode in Schritt 3.1.1 beschrieben sind.
  2. Verdauung von Zahnfleischgewebe
    1. Schneiden Sie das Zahnfleischgewebe mit zwei sterilisierten Klingen in winzige Stücke, etwa <1 mm groß. Wiederholen Sie den Vorgang des Schredderns mit zwei chirurgischen Klingen.
    2. 1 ml 2,5 mg/ml Dispase + Kollagenase-Lösung wird in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit den Zahnfleischgewebestücken gegeben und dann das Röhrchen für 15-20 min in einem Inkubator bei 37 °C inkubiert.
    3. Wenn das Gewebe transparent und flockig wird, fügen Sie 1 ml der Neutralisationslösung hinzu, um die Verdauung zu beenden. Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie 10-15 Mal auf und ab pipettieren. Die Lösung wird durch einen 100 μm Netzfilter leiten.
    4. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.
    5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet am Boden in 10 ml wachstumsfaktorhaltigem Medium (Schritt 2.2). Die Zellsuspension wird in eine 100 mm Zellkulturschale überführen. 10 μM Y-27632 in die Zellkulturschale geben.
    6. Kulturieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator. Ersetzen Sie das alte G-Medium alle 2 Tage durch das frische G-Medium. Beobachten Sie die Zellen an Tag 1 und Tag 3.

5. Zellpassage

  1. Nehmen Sie die Schüssel aus dem Inkubator, entfernen Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie es zweimal mit PBS. Fügen Sie 2 ml 0,05% Trypsin für jede 100 mm Schüssel hinzu.
    HINWEIS: Schütteln Sie die Schüssel, um sicherzustellen, dass genügend Kontakt zwischen der Trypsinlösung und dem Schalenboden besteht.
  2. Lassen Sie die Schale in einem Inkubator ca. 5 min bei 37 °C für den Verdauungsprozess.
  3. Verwenden Sie ein Mikroskop (40x), um die Zellen zu untersuchen und sicherzustellen, dass sich die meisten Zellen vom Boden der Schüssel getrennt haben.
  4. Fügen Sie 2 ml der Neutralisationslösung hinzu, um die Verdauung zu stoppen und die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen zu überführen. Pipette 10-15 mal auf und ab. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min.
  5. Entfernen Sie den Überstand langsam. Resuspendieren Sie die Zellen mit 10 ml G-Medium und zählen Sie die Anzahl der Zellen.
  6. Etwa 1 x 106 Zellen in 10 ml G-Medium und 10 μM Y-27632 in jede 100 mm Schüssel geben.
  7. Erneuern Sie G-medium und Y-27632 alle 2 Tage. Sehen Sie sich die Zellen an Tag 1 und Tag 5 an.

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Ergebnisse

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Abbildung 1 zeigt ein schematisches Diagramm der Direktexplantmethode und der modifizierten enzymatischen Methode. Die Direktexplant-Methode benötigt während des gesamten Prozesses kein Verdauungsenzym. Im Gegensatz dazu benötigt die traditionelle enzymatische Methode normalerweise zwei Sätze von Verdauungsenzymen, Dispase und Kollagenase, um das Epithelblatt von der darunter liegenden Fibroblastenschicht zu trennen, und dann Trypsin, um die Epithelzellen in Suspension freizusetzen. Unsere n...

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Diskussion

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Das Zahnfleischgewebe ist eine Schlüsselstruktur, die die parodontale Integrität und Gesundheit aufrechterhält. Zahnfleischepithelzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Reparatur und Regeneration von Parodontalgewebe und können in der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Anwendungen und verwandten Bereichen, einschließlich oraler Biologie, Pharmakologie, Toxikologie und Mundschleimhautmängeln, eingesetzt werden18. Daher ist es notwendig, eine stabile und effiziente Methode zur Ernte ora...

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Offenlegungen

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Alle Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom Key Program der Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) und dem Key Research and Development Program der Provinz Shandong (2019GSF108107) an X.W. unterstützt; das Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm der Provinz Shandong (2018GSF118240) an J.G.; Medizinisches und Gesundheitswissenschaftliches und technologisches Entwicklungsprojekt der Provinz Shandong (2018WS163) an Z.X. und das Medizinische und Gesundheitswissenschaftliche und technologische Entwicklungsprojekt der Provinz Shandong (2019WS045) an J.S.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NamenAbkürzungen & Kommentare
Gräfin automatisierter ZellzählerShanghai Ruiyu Bio-science& Technologie Co.Ltd.BBA0218ACAutomatische Zellzählung
CO2-InkubatorThermo Scientific51026333Für die Zellinkubation
Sorvall ST 16R ZentrifugeThermo Scientific75004380Zellzentrifuge
ZellkulturschaleEppendorf30702115Für Zellkultur
50 ml ZentrifugenröhrchenKIRGEN171003Für die Zellzentrifugation
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenKIRGEN190691JFür den Zellaufschluss
ZellsiebCorning integriert431792Zellfiltration
Phosphatgepufferte LösungSolarbio Life ScienceP1020-500Waschlösung
DMEMThermo ScientificC11995500Bestandteil des Neutralisationsmediums
Definiert K-SFMLebensdauer Technologies10785-012Gingiva-Epithel-   Zellkulturmedium
Penicillin StreptomycinThermo Scientific15140-122Antibiotika
Fötales RinderserumBiologische Industrie04-001-1AC5Bestandteil des Neutralisationsmediums
0,05% TrypsinLife Technologies25300-062Für HGGEPCs Dissoziationsverdünnungsmedium
Life Technologies50-9701Für die Beschichtung der Matrix
DispaseGibco17105-041Für die Isolierung von HGGEPCs
Kollagenase Typ ILife Technologies17100-017Für die Isolierung von HGGEPCs
F12 Nutrient Mix, HamsLife Technologies31765035Komponente von G-Medium
B27 SupplementLife Technologies17504044Wachstumsfaktor in G-Medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595Wachstumsfaktor in G-Medium
Y-27632Gen OperationIAD1011 ROCK-Inhibitor
FungizoneGibco15290026Vorbereitung auf G-Medium
EGF Rekombinantes humanes ProteinGibcoPHG0311Wachstumsfaktor im G-Medium
Zellzählkit-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04Für Zellproliferationsassays
Kaninchen Anti-Human CK18Abcamab82254Für die Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung des Differenzierungsmarkers von HGGEPCs
Kaninchen Anti-Human Cytokeratin10Abcamab76318Für die Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung des Differenzierungsmarkers von HGGEPCs
Maus Anti-Human VimentinCell Signaling Technology3390Zur Immunfluoreszenzfärbung von Zahnfleischfibroblasten
Kaninchen Anti-Human pan-ckBD550951Zur Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung des Differenzierungsmarkers von HGGEPCs
Kaninchen anti-Ki67Abcam15580Zur Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung des Differenzierungsmarkers von HGGEPCs
Kaninchen Anti-p63Biolegend619002Für die Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung des Differenzierungsmarkers von HGGEPCs
Kaninchen anti-p75NGFRAbcamab52987Für die Immunfluoreszenzfärbung zur Überprüfung des Differenzierungsmarkers von HGGEPCs

Referenzen

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Prim re Zellisolationenzymatische MethodeROCK InhibitorGingivagewebeZellkulturGewebedigestionCollagenase Verdauorale Regeneration

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