Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mikropattering overføring elektronmikroskopinett til direkte celleposisjonering i hele celler Cryo-Electron Tomography Arbeidsflyter

Published: September 13, 2021 doi: 10.3791/62992
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,2,3, 1,2,3,5
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 2Cryo-Electron Microscopy Research Center, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 3Midwest Center for Cryo-Electron Tomography, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 4Department of Chemistry, University of Wisconsin, Madison, 5Morgridge Institute for Research
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokollen er å lede celleadhesjon og vekst til målrettede områder av rutenett for kryo-elektronmikroskopi. Dette oppnås ved å påføre et anti-fouling lag som er ablated i brukerspesifiserte mønstre etterfulgt av avsetning av ekstracellulære matriseproteiner i de mønstrede områdene før cellesåing.

Abstract

Helcellet kryo-elektrontomografi (cryo-ET) er en kraftig teknologi som brukes til å produsere nanometernivåoppløsningsstrukturer av makromolekyler tilstede i cellulær kontekst og bevart i en nesten innfødt frossen-hydrert tilstand. Det er imidlertid utfordringer knyttet til å dyrke og/eller feste celler på TEM-rutenett på en måte som er egnet for tomografi, samtidig som cellene beholdes i sin fysiologiske tilstand. Her presenteres en detaljert trinnvis protokoll om bruk av mikropatterning for å lede og fremme eukaryotisk cellevekst på TEM-rutenett. Under mikropattering styres celleveksten ved å deponere ekstracellulære matriseproteiner (ECM) innenfor spesifiserte mønstre og posisjoner på folien til TEM-rutenettet, mens de andre områdene forblir belagt med et anti-begroingslag. Fleksibilitet i valg av overflatebelegg og mønsterdesign gjør mikropatterning bredt anvendelig for et bredt spekter av celletyper. Mikropatterning er nyttig for studier av strukturer i individuelle celler, samt mer komplekse eksperimentelle systemer som vertspatogeninteraksjoner eller differensierte multi-cellulære samfunn. Mikropattering kan også integreres i mange nedstrøms hele celle cryo-ET arbeidsflyter, inkludert korrelativt lys og elektronmikroskopi (cryo-CLEM) og fokusert ionstråle fresing (cryo-FIB).

Introduction

Med utvikling, ekspansjon og allsidighet av kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har forskere undersøkt et bredt spekter av biologiske prøver i en nesten innfødt tilstand fra makromolekylær (~ 1 nm) til høy (~ 2 Å) oppløsning. Enpartikkel kryo-EM og elektron diffraksjonsteknikker brukes best på rensede makromolekyler i henholdsvis løsning eller i krystallinsk tilstand. Mens kryo-elektrontomografi (cryo-ET) er unikt egnet for nesten innfødte strukturelle og ultrastrukturelle studier av store, heterofile gjenstander som bakterier, pleomorfiske virus og eukaryote celler3. I cryo-ET innhentes tredimensjonal (3D) informasjon ved å fysisk vippe prøven på mikroskopstadiet og skaffe seg en serie bilder gjennom prøven i forskjellige vinkler. Disse bildene, eller vippeseriene, dekker ofte et område på +60/-60 grader i trinn på én til tre grader. Tilt-serien kan deretter rekonstrueres til et 3D-volum, også kjent som et tomogram4.

Alle cryo-EM-teknikker krever at prøven bygges inn i et tynt lag med amorf, ikke-krystallinsk, glassaktig is. En av de mest brukte kryofikseringsteknikkene er dykkfrysing, hvor prøven påføres EM-rutenettet, blottet og raskt dyppet i flytende etan eller en blanding av flytende etan og propan. Denne teknikken er tilstrekkelig for vitrifisering av prøver fra <100 nm til ~ 10 μm i tykkelse, inkludert dyrkede menneskelige celler, for eksempel HeLa-celler5,6. Tykkere prøver, som miniorganoider eller vevsbiopsier, opptil 200 μm i tykkelse, kan vitrifiseres ved høytrykksfrysing7. På grunn av økt elektronspredning av tykkere prøver er imidlertid prøve- og istykkelsen for kryo-ET begrenset til ~ 0,5 - 1 μm i 300 kV overføringselektronmikroskop. Derfor er helcellet kryo-ET av mange eukaryote celler begrenset til celleperikodeien eller utvidelser av celler med mindre ytterligere prøveforberedelsestrinn brukes, for eksempel kryo-seksjonering8 eller fokusert-ion-stråle fresing9,10,11.

En begrensning av mange kryo-ET-bildeeksperimenter i hele celler er datainnsamlingsgjennomstrømming12. I motsetning til en-partikkel cryo-EM, hvor tusenvis av isolerte partikler ofte kan avbildes fra en enkelt TEM rutenett firkant, celler er store, spredt ut, og må dyrkes med lav nok tetthet til at cellene kan bevares i et tynt lag av glassaktig is. Interesseområdet er ofte begrenset til en bestemt funksjon eller et bestemt underområde i cellen. Ytterligere begrensende gjennomstrømning er cellenes tilbøyelighet til å vokse på områder som ikke er mottagelige for TEM-avbildning, for eksempel på eller i nærheten av TEM-rutenettstenger. På grunn av uforutsigbare faktorer knyttet til cellekultur på TEM-nett, er det nødvendig med teknologisk utvikling for å forbedre utvalgets tilgjengelighet og gjennomstrømning for datainnsamling.

Substratmikropattering med adherent ekstracellulære matriseproteiner (ECM) er en veletablert teknikk for levende cellelysmikroskopi for å lede veksten av celler på stive, holdbare og optisk gjennomsiktige overflater som glass og andre vevskultursubstrater13,14. Mikropattering er også utført på myke og/eller tredimensjonale (3D) overflater. Slike teknikker har ikke bare tillatt for presis plassering av celler; de har også støttet opprettelsen av multicellulære nettverk, for eksempel mønstrede nevrale cellekretser15. Å bringe mikropatterning til cryo-ET vil ikke bare øke gjennomstrømningen, men det kan også åpne opp nye studier for å utforske komplekse og dynamiske cellulære mikromiljø.

Nylig har flere grupper begynt å bruke mikropatterningsteknikker på TEM-rutenett gjennom flere tilnærminger16,17. Her beskrives bruken av en maskerløs fotopatteringsteknikk for TEM-rutenett ved hjelp av Alvéole PRIMO mikropatterningssystem, som har høy oppløsning og kontaktløs mønster. Med dette mikropatteringssystemet påføres et anti-fouling-lag på toppen av substratet, etterfulgt av påføring av en fotokaalyst og ablasjon av anti-fouling laget i brukerdefinerte mønstre med en UV-laser. ECM-proteiner kan deretter legges til mønstrene for riktig cellekultur. Denne metoden har blitt brukt av flere grupper for kryo-ET-studier av retinal pigment epitelial-1 (RPE1), Madin-Darby hunde nyre-II (MDCKII), human forhud fibroblast (HFF), og endotelcellelinjer16,17,18. Dette mikropatterningssystemet er kompatibelt med flere anti-fouling lag substrater samt enten en væske eller gel fotokatoklystrest reagens. En rekke ECM-proteiner kan velges fra og tilpasses spesifiktheten til cellelinjen, noe som gir allsidighet for brukeren.

Mikropattering har blitt brukt på en rekke prosjekter innen laboratoriet19. Her presenteres en mikropatterningsprotokoll, inkludert spesifikke tilpasninger for å studere dyrkede HeLa-celler, respiratorisk synytialvirus (RSV)-infiserte BEAS-2B-celler og primære larval Drosophila melanogaster neurons20.

Protocol

Protokollen som er beskrevet her er en samling av cellekulturen, mikropatterning og avbildningsmetoder som brukes av Wright lab og Cryo-EM Research Center ved University of Wisconsin, Madison. Arbeidsflyten presenteres i figur 1. Ytterligere opplærings- og instruksjonsmateriell er tilgjengelig på følgende steder: https://cryoem.wisc.edu eller https://wrightlab.wisc.edu

1. Utarbeidelse av gitter for mønster

  1. Overfør TEM-gitteret på en ren glasssklie, karbonsiden opp (standardtykkelsen på karbonfolien er 12 nm). Ved hjelp av en karbonfordamper, ACE600, fordampe 5-8 nm ekstra karbon på gitteret for å øke den generelle karbonfilm holdbarheten.
    MERK: Dette trinnet er ikke nødvendig for SiO2-rutenett . Dette trinnet kan også gjøres på forhånd; oppbevar de belagte gitterene i omgivelser med lav luftfuktighet, for eksempel en vakuumdesiccator.
  2. Overfør gitteret til en nettforberedelsesholder og glød utslipp gitteret karbonsiden opp. Bruk et glødeutladningssystem og glødeutladning av gitteret i 60 s ved 10 mA med en 80 mm arbeidsavstand og vakuumtrykk på 1,0 x 10-3 mbar. Gjør dette innen 15-30 min av neste trinn.
    MERK: Gitterforberedelsesholdere kan kjøpes kommersielt eller hjemmelaget med et stykke filterpapir på en liten Petri-tallerken.

2. Påføring av anti-fouling laget

MERK: Riktig steril teknikk bør brukes ved håndtering av gitteret, og alle løsninger skal steriliseres og/eller filtreres sterilisert.

  1. Overfør gitteret (karbonsiden opp) til en ren glasssklie eller deksler med minst 1 cm separasjon mellom gitteret. Pipette 10 μL 0,05% poly-L-lysin (PLL) på hvert rutenett. Inkuber gitteret i et fuktig kammer, for eksempel en lukket plastboks med fuktige papirhåndklær, i minst 30 minutter.
    MERK: Dette trinnet kan utvides til over natten. Pass på at fuktighetsnivået i kammeret er tilstrekkelig til å forhindre at gitteret tørker ut.
  2. Vask hvert rutenett tre ganger med 15 μL 0,1 M HEPES pH 8,5. For hver vask, fjern det meste av væsken fra rutenettet med en pipette uten å la gitteret tørke. Tilsett 15 μL fersk buffer, inkuber i minst 30 s og gjenta. La hvert gitter stå i 15 μL 0,1 M HEPES etter den endelige vasken.
    MERK: I dette trinnet og fremtidige trinn er det viktig å holde gitteret vått og for å unngå kontakt mellom pipetten og rutenettet.
  3. Forbered 10 μL 100 mg/ml polyetylenlykol-succinimidyl valerate (PEG-SVA) i 0,1 M HEPES pH 8,5 for hvert rutenett. PEG-SVA oppløses raskt med skånsom blanding, noe som resulterer i en klar løsning.
    MERK: Ikke klargjør PEG-SVA-oppløsningen på forhånd. PEG-SVA har en halveringstid på 10 min ved pH 8.5. Unngå å utsette PEG-SVA-lageret for mye fuktighet ved å oppbevare det i en tørkeovn eller et tørt miljø ved -20 °C og varme opp til romtemperatur før åpning.
  4. Umiddelbart etter at du har forberedt PEG-SVA-løsningen, fjerner du 15 μL-dråpen av HEPES pH 8.5 fra hvert rutenett (pass på at du ikke tørker rutenettet) og tilsett en 10 μL dråpe PEG-SVA-løsningen. Inkuber gitteret i et fuktig kammer i minst 1 time.
    MERK: Dette trinnet kan utvides til over natten. Pass på at fuktigheten i kammeret er tilstrekkelig til å forhindre at gitteret tørker ut.
  5. Vask hvert rutenett tre ganger med 15 μL sterilt vann. For hver vask, fjern det meste av væsken fra rutenettet med en pipette uten å la rutenettet tørke, tilsett 15 μL ferskvann, inkuber i minst 30 s og gjenta. La hvert rutenett stå i 15 μL vann etter den endelige vasken.

3. Påføring av PLPP gel

  1. Forbered et rent mikroskopdeksler for hvert rutenett. Fullfør følgende trinn for hvert rutenett, ett rutenett om gangen, for å minimere sjansen for at rutenettet tørker ut.
  2. Legg en 1,0 μL dråpe vann på midten av dekslene for å hjelpe til med å plassere gitteret på dekslene og holde rutenettet vått. Overfør forsiktig rutenettet fra 15 μL vanndråpen til 1,0 μL vanndråpen på dekslene. Pass på å plassere rutenettets karbonside opp.
  3. Plasser forsiktig en PDMS-sjablong (polydimetylsiloxane) over rutenettet, pass på at rutenettet er sentrert og for å minimere sjablongkontakten med karbonfolien i rutenettet.
  4. Tilsett 1,0 μL 4-benzoylbenzyl-trimethylammoniumklorid (PLPP) gel på gitteret. Pipette forsiktig å blande (ikke berør rutenettet med pipettespissen).
  5. Flytt dekslene med rutenettet til et mørkt sted for å tørke. Gelen tørker om ca. 15-30 min.

4. Kalibrering og design av mikropatternen

  1. Fargelegg den ene siden av et glassdeksle med en merkepenn. Legg til svarte linjer fra en finspisset permanent markør for å gjøre fokusering enklere. Plasser dekslene på mikroskopet slik at den fargede siden vender mot objektivlinsen. Fokuser på merkepennen ved hjelp av brightfield-modus.
  2. Kontroller at mikroskopet og mikropatterningssystemet er slått på, og at riktig lysbane er angitt. Åpne Micromanager og Leonardo-programvaren (Plugins > Leonardo) på mikroskopdatamaskinen.
  3. Velg kalibrer og følg instruksjonene på skjermen. Juster mikroskopfokuset slik at bildet som projiseres på lysbildet, er i fokus. Eksponeringstiden må kanskje reduseres. Velg Mønster nå etter kalibrering.
  4. Registrer mikrometeret/pikselforholdet (μm/px) som er rapportert under kalibreringsdata i det øverste venstre vinduet i programmet (figur 2, område 1). Bruk dette forholdet til å bestemme antall piksler som skal brukes per mikrometer når du utformer et mønster.
  5. Etter kalibrering må du sørge for at programvaren nå er åpen med en live brightfield-visning fra mikroskopet. Legg et forberedt rutenett på en deksleslip (del 3) på scenen med rutenettet vendt mot objektivet. Plasser trinnet og juster fokuset slik at rutenettet er synlig i programvarevinduet.
  6. Mål størrelsen på rutenettplassene og rutenettstengene i mikrometre. Programvaren inkluderer en linjal aktivert av knappen nær nedre venstre hjørne for å måle rutenettet (figur 2, område 2). Mønstrene som brukes her for et 200-nettrutenett, tilsvarer for eksempel ~87 × 87 μm rutenetttorg og ~36 μm rutenettstenger.
    MERK: Programvaren gir fleksibilitet i å endre størrelse på mønstre på farten, slik at mindre unøyaktigheter i måling kan tolereres.
  7. Basert på målene og forholdene ovenfor, opprett mønster (er) med hvilken som helst programvare for bildeoppretting. Minimumsstørrelsen med en målsetting på 20 × er 1,2 μm. Mønstre bør lagres som ukomprimerte 8-biters .tiff filer.
    1. Forsikre deg om at programvaren ikke skalerer bilder på nytt til en annen pikselstørrelse når du lagrer. Mønsteret skal passe innenfor en boks på 800 × 800 piksler, tilstrekkelig til å dekke fire rutenett firkanter.
      MERK: Piksler med en verdi på 255 (hvit) vil bli mønstret med høyest intensitet (total dose av laseren) og piksler med en verdi på null (svart) vil ikke bli mønstret. Alle bildepunkter med en mellomliggende verdi vil bli mønstret med en dose på ca. (X/255)*total dose. I figur 3A ble bildepunktverdier på 255 og 129 brukt for gråtonemønstrene. Når mønsteret er utformet, kan det lagres og brukes på nytt uten endring.

5. Mikropatterning

  1. Etter kalibrering må du sørge for at programvaren nå er åpen med en live brightfield-visning fra mikroskopet. Legg et forberedt rutenett på en deksleslip (del 3) på scenen med rutenettet vendt mot objektivet. Plasser trinnet og juster fokuset for å se rutenettet i programvaren.
  2. Hvis du vil kjøre for første gang, utformer du en ny mal. I programvaren velger du Legg til avkastning (vises ikke, i plasseringen av figur 2 område 3) og velger en sirkel på 3000 μm. Plasser sirkel-AVKASTNINGEN over rutenettet ved hjelp av brightfield-bildet på skjermen som en veiledning. Trykk på låsen for å feste avkastningen.
  3. Når du har låst avkastningen på plass, velger du Legg til mønster (vises ikke på plasseringen av figur 2-området 3). Velg mønsteret som er utformet i avsnitt 4. Del rutenettet i seks områder for å tillate uavhengig fokusering og posisjonering i hver region å ta hensyn til ujevne rutenett. En 8 × 8 rutenett firkantet område for hvert hjørne av rutenettet og en 2 × 8 rutenett firkantet område på hver side av midten, slik at de midterste fire rutenett firkanter unpatterned (Figur 2, midt bilde).
  4. Bruk replikeringsalternativene (figur 2, område 4) til å generere kopier av det opprinnelige mønsteret for å nå ønsket antall totale kopier av mønsteret. Juster avstanden mellom kopier slik at avstanden mellom rutenettplassene tilpasses om nødvendig.
  5. Angi totaldosen for mønsteret. 30 mJ/mm2 er et godt utgangspunkt. Se diskusjonsdelen hvis du vil ha mer informasjon.
  6. Under Ekspertalternativer (figur 2, område 4) justerer du vinkelen på regionen slik at den samsvarer med vinkelen på rutenettplassene. Områder kan omplasseres ved hjelp av musen. Forholdet (størrelsen) på mønstrene kan også justeres. Gjenta gjennom justering av vinkel, posisjon, avstand mellom og forholdet mellom mønsteret til mønstrene er på linje med rutenettets firkanter. Flytt mikroskopstadiet for å endre rutenettområdet i live brightfield-visningen.
  7. Trykk Lås for å lagre endringene som er gjort i området.
  8. Hvis du vil kopiere et område, klikker du Dupliser-knappen (figur 2, område 5, to arkikon) ved siden av navnet i prosedyrepanelet til venstre. Hvis du vil omplassere, gi nytt navn til eller redigere kopien, klikker du navnet i handlingspanelet.
  9. Gjenta trinn 5.4-5.9 etter behov for å fylle alle de ønskede områdene.
  10. Når hele malen er utformet og plassert, lagrer du malfilen i programvaren (figur 2, område 6, linje med pil opp-ikonet på den øverste verktøylinjen).
  11. Når du laster inn en tidligere lagret mal (linje med pil ned-ikon), midtstiller du avkastningen over rutenettet og trykker lås. Klikk på hvert område i handlingspanelet for å endre vinkelen, posisjonen, dosen og/eller mønsterfilen.
  12. Når malen og mønstrene er plassert, fjerner du merket for alle unntatt én av regionene i handlingspanelet i programvaren.
  13. Bruk mikroskopstadiet til å navigere til den regionen og fokusere på karbonfolie. Hvis du klikker eyeball-ikonet i handlingspanelet (figur 2, område 5), aktiveres eller deaktiveres visningen av mønsteroverlegget.
  14. Når rutenettet er i fokus, lukker du brightfield-lukkeren og trykker på Play-ikonet nederst til høyre i programvaren for å starte mønsterprosessen, som kan overvåkes live.
  15. Velg boksen for neste område i handlingspanelet. Åpne brightfield-lukkeren slik at rutenettet er synlig og midtstill området ved hjelp av mikroskopstadiet. Gjenta trinn 5.13-5.14 for hvert område i handlingspanelet.
  16. Fjern dekslene med gitteret fra mikroskopet, og rør straks 10 μL steril fosfatbufret saltvann (PBS) på gitteret.
  17. Etter 10 min, fjern sjablongen med pinsett, vask deretter rutenettet 3x med 15 μL PBS. Etter den endelige vasken plasserer du hvert rutenett i 15 μL PBS og flytter gitteret til et mørkt sted.

6. Avsetning av ECM-proteiner

  1. Følg trinn 6.2-6.5 for celler med kultur. for primære Drosophila-nevroner , følger du trinn 6.6-6.10.
  2. Forbered minst 15 μL ECM for hvert rutenett. For BEAS-2B celler, lag en endelig konsentrasjon på 0,01 mg/ml storfe fibronektin og 0,01 mg/ml fluoroforkonjugert fibrinogen i steril PBS. For HeLa celler, forberede 0,01 mg/ml bovin kollagen I og 0,1 mg/ml fluorofor-konjugert fibrinogen i steril PBS.
  3. Fjern mesteparten av PBS fra hvert rutenett og bruk 15 μL av ECM. Inkuber rutenettet i et fuktig kammer ved romtemperatur i minst 1 time.
    MERK: Dette trinnet kan forlenges til over natten ved 4 °C.
  4. Etter inkubasjon i ECM, vask hvert rutenett 5x med steril PBS. For hver vask, fjern det meste av væsken med en pipette uten å la rutenettet tørke, tilsett 15 μL fersk PBS, inkuber i minst 30 s, og gjenta. La hvert rutenett stå i PBS etter den endelige vasken.
    MERK: Gitter kan oppbevares i opptil en uke i PBS ved 4 °C uten observert forringelse av kvalitet.
  5. Bruk et fluorescensmikroskop for å oppdage fluoroforen i ECM for å bekrefte mønster og at karbonfolie forblir intakt. Noen få ødelagte firkanter er generelt tolererbare.
  6. For primære Drosophila-nevroner , flytt de mønstrede gitterene til en 30 mm glassbunnsfat som inneholder steril PBS.
  7. Aspirer PBS fra retten og påfør 2 ml 0,5 mg/ml fluoroforkonjugert konanavalin A. Inkuber over natten ved 25 °C i et sterilt miljø.
  8. Fjern concanavalin En løsning fra parabolen (uten å tørke gitteret) og vask gitteret 3x med PBS. For hver vask, tilsett og fjern 2 ml PBS fra parabolen.
  9. Bruk et fluorescensmikroskop for å oppdage fluoroforen i ECM for å bekrefte mønster og at karbonfolie forblir intakt. Noen få ødelagte firkanter er generelt tolererbare.
  10. Etter den endelige vasken, fjern PBS fra glassbunnsfatet og tilsett 2 ml nytilberedt, sterilt filtrert supplert Schneiders Drosophila media21, som inneholder 20% varmeinaktivert foster bovint serum (FBS), 5 μg/ml insulin, 100 μg/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin og 10 μg/ml tetracyklin. Inkuber ved 25 °C i et sterilt miljø til nevronene er klare til å bli belagt.

7. Fremstilling av primære Drosophila-celler før såing

  1. Steriliser en 55 mm disseksjonsfat med 70% EtOH, og legg deretter til parabolen 2-3 ml sterilfiltrert 1× disseksjonssalin (9,9 mM HEPES pH 7,5, 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM KH2PO4, 3,3 mM glukose, 43,8 mM sukrose)21.
  2. Velg 30-40 tredje instar larver forsiktig fra maten ved hjelp av et par pinsett.
  3. Plasser larvene i røret med 1× PBS, og overfør dem deretter til det andre røret med 1× PBS for å vaske larver.
  4. Overfør larvene inn i røret med 70% EtOH for å vaske av PBS, og overfør dem deretter til det andre røret med 70% EtOH. La larvene stå i det andre røret i 2-3 min for å sterilisere larver.
  5. Overfør larvene til et rør med 1× disseksjonssalin, og overfør dem deretter umiddelbart til det andre røret med 1× disseksjonssallin.
  6. Overfør individuelle larver på dissekeringsfatet som inneholder 1× disseksjonssylin. Med et par tang og et disseksjonsmikroskop, riv raskt hver larver for å trekke ut hjernen og overføre den til det tredje røret med 1× disseksjonssallin. Gjenta til alle hjerner er ekstrahert.
  7. Sentrifuger røret som inneholder hjernen på 300 x g i 1 min.
  8. Kast supernatanten, og vask med 1 ml 1× disseksjonssalt og sentrifuger røret ved 300 x g i 1 min. Gjenta dette trinnet én gang til.
  9. Kast supernatanten til 200-250 μL er igjen i røret og tilsett 20 μL 2,5 mg/ml Liberase i 1x disseksjonssalt.
  10. Roter røret på en rotator i 1 time ved romtemperatur; i løpet av denne timen, pipette løsningen 25-30 ganger hver 10 min. På slutten skal løsningen være litt ugjennomsiktig.
  11. Sentrifuger cellene ved 300 × g i 5 min.
  12. Kast supernatanten, og tilsett deretter 1 ml supplert Schneiders medier. Pipette løsningen 30 ganger for å blande.
  13. Sentrifuger cellene ved 300 × g i 5 min.
  14. Kast supernatanten og vask cellepelleten ved å legge til 1 ml supplert Schneiders medier. Pipette løsningen 30 ganger for å blande.
  15. Sentrifuger cellene ved 300 × g i 5 min.
  16. Kast supernatanten, og bruk deretter cellepelleten på nytt med 300 μL supplert Schneiders medier. Pipette løsningen 30-40 ganger for å blande.

8. Kultur- og RSV-infeksjon av BEAS-2B- og HeLa-celler

  1. Vedlikehold HeLa-celler og BEAS-2B-celler i T75-kolber ved 37 °C og 5 % CO2. Passasjeceller hver 3-4 dager når de når ca. 80% samløp. Vedlikehold HeLa-celler i DMEM + 10% FBS + 1× antibiotika-antimykotisk. Vedlikehold BEAS-2B i RPMI + 10% FBS + 1× Antibiotika-Antimykotisk6,22,23.
  2. For såing av uinferte celler, hopp til seksjon 9. BEAS-2B- og HeLa-celler er utsatt for RSV-infeksjon; BEAS-2B celler ble brukt til alle eksperimenter som involverer RSV vist her.
    MERK: Utfør alle BSL-2-trinn i samsvar med institusjonelle protokoller ved hjelp av et passende biosikkerhetsskap (BSC) og personlig verneutstyr (PVU).
  3. Før RSV-infeksjon av celler, passerer du 5 × 104 celler per brønn inn i en 6-brønns plate (overflateareal ~ 9,6 cm2) med 2 ml vekstmedier og inkuberer over natten.
  4. Prøv å telle og telle en brønn med celler. For å prøve, aspirere medier fra en brønn og vask med 2 ml steril PBS uten Mg2 + og Ca2 + for å fjerne gjenværende medier. Tilsett 500 μL 0,25% trypsinoppløsning. Inkuber ved 37 °C i 5-10 min. Kontroller cellene regelmessig for å se om de frigjøres fra overflaten. Når cellene er utgitt, legg til 1,5 ml kulturmedier.
  5. Bland 100 μL av trypsiniserte celler med 100 μL trypan blå. Pipette 10 μL fortynnet celleblanding i et hemocytometer. Tell cellene og beregn antall celler per brønn. Bruk dette tallet til å beregne MOI nedenfor.
  6. Forbered en fortynning av RSV-A2mK +24 i vekstmedier for å oppnå en MOI på 10 per brønn i 750 μL medier. MOI av RSV-A2mK + kan beregnes fra fluorescerende fokusenheter (FFU) titere av lageret (for eksempel: for 1,0 × 105 celler per brønn og en RSV-bestand på 1,0 × 108 FFU / ml, fortynne virusbestanden 1:75 til 1 × 106 FFU/750 μL eller 1,33 × 106 FFU/ml).
  7. Aspirer media fra cellene i 6-brønnsretten og tilsett 750 μL av den virale løsningen ovenfra til hver brønn.
  8. Rock platen ved romtemperatur i 1 time.
  9. Etter 1 time, ta det totale volumet per brønn opp til 2 ml med vekstmedier forvarmet til 37 °C og plasser platen i en inkubator satt til 37 °C med 5 % CO2 i 6 timer.
  10. Prøv cellene for å frigjøre dem og fortsett til såing som beskrevet nedenfor. Etter sådd, inkuber rutenettene i ytterligere 18 timer før du stuper frysing (for totalt 24 timer etter infeksjon).

9. Cellesåing på mikropatterned rutenett

  1. For celler med kultur følger du trinn 9.2-9.8; for primære Drosophila nevroner, følg 9.9-9.11.
  2. Prøv cellene for å frigjøre dem (se trinn 4 i avsnitt 8 ovenfor). Hvis du vil redusere celleaggregasjonen, kan du prøve å redusere cellene med 60 % eller mindre sammenløp.
  3. Bland 100 μL av trypsiniserte celler med 100 μL trypan blå. Pipette 10 μL av den fortynnede cellen blandes inn i et hemocytometer og teller cellene.
  4. Fortynn cellene i mediet til 2 × 104 celler/ml.
  5. Tilsett 1 μL medier i midten av en 30 mm glassbunnsfat for å hjelpe til med å plassere gitteret og forhindre at det tørker. Overfør rutenettet fra PBS på dekslene til midten av glassbunnsfatet. Tilsett 10 μL celleløsning i rutenettet.
  6. Bruk et brightfield mikroskop, observere celleadhesjon til rutenettet etter 5 min. Hvis et flertall av mønstrene forblir ubebodde, legger du til ytterligere 10 μL dråpe av celleløsningen. Hold gitter og celleoppløsning ved 37 °C under inkubasjonene.
  7. Gjenta trinn 9.6 til de fleste mønstre er opptatt eller mange okkuperte mønstre begynner å ha flere celler. Inkuber nettet i 2 timer i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
  8. Oversvømme retten med 2 ml forvarmede medier og inkuber over natten (37 °C, 5 % CO2).
  9. For primære Drosophila-nevroner , fjern mediet fra den rutenettholdige parabolen og tallerken cellene på parabolen.
  10. Vent 30-60 min for cellene å feste, og legg deretter til 2 ml supplert Schneiders medier.
  11. Kultur nevronene i en 25 °C inkubator i minst 2-3 dager før dypfrysing.

10. Avbildning og vitrifisering av mønstrede rutenett

  1. Plasser glassbunnsfatet som inneholder det mønstrede rutenettet og dyrkede celler på fluorescensmikroskopet.
  2. Skaff deg bilder av rutenettet ved hjelp av brightfield og de riktige fluorescerende kanalene for å oppdage mønsteret og annen merking i cellene. Sørg for at celletettheten og plasseringen er egnet for nedstrøms bildebehandling og analyse.
    MERK: Brightfield og fluorescerende bilder ble behandlet i FIJI-programvarepakken25.
  3. Forbered en kryo-stupe fryser; typen fryseenhet vil avhenge av tilgjengelighet, kostnad og funksjoner som passer best for prøven.
    MERK: Primære Drosophila-nevroner ble tilberedt på en automatisert dykkfryser, og BEAS-2B-cellene ble tilberedt ved hjelp av en halvautomatisk dykkfryser.
  4. Påfør gullfiducials på prøvene for riktig justering av tilt-serien. Flekkprøver for å fjerne overflødige medier, og dypp deretter prøvene i et kryogen, for eksempel flytende etan avkjølt av flytende nitrogen. For primære Drosophila nevroner, blott i 4 s fra baksiden. For HeLa- og BEAS-2B-celler, flekk fra begge sider i 4-6 s. De frosne gitterene kan deretter lagres i flytende nitrogen inntil videre bruk.
  5. Bilde vitrified celler i en kryo-elektron mikroskop, operert på 300 kV med en direkte elektron detektor kamera. Sett opp samling i vippeserien for hver interesseregion med programvare som SerialEM26 for cryo-EM/cryo-ET datainnsamling.
    MERK: Tilt-serien med primære Drosophila-nevroner ble samlet inn på en direkte elektrondetektor fra -60° til 60° toveis ved 2° trinn ved -8 μm defocus med en pikselstørrelse på 4,628 Å for en total dose på 70-75 e-/Å2. Tilt-serien av RSV-infisert BEAS-2B ble samlet på en direkte elektrondetektor med et energifilter (20 eV slit) ved -5 μm defocus med en pikselstørrelse på 4.603 Å og en total dose på ~ 80 e-/ Å2.
  6. Behandle vippeserien for å rekonstruere tomogrammer.
    MERK: Tomogrammer presentert her ble rekonstruert ved hjelp av IMOD-pakken27; lowpass-filtrering ble gjort ved hjelp av EMAN2-programvarepakken28.

Representative Results

Denne prosedyren ble brukt til å mønstre EM-rutenett for hele celle cryo-ET eksperimenter. Hele arbeidsflyten som presenteres i denne studien, inkludert innledende cellekulturforberedelser, mikropatterning (figur 1) og avbildning, omfatter 3-7 dager. En to-trinns prosedyre ble brukt til å generere anti-fouling laget ved å bruke PLL på rutenettet og deretter koble PEG ved tillegg av reaktiv PEG-SVA. Anti-fouling laget kan også påføres i et enkelt trinn ved å legge PLL-g-PEG i en inkubasjon. PLPP gel er en katalysator for UV-mikropatterning, som også er tilgjengelig som en mindre konsentrert væske. Gelen tillater mønster ved en betydelig redusert dose sammenlignet med væsken, noe som resulterer i mye raskere mønster. Med dette systemet var den faktiske mønstertiden til et fullt TEM-rutenett ~ 2 minutter. Mikropatteringsarbeidsflyten alene strekker seg vanligvis over 5-6 timer og gjør det mulig for en person å mønstre åtte rutenett for standard cellekultur på TEM-rutenett.

En rekke trinn under mikropatterningsprosessen krever lange inkubasjonstider (se trinn 2.1, 2.3, 6.4). Noen av disse trinnene, for eksempel PLL passivation (2.1) eller PEG-SVA passivation (2.3), kan utvides til en overnatting inkubasjon. I tillegg kan gitter mønstres på forhånd og lagres i en løsning av ECM-proteinet eller PBS for senere bruk. I vår studie var disse alternativene verdifulle i tilfeller der tidspunktet for celleforberedelse og såing er kritisk, for eksempel primære Drosophila-nevroner og RSV-infeksjon av BEAS-2B-celler.

Gitter ble utarbeidet i en generell biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) labinnstilling ved hjelp av rene verktøy, sterile løsninger og inkluderte antibiotika / antimykotika i vekstmediene6,22,29,30. For prøver som er spesielt følsomme for mikrobiell kontaminering, kan anti-begroingslaget og ECM påføres i en vevskulturhette eller andre sterile omgivelser. I tillegg kan rutenettet vaskes i etanol mellom mønster og ECM-applikasjon. Hvis du arbeider med smittsomme stoffer, er det viktig å tilpasse prosedyren for å overholde passende biosikkerhetsprotokoller.

Denne arbeidsflyten og prosedyrene som ble presentert (figur 1) tillot at HeLa-celler (figur 4), RSV-infiserte BEAS-2B-celler (figur 3, figur 5) og primære Drosophila larval-nevroner (figur 6, figur 7) ble sådd på mønstrede EM-rutenett for optimal kryo-ET-datainnsamling.

HeLa-celler som er sådd på mikropatternerte TEM-gitter, forblir levedyktige som bestemt av fluorescerende farging ved hjelp av en calcein-AM og ethidium homodimer-1 basert celle levedyktighetsanalyse (figur 4A, B). Ved hjelp av en blandet ECM av kollagen og fibrinogen holder HeLa-cellene seg lett til mønstre over hele rutenettet (figur 4A, C). Den generelle morfologien til celler som ekspanderer langs mønsteret, ligner på celler som vokser på uberørte rutenett (figur 4C, D). Når det gjelder HeLa-celler, forblir den totale celletykkelsen ~ < 10 μm med betydelig tynnere områder ~ < 1 μm tykk nær celleperiphery (figur 4E, F).

For RSV-studier mønstret vi hele rutenettstorg ved hjelp av en gradient, med en lavdoseeksponering på kantene og et høyere dosemønster mot midten (figur 3A). Graderingsmønstre ga bedre resultater når du søker etter frigjorte virus som finnes i nærheten av periferien av celler. Med disse mønstrene ble det funnet at celler fortrinnsvis holder seg til den høyere ECM-konsentrasjonen, men er også i stand til å følge og vokse på de lavere ECM-konsentrasjonene. Den relative dosen mellom områder må optimaliseres ved bruk av mønstre som krever flere doser. Hvis dosene og dermed ECM-konsentrasjonene er for like eller for forskjellige fra hverandre, vil effekten av å bruke flere doser gå tapt.

I figur 3 ble et TEM-rutenett mønstret og deretter sådd med RSV-infiserte BEAS-2B-celler og brukt til kryo-EM-datainnsamling. Figur 4A er et fluorescerende bilde av ECM mønstret på et TEM-rutenett ved hjelp av et graderingsmønster. Celleadhesjon og vekst langs den sentrale delen av mønsteret kan ses i figur 3B som et lysfeltbilde av cellene 18 timer etter sådd. I figur 3C er fluorescerende signal (rødt) fra replikering av RSV-A2mK+ overlagt med signal fra ECM. De fleste av de infiserte cellene er plassert langs den sentrale regionen med høyere tetthet i graderingsmønsteret. Et TEM-kart med lav mag av rutenettet etter kryofiksering avslører en rekke celler, inkludert RSV-infiserte celler, plassert på karbonfolie nær midten av rutenettplassene. Som tidligere vist for celler som vokste på standard TEM-rutenett22, ble vippeserier plassert og samlet inn RSV-virioner i nærheten av periferien av infiserte BEAS-2B-celler dyrket på mikropatternede rutenett (figur 5A, B). Mange av RSV-strukturelle proteiner kan identifiseres i tomogrammer, inkludert nukleocapsid (N) og viral fusjonsprotein (F) (henholdsvis figur 5C, blå og røde piler).

For primære Drosophila nevronstudier ble det funnet at det smale mønsteret, nær oppløsningsgrensen som tilbys av programvaren (hvor tykkelsen på mønsteret var 2 μm), tillot fra en til noen få celler å bli isolert innenfor en rutenett firkant (figur 6). Den nevronale soma var i stand til å utvide sine nevritter over en periode på flere dager innenfor mønsteret. Dette tillot enkel identifisering og tilt-serieoppkjøp av nevrittene sammenlignet med nevroner dyrket på uberørte rutenett (figur 7). Det ble også funnet at fluorescerende merket concanavalin A, en lectin som har blitt brukt som en ECM for in vitro Drosophila nevronkulturer20,21, er egnet for mønster.

Drosophila nevroner fra tredje instar larver ble isolert i henhold til tidligere publiserte protokoller20,21,31. De nevronale preparatene ble brukt på mikropatterned cryo-EM-rutenett der concanavalin A ble avsatt på mønsteret for å regulere celleplassering, spredning og organisering. Nevronene på mønstrede eller uberørte rutenett fikk lov til å inkubere i minst 48-72 timer, og rutenettene ble deretter stupt frosset. Et representativt bilde av et mikropattern EM-rutenett med flere Drosophila-nevroner fordelt over de mønstrede områdene er vist i figur 6A. Disse nevronene, avledet fra en transgen flystamme som har pan-neuronal GFP-uttrykk i membranen, kan lett spores av lysmikroskopi, ikke bare på grunn av fluorescerende merking, men også på grunn av sin plassering i mikropatternene. Mens nevroner dyrket på uberørte rutenett kan også spores gjennom sin GFP-signalering ved lysmikroskopi (figur 7A, gul sirkel), ble det betydelig vanskeligere å finne dem i kryo-EM på grunn av tilstedeværelsen av cellulær rusk og forurensning fra media (figur 7B, gul sirkel). Slik tilstedeværelse ble redusert for nevroner på mønstrede rutenett, sannsynligvis på grunn av PEG i anti-fouling-laget i de ikke-mønstrede områdene som avviser celleavfallet fra å overholde. På grunn av dimensjonene til nevroncellekroppen og de utvidede neurittene (figur 6A, B, gul sirkel), ble kryo-ET tilt-serien samlet langs tynnere områder av cellene (figur 6C, D, rød sirkel). Nevroncellemembranen, en mitokondrie (cyan), mikrotubuler (lilla), aktinfilamenter (blå), vesikulære strukturer (oransje og grønn) og makromolekyler som ribosomer (rød) ble godt løst i bildemontasjer og skiver med høyere forstørrelse gjennom 3D-tomogrammet (figur 6E). Mens lignende sub-cellulære funksjoner kan sees fra 3D-tomogrammer av uberørte nevroner (figur 7E), reduserte vanskeligheten med å finne levedyktige cellulære mål for datainnsamling betydelig gjennomstrømning.

I figur 8 er representative bilder fra rutenett med noen av disse problemene samlet for å hjelpe til med identifisering og feilsøking. Når optimale forhold er bestemt, er mikropatterning en pålitelig og reproduserbar metode for plassering av celler på rutenett for kryo-TEM.

Figure 1
Figur 1: Generell arbeidsflyt for mikropattering for kryo-EM. Arbeidsflyten kan grovt deles fire deler: Nettforberedelse, mikropattering, ECM og cellesåing, og kryoforberedelse og datainnsamling. Hovedtrinnene i hver del er oppført under overskriftene, og den omtrentlige tiden for å fullføre hver del vises til venstre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjermbilde av programvaren med mønster plassert på rutenettet. Areal 1 inneholder μm/pix-forholdet for mønsterdesign. Område 2 er linjalen for måling av et rutenett. Område 3 er stedet der du kan legge til eller endre mønstre og ROIer. Område 4 inneholder all informasjon for mønsterposisjonering og dose. Område 5 inneholder alternativer for mønstre, inkludert veksling av overlegg, kopiering eller sletting av mønstre, og valg av mønstre for mikropattering. Område 6 er stedet der maler kan lagres og lastes inn. Større utsikt over område 4 og 5 er vist nedenfor for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: RSV-infiserte BEAS-2B-celler på det mønstrede kryo-TEM-rutenettet. (A) Fluorescerende bilde av det mønstrede rutenettet etter tilsetning av fluorescerende merket ECM. Inndatamønsteret vises nederst i venstre hjørne. (B) Brightfield bilde av BEAS-2B celler dyrket på rutenettet i A. (C) Sammenslåing av bildet i A (cyan) og B (grå) med fluorescerende bilde av RSV-infiserte celler (rød) umiddelbart før dypfrysing; infiserte celler uttrykker mKate-2. Skalastenger er 500 μm. (D) Lavforstørrelse cryo-TEM kart over rutenettet i B etter dypfrysing. Fluorescerende bilder er pseudofargede. Skalastenger er 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Levende/død farging av mønstrede og ikke-oppdaterte celler. (A) Fluorescerende bilde av HeLa-celler dyrket på et mønstret rutenett og farget med calcein-AM (levende celleflekk, grønn) og ethidium homodimer-1 (død celleflekk, rød). (B) HeLa celler vokst på et uberørt rutenett og farget som i A. (C) Projeksjon av konfokale z-stabler av en HeLa celle på en mønstret Quantifoil R2/2 rutenett med 0.01 mg/ml kollagen og fibrinogen 647 ECM (rød). Cellen ble farget med calcein-AM (grønn) og Hoechst-33342 (blå). (D) HeLa celler på uberørt rutenett inkubert med 0,01 mg/ml kollagen og fibrinogen 647 ECM, inkubert og farget med calcein-AM og Hoecsht-33342. De fluorescerende bildene ble slått sammen med overført lys (gråtoner). (E) X, Z projeksjon av C. (F) X, Z projeksjon av D. Bilder er pseudocolored. Skalastolper i (A) og (B) er 500 μm; skalastenger i (C) - (F) er 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Cryo-ET av RSV-infisert BEAS-2B-celle på det mønstrede cryo-TEM-rutenettet. (A) Cryo-EM rutenett firkantet kart over RSV infisert BEAS-2B celle. Omtrentlig cellegrense angis av den stiplede grønne linjen. (B) Bilde med høyere oppløsning av areal bokset i rødt i (A). Omtrentlig cellegrense angis med stiplet grønn linje. RSV-virsjoner kan ses i nærheten av celleperi (hvit pil og gul boks). (C) Enkel z-skive fra tomogram samlet i området av den gule boksen i (B). Røde piler peker på RSV F fusjonsprotein, blå piler peker på ribonucleoprotein (RNP) komplekset. Skalalinjene i (A)-(C) er innebygd i bildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Primære nevroner avledet fra hjernen til tredje instar Drosophila melanogaster larver på mønstret cryo-TEM rutenett. (A) Overlaid levende celle fluorescens mikroskopi rutenett montasje av Drosophila nevroner uttrykker membran-målrettet GFP på mønstrede rutenett firkanter med 0,5 mg / ml fluorescerende concanavalin A. Grønn: Drosophila nevroner. Blå: Fotopattern. (B) Cryo-EM bildemontasje av rutenettet i (A) etter kryo-bevaring. Den gule sirkelen noterer samme rutenettsnrøyde som i (A). (C) Cryo-EM bildemontasje av firkanten uthevet av den gule sirkelen i (A) og (B). (D) Høyere forstørrelsesbilde av området avgrenset av den røde sirkelen i (C), der en vippeserie ble samlet inn på cellens neuritter. 25 nm tykk skive av et tomogram rekonstruert fra vippeserien som ble anskaffet fra den røde sirkelen i (C). Ulike organeller kan ses i dette tomogrammet, for eksempel mitokondriene (cyan), mikrotubuler (lilla), tette kjerne vesikler (oransje), lyse vesikler (grønn), endoplasmic retikulum (gul) og aktin (blå). Makromolekyler, som ribosomer (rød), kan også ses i øvre høyre hjørne. Fluorescerende bilder er pseudofargede. Skalalinjene i (A)-(E) er innebygd i bildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Primære nevroner avledet fra hjernen til tredje instar Drosophila melanogaster larver på uberørte rutenett. (A) Levende celle fluorescensmikroskopi rutenett montasje av Drosophila nevroner som uttrykker membran-målrettet GFP på rutenett firkanter med 0,5 mg / ml concanavalin A. Grønn: Drosophila nevroner. (B) Cryo-EM rutenettmontasje av samme rutenett i (A) etter dypfrysing. Gul sirkel viser samme rutenett firkantet som i (A). Legg merke til tilstedeværelsen av cellulær rusk og medieforurensning, noe som gjorde målidentifikasjon vanskelig sammenlignet med mønstrede rutenett. (C) Cryo-EM bildemontasje av torget uthevet av de gule sirklene i kartene (A) og (B). (D) Høyere forstørrelsesbilde av området avgrenset av den røde sirkelen i (C), der en vippeserie ble samlet inn på cellens neuritter. (E) 25 nm tykk skive av det rekonstruerte tomogrammet fra vippeserien fra (C) og (D). En rekke organeller er synlige i dette tomogrammet, for eksempel mikrotubuler (lilla), aktin (blå), endoplasmisk retikulum (gul) og tette kjerne vesicles (oransje). Makromolekyler, som ribosomer (rød), kan også ses. Fluorescerende bilder er pseudofargede. Skalalinjene i (A)-(E) er innebygd i bildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Eksempler på mulige problemer med mønster. Fluorescerende bilder av merket ECM deponert på mikropatterned rutenett. (A) Ujevn mønster over hele rutenettet på grunn av ujevn fordeling av PLPP gel. (B) ECM kan ikke følge områder som dekkes av PDMS-sjablongen under mønster. (C) Mettet graderingsmønster (høyre side) eller invertert mønster (venstre) på et rutenett mønstret med for høy total dose. (D) ECM holder seg til områder på rutenettstengene samt mønstret område på grunn av refleksjoner av UV-laseren under mønster. Bildene er pseudofargede. inndatamønsteret vises nederst til venstre. skalastenger er 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Utstede Potensiell(e) årsak(er) Feilsøking
Mikropatterning
Kan ikke se belysning fra PRIMO-laser • Lysbanen er ikke riktig konfigurert • Kontroller at mikroskoplysbanen er riktig konfigurert
• PRIMO-laseren er ikke på eller laseren er låst
Mange brutte rutenett firkanter • Berøring av gitterfolie med pinsett eller pipet under håndtering • Vær forsiktig når du håndterer gitter
• Gitter tørket ut under inkubasjoner eller vasking • Ikke la gitteret tørke under vask og inkubasjoner
Store områder som ikke er oppdatert • Utilstrekkelig geldekning • Sørg for at gelen sprer seg jevnt over gitteret mens du legger til
• Gitterfolie ute av fokus under mønster • Tilsett en ekstra mikroliter gel
•Areal dekket av sjablong • Kontroller fokuset før du mønstrer hver region
• Midtstill rutenettet forsiktig i sjablongen
Mettet eller invertert mønster • Feil dose • Prøv en rekke totale doser for mønster
• Utilstrekkelig geldekning • Sørg for at gitteret er jevnt dekket med gel
• Prøv forskjellige verdier for gråtonemønstre
Uklart mønster • Dårlig fokus under mønster • Gjenta PRIMO-kalibrering i samme høyde som prøven
• Feil kalibrering • Fokuser på gitterfolie før mønster
• Del mønsteret inn i flere områder for mønster
ECM holder seg utenfor mønsteret • Refleksjoner fra gel eller støv • Sørg for at gelen er tørr før du mønstrer
• Kontroller at dekslene og objektivlinsen er rene
ECM er ikke synlig etter mønster • Fotobleking • Minimer lyseksponeringen for ECM før avbildning
• Feil dose under mønster • Prøv et område med totale doseverdier for mønster
• Utilstrekkelig ECM inkubasjonstid • Øk inkubasjonstiden for ECM
Celle såing
Celler som klumper seg • Over fordøyelsen • Bruk lavere prosentandel av trypsin eller tid for frigjøring av adherentceller
• Høy celletetthet • Passasje og/eller fordøye celler ved lavere samløp
• Ikke rør celler under frigjøring
• Rør celleoppløsning forsiktig eller bruk cellesiler
Celler som ikke overholder mønstrede områder • ECM er ikke egnet for celletype • Prøv forskjellige ECM-konsentrasjoner og sammensetning
• Cellers levedyktighet reduseres før såing • Sørg for at cellekultur og celleutløsningsbetingelser ikke skader celler
Celler utvides ikke etter vedheft • ECM eller mønster som ikke er egnet for celletype • Prøv forskjellige mønstre og ECM
• I noen tilfeller kan en mer kontinuerlig folie (R1.2/20 vs R2/1) fremme celleutvidelse

Tabell 1: Potensielle problemer under mikropattering. Denne tabellen beskriver noen problemer en bruker kan oppleve under mikropattering eller cellesåing. Potensielle årsaker og feilsøking er gitt for hvert problem. Representative bilder av noen problemer kan ses i figur 8.

Discussion

Moderne, avanserte elektronmikroskoper og programvarepakker støtter nå strømlinjeformet automatisert kryo-EM- og cryo-ET-datainnsamling der hundrevis til tusenvis av stillinger kan målrettes og avbildes i løpet av få dager32,33,34,35. En betydelig begrensende faktor for kryo-ET-arbeidsflyter i hele cellen har vært å oppnå tilstrekkelig antall mål som kan samles inn per rutenett. Nylig har en rekke grupper utviklet protokoller for mikropatterning av rutenett for kryo-EM, med en fordel å forbedre datainnsamlingseffektiviteten16,17,18. Her presenteres en protokoll for bruk av et kommersielt tilgjengelig mikropatteringssystem til mikropattern TEM-rutenett for kryo-ET-studier av primære Drosophila-nevroner og kultiverte menneskelige cellelinjer (uinfisert eller RSV-infisert). Dette mikropatterningssystemet er allsidig, og mange trinn kan optimaliseres og skreddersys for å passe til spesifikke eksperimentelle mål. En bruker med TEM- og fluorescensmikroskopierfaring kan raskt bli dyktig i nettforberedelse og mikropattering. Med forsiktig praksis bør gode resultater oppnås etter noen gjentakelser. Nedenfor diskuteres noen av alternativene som er tilgjengelige, brukerhensyn, potensielle fordeler og fremtidige anvendelser av mikropattering for cryo-EM.

En av de viktige hensynene for hele celle cryo-ET er EM rutenettvalg. EM-gitter består av to deler: en maskeramme (eller strukturell støtte) og folien (eller filmen), som er den kontinuerlige eller hullete filmoverflaten som cellene vil vokse på. Kobbernettgitter brukes ofte til kryo-EM av proteiner og isolerte komplekser. Imidlertid er de uegnet for hele celle cryo-ET på grunn av cytotoksisiteten til kobber. I stedet brukes et gullnett ofte til cellulær tomografi. Andre alternativer inkluderer nikkel eller titan, som kan gi fordeler over gull som økt stivhet16. EM-rutenett er tilgjengelige med forskjellige maskedimensjoner for å støtte en rekke applikasjoner. Større maskestørrelser gir mer plass til celler å vokse mellom rutenett og flere områder som er egnet for vippeseriesamling, men på bekostning av økt generell prøveskjørhet. Den mest brukte folien er perforert eller hullete amorf karbon, for eksempel Quantifoils eller C-flate gitter. Biologiske mål kan avbildes enten gjennom hullene i karbonet eller gjennom det elektron-gjennomskinnelige karbonet. Gitter som R 2/1 eller R 2/2, der hullene er 2 μm brede som er henholdsvis 1 og 2 μm fra hverandre, gir et stort antall hull og dermed et stort antall potensielle områder for datainnsamling. Noen celler kan imidlertid vokse og ekspandere bedre på mer ensartede overflater som R 1.2/20 rutenett eller kontinuerlig karbon. For nedstrøms prøvebehandling ved fokusert ionstrålefresing (cryo-FIB) fjernes folien gjennom fresing, noe som reduserer bekymringene over den underliggende filmens fortsatte tilstedeværelse. Som med masken er folier fra andre materialer også tilgjengelige, med mønsterprotokollen presentert her som like egnet for SiO2-rutenett . Vanlige rutenett inkluderer gull Quantifoil, kontinuerlig karbon, eller SiO2 film 200-mesh rutenett (~ 90 μm avstand mellom rutenettstenger) for hele celle cryo-ET.

Det er en rekke hensyn å ta når du utformer et mønster. Et flertall av disse beslutningene styres av celletypen og formålet med eksperimentet. Et godt utgangspunkt er å velge et mønster som tilnærmer seg formen og dimensjonene til cellene i kulturen. Mange studier har vist signifikante effekter av mønsterform på cellevekst og cytoskeletal arrangement13,36,37. Spesiell forsiktighet bør tas under mønsterdesign hvis dette kan endre målet for interesse. Flere mønstre for hver celletype ble testet for å bestemme hvilke mønstre som fremmet cellulær vedheft og vekst. Fleksibiliteten til mikropatterningssystemet tillater testing av flere mønstre på et enkelt rutenett og endrede mønstre for forskjellige rutenett i et enkelt eksperiment. Større mønstre (~50-90 μm), for eksempel de som brukes her, øker sannsynligheten for at flere celler holder seg til ett enkelt område av mønsteret og lar cellene utvide seg og strekke seg etter vedheft. Mer begrensede mønstre (20-30 μm) kan være hensiktsmessige i eksperimenter der celleisolasjon er mer kritisk enn celleutvidelse, for eksempel for eksperimenter med stråle fresing (cryo-FIB). For tomografiapplikasjoner kan det hende man må vurdere virkningen av vippeaksen. Hvis et mønster er plassert slik at alle celler vokser parallelt med hverandre i en enkelt retning, er det mulig at alle cellene vil være vinkelrett på vippeaksen når de lastes inn i mikroskopstadiet, noe som resulterer i en lavere kvalitet på data.

På uberørte rutenett holder celler seg ofte fortrinnsvis til rutenettlinjene, der de ikke kan avbildes av TEM. Selv på mønstrede rutenett observeres celler ofte å være plassert i hjørnene av rutenett firkanter delvis på både mønstret karbonfolie og rutenettstang. Nylig ble mikropatterning brukt til å bevisst plassere en del av cellen over rutenettet bar18. Dette kan vurderes for eksperimenter der det ikke er kritisk å ha hele celleperiphery på folien. Dette kan være spesielt viktig for celler som kan bli større enn en enkelt rutenetts firkant, for eksempel primære nevroner som vokser over flere dager.

Det er mange verktøy som kan brukes til å designe et mønster. Her var mønsteret begrenset til mindre enn 800 piksler i en hvilken som helst dimensjon, slik at mønsteret kan roteres til en hvilken som helst vinkel og fortsatt passe innenfor det maksimale området som kan mønstres i en enkelt projeksjon av dette mikropatterningssystemet. Dette gjør at brukeren kan rotere mønsteret slik at det er riktig orientert med rutenettet uavhengig av retningen på rutenettet på mikroskopet. Her ble rutenettet delt inn i seks mønsterområder. Dette gjør det først og fremst mulig å justere fokus mellom ulike områder i rutenettet. Spesielt gullgitter er veldig formbare og kan ikke legge seg helt flatt på glasset. Riktig fokus er avgjørende for rene, raffinerte mønsterresultater. Ved å bruke segmenterte mønstre må det bare foretas mindre justeringer i mønsterposisjonen hvis rutenettet skifter litt under mønsterprosessen, selv om dette vanligvis ikke er et problem når du bruker PLPP-gelen med PDMS-sjablongene. Til slutt forble de sentrale fire rutenettplassene i rutenettet uberørt. Dette støtter en bruker som tydelig kan identifisere midten av rutenettet, noe som er veldig nyttig for korrelative bildebehandlingsforsøk.

Mønsterprogramvaren for dette mikropatterningssystemet, Leonardo, har også mer avanserte funksjoner som søm og muligheten til å importere mønstre som PDF-filer, som er utenfor omfanget av denne protokollen. Denne programvaren inkluderer også mikrostrukturdeteksjon og automatisert mønsterposisjonering som kan brukes på TEM-rutenett. Denne funksjonen er mest nyttig når rutenettet er veldig flatt og kan mønstres uten å måtte justere fokus mellom forskjellige områder.

Valg av et ECM-protein kan ha en betydelig innvirkning på celleadhesjon og ekspansjon. Noen celler er kjent for å gjennomgå fysiologiske endringer når de vokser på spesifikke substrater38. Flere ECM-proteiner og konsentrasjoner ble testet for alle nye celletyper basert på tidligere arbeid rapportert i litteraturen. Laminin, fibrinogen, fibronectin og kollagen er mye brukt til dyrkede celler og kan brukes som utgangspunkt hvis andre data ikke er tilgjengelige. Imidlertid må andre ECM-proteiner også vurderes hvis de ofte brukte ECM-proteinene ikke gir riktige tilslutningsegenskaper for cellene. Dette gjaldt spesielt for primære Drosophila-nevroner , da en høy konsentrasjon av plantens lectin concanavalin A var nødvendig for riktig cellulær overholdelse. Kompatibiliteten til cellulær vedheft og vekst med ECM kan testes ved å mønstre på glassretter eller lysbilder før overgangen til TEM-rutenett. Denne pre-screening tilnærmingen er tid og kostnadseffektiv hvis et stort antall kombinasjoner må undersøkes. Inkluderingen av et fluorescerende konjugert ECM-protein er verdifullt for å vurdere suksess og kvalitet på mønster.

Cellesåing er et av de viktigste trinnene for hele celle cryo-ET, enten med eller uten mikropatterning6,16,39. For primære Drosophila eller andre nevroner, som er skjøre, ustabile i suspensjon, og kan være begrenset i mengde, foretrekkes enkeltsåingsmetoder fremfor overvåket, sekvensiell cellesåing. Et enkelt såingstrinn med en optimalisert celletetthet, som beskrevet i protokollen for Drosophila-nevroner, er et levedyktig alternativ for de fleste celletyper. Det er imidlertid også mulig å frø celler på substratet ved en lavere innledende konsentrasjon og legge til flere celler på en overvåket måte som beskrevet her og i annen litteratur18. Denne sekvensielle såingen kan gi mer konsistente resultater i noen tilfeller. I likhet med standard cellekultur, bør det alltid tas hensyn til å opprettholde celle levedyktighet og minimere cellekumping under isolasjon.

Når du først starter med mikropatterning, er det noen få potensielle fallgruver som er skadelige for sluttresultatet. Forsiktig netthåndtering og steril teknikk, en jevn fordeling av PLPP gel, riktig dose og fokus under mønster, og vedlikehold av celle levedyktighet før såing er blant de viktigste hensynene for suksess. En liste over noen av de potensielle problemene samt løsningene ble satt sammen i tabell 1.

Mikropatterned rutenett kan brukes til å posisjonere celler for å etablere en konsekvent celletetthet over rutenettet og for å plassere områder av interesse i områder som passer for tilt-serie samling16,18. Plassering og posisjonering av celler kan brukes som fiducial markører for korrelasjon i kryo-CLEM-eksperimenter, noe som reduserer behovet for skjøre søkergitter og fluorescerende fiducial markører. Det skal imidlertid bemerkes at slike fiducial markører fortsatt kan være nyttige for submikrometernøyaktighetskorrelasjon29,40. Videre er en jevn fordeling av isolerte celler også svært gunstig for fokusert ionstråle fresing (cryo-FIB) eksperimenter for å maksimere antall celler hvor lamell kan kuttes16.

Tillegg av mikropatterning til cryo-EM-arbeidsflyter vil resultere i målbare forbedringer i datagjennomstrømning og potensielt muliggjøre nye eksperimenter. Etter hvert som teknikken blir videre tatt i bruk og utviklet, vil mer avanserte anvendelser av mikropatterning inkludert ECM-gradienter, flere ECM-avsetninger og mikrostrukturmontering ytterligere utvide egenskapene til kryo-ET for å studere biologiske mål og prosesser i full cellulær kontekst.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang og Mrs. Josephine W. Mitchell i Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison for sjenerøst å dele elav-Gal4, UAS-CD8::GFP flystamme (Bloomington stock center, #5146). Vi vil også takke Dr. Aurélien Duboin, Mr. Laurent Siquier og Ms. Marie-Charlotte Manus fra Alvéole og Mr. Serge Kaddoura fra Nanoscale Labs for deres generøse støtte under dette prosjektet. Dette arbeidet ble delvis støttet av University of Wisconsin, Madison, Institutt for biokjemi ved University of Wisconsin, Madison og folkehelsetjenesten gir R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 og U24 GM139168 til E.R.W. og R01 AI150475 til P.W.S. fra NIH. En del av denne forskningen ble støttet av NIH grant U24 GM129547 og utført ved PNCC ved OHSU og åpnet gjennom EMSL (grid.436923.9), et DOE Office of Science User Facility sponset av Office of Biological and Environmental Research. Vi er også takknemlige for bruken av fasiliteter og instrumentering ved Cryo-EM Research Center ved Institutt for biokjemi ved University of Wisconsin, Madison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% (w/v) Poly-L-Lysine Sigma P8920-100ML
0.22 µm syringe filters PVDF membrane Genesee 25-240
22x60-1 Glass cover slip Fisher 12545F
5/15 Tweezers EMS (Dumont) 0203-5/15-PO
Antibiotic-Antimycotic (100X) ThermoFisher (Gibco) 15240096
BEAS-2B cells ATCC CRL-9609
Collagen I, bovine ThermoFisher (Gibco) A1064401
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate ThermoFisher (Invitrogen) C11254
DMEM Fisher (Lonza) BW12-604F
EtOH Fisher (Decon Labs) 22-032-600
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate ThermoFisher (Invitrogen) F35200
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher (Gibco) 33010018
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-20-C
Glucose VWR 0643-1KG
Grid prep holder EMS 71175-01
HeLa cells ATCC CCL-2
Hemacytometer Fisher (SKC, Inc.) 22600100
HEPES Fisher (ACROS Organics) AC172572500
Hoechst 33342 ThermoFisher (Invitrogen) H3570
Insulin Fisher (Sigma Aldrich) NC0520015
KCl MP Bio 194844
KH2PO4 Fisher (ACROS Organics) AC212595000
Leica-DMi8 Leica Microsystems Can be customized with camera, stage, and objective attachments
Leonardo Alvéole https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/
Liberase Research Grade Fisher (Supply Solutions) 50-100-3280
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit ThermoFisher (Invitrogen) L3224
Microscope camera Hammamatsu C13440-20CU
Motorized stage Märzhäuser Wetzlar 00-24-599-0000
NaCl Fisher (Fisher BioReagents) BP358-1
NaH2PO4 Fisher (ACROS Organics) AC207802500
NaOH Fisher (Alfa Aesar) AAA1603736
PBS Corning 21-040-CV
PDMS stencils nanoscaleLABS PDMS_STENCILS_EM https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/
PEG-SVA nanoscaleLABS PEG-SVA-1GR mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000
Penicillin Fisher (Research Products International Corp) 50-213-641
pH strips Fisher (Millipore Sigma) M1095350001 pH probe can also be used
PLPP gel nanoscaleLABS PLPP-GEL-300UL https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/
PRIMO Alvéole https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/
pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA ) BEI Resources NR-36460 https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx
Quantifoil grids EMS (Quantifoil) Q2100AR1 2 µm holes spaced 1 µm apart, other dimensions are available
RPMI Fisher (Lonza) BW12-702F
RSV A2-mK+ see entry for pSynkRSV-19F - Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F
Schneider's Media ThermoFisher (Gibco) 21720-024
SerialEM SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ ) https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Straight tweezers EMS (Dumont) 72812-D
Streptomycin Fisher (Fisher BioReagents) BP910-50
Sucrose Avantor 4097-04
Tetracycline Sigma T8032-10MG
Titan Krios electron microscope ThermoFisher 300kV, with direct electron detector camera and energy filter
Trypsin ThermoFisher (Gibco) 15090046
Tube Revolver/Rotator Fisher (Thermo Scientific) 11676341
UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain Bloomington Drosophila Stock Center 5146 http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
  2. Martynowycz, M. W., Gonen, T. From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).
  3. Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  4. Wan, W., Briggs, J. A. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).
  5. Bäuerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing. bioRxiv. , 437159 (2021).
  6. Hampton, C. M., et al. Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells. Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).
  7. Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections. Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).
  8. Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues. Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).
  9. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  10. Gorelick, S., et al. PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy. Elife. 8, 45919 (2019).
  11. Wu, G. H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).
  12. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  13. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
  14. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  15. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).
  16. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  17. Engel, L., et al. Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).
  18. Engel, L., et al. Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts. bioRxiv. , 272237 (2021).
  19. Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids. bioRxiv. , 447251 (2021).
  20. Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
  21. Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).
  22. Ke, Z., et al. The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography. Viruses. 10 (8), (2018).
  23. Stobart, C. C., et al. A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation. Nature Communications. 7, 13916 (2016).
  24. Hotard, A. L., et al. A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis. Virology. 434 (1), 129-136 (2012).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  29. Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. , 107709 (2021).
  30. Ke, Z., et al. Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein. Nature Communications. 9 (1), 1736 (2018).
  31. Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. A new in situ neuronal model for cryo-ET. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).
  32. Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (2021).
  33. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  34. Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visual Experiments. (169), e62383 (2021).
  35. Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition. Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716 (2021).
  36. Anderson, D. E., Hinds, M. T. Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications. Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).
  37. McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
  38. Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. Use of extracellular matrix components for cell culture. Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).
  39. Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. 3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).
  40. Schellenberger, P., et al. High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers. Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).

Tags

Biokjemi Utgave 175 cellekultur maskerløs fotopatterning mikropattering kryo-elektronmikroskopi kryo-EM kryo-elektrontomografi kryo-ET korrelativt lys og elektronmikroskopi CLEM fluorescenslysmikroskopi fLM
Mikropattering overføring elektronmikroskopinett til direkte celleposisjonering i hele celler Cryo-Electron Tomography Arbeidsflyter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J.… More

Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows. J. Vis. Exp. (175), e62992, doi:10.3791/62992 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter