Methodenartikel

Durchflusszytometrische Analyse zur Identifizierung der angeborenen und adaptiven Immunzellen der murinen Lunge

DOI:

10.3791/62985

⸱

16. November 2021

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 3Harvard College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Studie stellen wir ein effektives und reproduzierbares Protokoll zur Isolierung der Immunpopulationen der murinen Atemwege vor. Wir bieten auch eine Methode zur Identifizierung aller angeborenen und adaptiven Immunzellen, die sich in den Lungen gesunder Mäuse befinden, unter Verwendung eines 9-farbbasierten Durchflusszytometrie-Panels.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Atemwege stehen in direktem Kontakt mit der äußeren Umgebung und benötigen ein präzise reguliertes Immunsystem, um Schutz zu bieten und gleichzeitig unerwünschte Reaktionen auf Umweltantigene zu unterdrücken. Lungen beherbergen mehrere Populationen von angeborenen und adaptiven Immunzellen, die Immunüberwachung bieten, aber auch schützende Immunantworten vermitteln. Diese Zellen, die das gesunde Lungenimmunsystem im Gleichgewicht halten, nehmen auch an mehreren pathologischen Zuständen wie Asthma, Infektionen, Autoimmunerkrankungen und Krebs teil. Die selektive Expression von Oberflächen- und intrazellulären Proteinen verleiht den Immunzellen der Lunge einzigartige immunphänotypische Eigenschaften. Folglich spielt die Durchflusszytometrie eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung solcher Zellpopulationen während stationärer und pathologischer Zustände. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das eine konsistente und reproduzierbare Methode beschreibt, um die Immunzellen zu identifizieren, die sich in den Lungen gesunder Mäuse unter stationären Bedingungen befinden. Dieses Protokoll kann jedoch auch verwendet werden, um Veränderungen in diesen Zellpopulationen in verschiedenen Krankheitsmodellen zu identifizieren, um krankheitsspezifische Veränderungen in der Lungenimmunlandschaft zu identifizieren.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die murinen Atemwege enthalten ein einzigartiges Immunsystem, das für die Bekämpfung von Krankheitserregern und die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase verantwortlich ist. Das pulmonale Immunsystem besteht aus zellulären Populationen mit signifikanter Heterogenität in ihrem Phänotyp, ihrer Funktion, ihrem Ursprung und ihrem Standort. Residente alveoläre Makrophagen (AMs), die hauptsächlich aus fetalen Monozyten stammen, befinden sich im alveolären Lumen1, während sich aus dem Knochenmark stammende interstitielle Makrophagen (IMs) im Lungenparenchym befinden2. Sofortnachrichten können durch den Ausdruck CD206 weiter unt....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Studien und Experimente wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Beth Israel Deaconess Medical Center durchgeführt. Sechs bis zehn Wochen alte C57BL/6-Mäuse beiderlei Geschlechts wurden verwendet, um dieses Protokoll zu entwickeln.

1. Chirurgische Exzision und Gewebevorbereitung

  1. Euthanasie die Maus durch intraperitoneale Injektion von 1 ml Tribromethanol (hergestellt nach Standardprotokoll; Tabelle der Materialien).
    HINWEIS: CO2-Erstickung sollte in Lungenstudien vermieden werden, da sie Lungenverletzungen verursac....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gating-Strategie
Der erste Schritt unserer Gating-Strategie ist der Ausschluss der Ablagerungen und Dubletten (Abbildung 1A). Der sorgfältige Ausschluss von Dubletten ist entscheidend, um falsch-positive Populationen zu vermeiden (Ergänzende Abbildung S2). Anschließend werden Immunzellen mit CD45+, einem Marker für hämatopoetische Zellen, identifiziert (Abbildung 1B). Der lebende tote Fleck kann hinzugefügt werden,.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Identifizierung pulmonaler Immunzellen kann aufgrund der in der Lunge lebenden multiplen Immunzelltypen und ihrer einzigartigen immunphänotypischen Eigenschaften im Vergleich zu ihren in anderen Geweben lebenden Gegenstücken eine Herausforderung darstellen. Unter verschiedenen pathologischen Bedingungen treten Zellen mit ausgeprägten phänotypischen Merkmalen in der Lunge auf. Zum Beispiel führt eine Bleomycin-induzierte Lungenverletzung zur Rekrutierung von zirkulierenden Monozyten-abgeleiteten Makrophagen im Alveola.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V.A.B. hat Patente auf den PD-1-Signalweg, die von Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis und Dako lizenziert wurden. Die Autoren erklären keine anderen konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01CA238263 und R01CA229784 (VAB) unterstützt.

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 mL SpritzenkolbenEXELINT26265
18 G NadelnBD Precision Glide Nadel305165
21 G NadelnBD Precision Glide Nadel305195
50 mL konische RöhrchenFalcon3520
70 μ m cell SiebThermoFisher22363548
96-Well-PlattenFalcon/corning3799
ACK Lysing BufferThermoFisherA10492-01
Anti-Maus CD11bBiolegend101215Details siehe Tabelle 2
Anti-Maus CD11cBiolegend117339 / 117337siehe Tabelle 2
Anti-Maus CD45Biolegend103115Details siehe Tabelle 2
Anti-Maus CD64Biolegend139319Details siehe Tabelle 2
Anti-Maus CD68Biolegend137009Für Details siehe Tabelle 2
Anti-Maus GR-1Biolegend108433Für Details siehe Tabelle 2
Anti-Maus Siglec FBiolegend155503Für Details siehe Tabelle 2
AVERTINSigma-Aldrich240486
B220Biolegend103228Einzelheiten siehe Tabelle 2
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8
CD103Biolegend121405 / 121419siehe Tabelle 2
CD24Biolegend138503Einzelheiten siehe Tabelle 2
CD3Biolegend100205Für Details siehe Tabelle 2
Zentrifuge
Kollagenase Typ 1Worthington Biochemical CorpLS004196
CX3CR1Biolegend149005Für Details siehe Tabelle 2
DNase IMillipore Sigma10104159001
Ethanol
F4/80Biolegend123133Für Details siehe Tabelle 2
FcBlock (CD16/32)Biolegend101301Für Details siehe Tabelle 2
Fetal Bovine SerumR& D Systems
Fine Serrated PinzetteRoboz Chirurgisches Instrument Co
Foxp3 / Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-SetThermoFisher00-5523-00
Futura SicherheitsskalpellMerit Medical SystemsSMS210
Lebend/tot fixierbar Far Read Dead Cell Stain KitThermoFisherL34973Details siehe Tabelle 2
MERTKBiolegend151505Details siehe Tabelle 2
MHC-IIBiolegend107621Details siehe Tabelle 2
NK1.1Biolegend108705Details siehe Tabelle 2
Orbital ShakerVWRModell 200
PetrischaleFalcon351029
Gekühlte TischzentrifugeSORVAL ST 16R
Kleine gebogene SchereRoboz Chirurgisches Instrument Co
Details Für Für Einzelheiten

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  2. Tan, S. Y., Krasnow, M. A.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

DurchflusszytometrieImmunzellen der LungeIdentifizierung von ImmunzellenZellen des angeborenen ImmunsystemsEinzelzellsuspensionGating StrategieOberfl chenmarkerpulmonales Immunsystem

Verwandte Artikel