Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mikropapper transmission elektronmikroskopinät till direkt cellpositionering inom arbetsflöden för hela cell cryo-elektrontomografi

Published: September 13, 2021 doi: 10.3791/62992
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,2,3, 1,2,3,5
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 2Cryo-Electron Microscopy Research Center, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 3Midwest Center for Cryo-Electron Tomography, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 4Department of Chemistry, University of Wisconsin, Madison, 5Morgridge Institute for Research
* These authors contributed equally

Summary

Målet med detta protokoll är att rikta cell vidhäftning och tillväxt till riktade områden av rutnät för kryoelektronmikroskopi. Detta uppnås genom att applicera ett antifoulingskikt som ableras i användarspecificerade mönster följt av deponering av extracellulära matrisproteiner i de mönstrade områdena före cellsådd.

Abstract

Helcellig kryoelektrontomografi (cryo-ET) är en kraftfull teknik som används för att producera nanometernivåupplösningsstrukturer av makromolekyler som finns i cellulära sammanhang och bevaras i ett nästan inbyggt frusethydratiserat tillstånd. Det finns dock utmaningar förknippade med odling och/eller vidhäftning av celler på TEM-rutnät på ett sätt som är lämpligt för tomografi samtidigt som cellerna behålls i deras fysiologiska tillstånd. Här presenteras ett detaljerat steg-för-steg-protokoll om användningen av mikropapper för att styra och främja eukaryota celltillväxt på TEM-nät. Under mikropapper riktas celltillväxten genom att deponera excellulära matrisproteiner (ECM) inom angivna mönster och positioner på folien i TEM-rutnätet medan de andra områdena förblir belagda med ett antifoulingskikt. Flexibilitet i valet av ytbeläggning och mönsterdesign gör mikropapper i stort sett tillämpligt för ett brett spektrum av celltyper. Mikropapper är användbart för studier av strukturer inom enskilda celler samt mer komplexa experimentella system som värdpatogeninteraktioner eller differentierade multicellulära samhällen. Mikropapper kan också integreras i många nedströms helcells cryo-ET-arbetsflöden, inklusive korrelativt ljus och elektronmikroskopi (cryo-CLEM) och fräsning av fokuserad jonstråle (cryo-FIB).

Introduction

Med utvecklingen, expansionen och mångsidigheten hos kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) har forskare undersökt ett brett spektrum av biologiska prover i ett nästan inhemskt tillstånd från makromolekylär (~ 1 nm) till hög (~ 2 Å) upplösning. Cryo-EM- och elektrondiffraktionstekniker med en partikel tillämpas bäst på renade makromolekyler i lösning eller kristallint tillstånd, respektive1,2. Medan kryoelektrontomografi (cryo-ET) är unikt lämpad för nästan inhemska strukturella och strukturella studier av stora, heterologa föremål som bakterier, pleomorfa virus och eukaryota celler3. I kryo-ET erhålls tredimensionell (3D) information genom att fysiskt luta provet på mikroskopstadiet och förvärva en serie bilder genom provet i olika vinklar. Dessa bilder, eller tilt-serien, täcker ofta ett intervall på +60/-60 grader i steg om en till tre grader. Tilt-serien kan sedan omvandlas beräkningsmässigt till en 3D-volym, även känd som ett tomogram4.

Alla kryo-EM-tekniker kräver att provet är inbäddat i ett tunt lager av amorf, icke-kristallin, glasaktig is. En av de vanligaste kryofixeringsteknikerna är dykfrysning, där provet appliceras på EM-nätet, blottas och snabbt kastas in i flytande etan eller en blandning av flytande etan och propan. Denna teknik är tillräcklig för vitrifikation av prover från <100 nm till ~ 10 μm i tjocklek, inklusive odlade mänskliga celler, såsom HeLa-celler5,6. Tjockare prover, såsom miniorganoider eller vävnadsbiopsier, upp till 200 μm i tjocklek, kan vitrifieras genom högtrycksfrysning7. Men på grund av ökad elektronspridning av tjockare prover är prov- och istjockleken för cryo-ET begränsad till ~ 0,5 - 1 μm i 300 kV transmissionselektronmikroskop. Därför är helcells cryo-ET av många eukaryota celler begränsad till cellens periferi eller förlängningar av celler om inte ytterligare provberedningssteg används, såsom kryosektion8 eller fokuserad jonstråle fräsning9,10,11.

En begränsning av många helcells cryo-ET-avbildnings experiment är datainsamling genom flöde12. Till skillnad från enpartikel cryo-EM, där tusentals isolerade partiklar ofta kan avbildas från en enda TEM-rutnät kvadrat, celler är stora, utspridda och måste odlas med tillräckligt låg densitet för att cellerna ska kunna bevaras i ett tunt lager av glasaktig is. Ofta är den intressanta regionen begränsad till en viss funktion eller underområde i cellen. Ytterligare begränsande dataflöde är cellernas benägenhet att växa på områden som inte är mottagliga för TEM-avbildning, till exempel på eller nära TEM-rutnätsstaplar. På grund av oförutsägbara faktorer i samband med cellkultur på TEM-nät behövs teknisk utveckling för att förbättra urvalets tillgänglighet och genomströmning för datainsamling.

Substratmikrutnätning med vidhäftande excellulära matrisproteiner (ECM) är en väletablerad teknik för levande cellljusmikroskopi för att styra tillväxten av celler på styva, hållbara och optiskt transparenta ytor som glas och andra vävnadsodlingssubstrat13,14. Micropatterning har också utförts på mjuka och/eller tredimensionella (3D) ytor. Sådana tekniker har inte bara gjort det möjligt att exakt placera celler. De har också stött skapandet av multicellulära nätverk, såsom mönstrade neurala cellkretsar15. Att föra mikropapper till cryo-ET kommer inte bara att öka genomströmningen, men det kan också öppna upp nya studier för att utforska komplexa och dynamiska cellulära mikromiljö.

Nyligen har flera grupper börjat använda mikropapperstekniker på TEM-rutnät genom flera tillvägagångssätt16,17. Här beskrivs användningen av en masklös fotopappersteknik för TEM-galler med hjälp av Alvéole PRIMO mikropapperssystem, som har högupplöst och kontaktlös mönstra. Med detta mikropapperssystem appliceras ett antifoulingskikt på toppen av substratet, följt av applicering av en fotokatalys och ablation av anti-fouling-skiktet i användardefinierade mönster med en UV-laser. ECM-proteiner kan sedan tillsättas till mönstren för lämplig cellkultur. Denna metod har använts av flera grupper för cryo-ET studier av retinal pigment epitelial-1 (RPE1), Madin-Darby hund njure-II (MDCKII), humant förhud fibroblast (HFF) och endotel cellinjer16,17,18. Detta mikropapperssystem är kompatibelt med flera antifoulingskiktssubstrat samt antingen en flytande eller gel photocatalyst reagens. En mängd olika ECM-proteiner kan väljas från och anpassas för cellinjens specificitet, vilket ger mångsidighet för användaren.

Micropatterning har framgångsrikt tillämpats på ett antal projekt inom laboratoriet19. Här presenteras ett mikropatterning protokoll, inklusive specifika anpassningar för att studera odlade HeLa celler, respiratory syncytial virus (RSV)-infekterade BEAS-2B celler och primära larval Drosophila melanogaster nervceller20.

Protocol

Protokollet som beskrivs här är en sammanställning av cellkultur, mikropatterning och bildframställningsmetoder som används av Wright-labbet och Cryo-EM Research Center vid University of Wisconsin, Madison. Arbetsflödet visas i bild 1. Ytterligare utbildnings- och instruktionsmaterial finns på följande platser: https://cryoem.wisc.edu eller https://wrightlab.wisc.edu

1. Förberedelse av galler för mönstra

  1. Överför TEM-gallret till en ren glasrutschbana, kolsidan uppåt (kolfoliens standardtjocklek är 12 nm). Med hjälp av en kolförångare, ACE600, avdunstar 5-8 nm extra kol på näten för att öka den totala kolfilmens hållbarhet.
    OBS: Det här steget är inte nödvändigt för SiO2-rutnät . Detta steg kan också göras i förväg. förvara de belagda gallren i en miljö med låg luftfuktighet, t.ex. en vakuumavsickering.
  2. Överför gallret till en nätförberedande hållare och glöd urladda nätens kolsida uppåt. Med hjälp av ett glödurladdningssystem, glöd urladda gallret för 60 s vid 10 mA med ett 80 mm arbetsavstånd och vakuumtryck på 1,0 x 10-3 mbar. Gör detta inom 15-30 min från nästa steg.
    OBS: Grid prep hållare kan köpas kommersiellt eller hemlagad med en bit filterpapper på en liten Petri maträtt.

2. Applicering av antifoulingskiktet

OBS: Korrekt steril teknik bör användas vid hantering av gallret, och alla lösningar ska vara sterila och/eller filtrera steriliserade.

  1. Överför gallret (kolsidan uppåt) till en ren glasrutschbana eller täckslip med minst 1 cm separation mellan gallren. Pipetter 10 μL 0,05 % poly-L-lysin (PLL) på varje galler. Inkubera gallret i en fuktig kammare, till exempel en sluten plastlåda med fuktiga pappershanddukar, i minst 30 minuter.
    OBS: Detta steg kan förlängas till över natten. Se till att luftfuktigheten i kammaren är tillräcklig för att förhindra att gallret torkar ut.
  2. Tvätta varje galler tre gånger med 15 μL av 0,1 M HEPES pH 8,5. För varje tvätt, ta bort det mesta av vätskan från gallret med en pipett utan att låta gallret torka. Tillsätt 15 μL färsk buffert, inkubera i minst 30 s och upprepa. Lämna varje galler i 15 μL av 0,1 M HEPES efter den slutliga tvätten.
    OBS: I detta steg och framtida steg är det viktigt att hålla gallret vått och att undvika kontakt mellan pipetten och gallret.
  3. Förbered 10 μL 100 mg/ml polyetenglykol-succinimidylvalerat (PEG-SVA) i 0,1 M HEPES pH 8,5 för varje galler. PEG-SVA löses upp snabbt med skonsam blandning vilket resulterar i en tydlig lösning.
    OBS: Förbered inte PEG-SVA-lösningen i förväg. PEG-SVA har en halveringstid på 10 min vid pH 8,5. Undvik att utsätta PEG-SVA-beståndet för överdriven fukt genom att förvara det i en avsickare eller torr miljö vid -20 °C och värma upp rumstemperatur innan det öppnas.
  4. Omedelbart efter beredningen av PEG-SVA-lösningen, ta bort 15 μL-droppen HEPES pH 8,5 från varje galler (var försiktig så att du inte torkar gallret) och tillsätt en 10 μL-droppe PEG-SVA-lösningen. Inkubera gallret i en fuktig kammare i minst 1 h.
    OBS: Detta steg kan förlängas till över natten. Se till att luftfuktigheten i kammaren är tillräcklig för att förhindra att gallret torkar ut.
  5. Tvätta varje galler tre gånger med 15 μL sterilt vatten. För varje tvätt, ta bort det mesta av vätskan från gallret med en pipett utan att låta gallret torka, tillsätt 15 μL färskvatten, inkubera i minst 30 s och upprepa. Lämna varje galler i 15 μL vatten efter den slutliga tvätten.

3. Applicering plppgel

  1. Förbered ett rent mikroskoptäcke för varje galler. Slutför följande steg för varje rutnät, ett rutnät i taget, för att minimera risken för att gallret torkar ut.
  2. Placera en 1,0 μL droppe vatten på mitten av täckslipet för att hjälpa till att placera gallret på täckslipet och hålla gallret vått. Överför försiktigt gallret från vattenfallet på 15 μL till vattenfallet på 1,0 μL på täckslipet. Var noga med att placera nätets kolsida uppåt.
  3. Placera försiktigt en polydimethylsiloxan (PDMS) stencil över gallret, var noga med att hålla gallret centrerat och minimera stencilkontakt med kolfolien i gallret.
  4. Tillsätt 1,0 μL 4-bensoylbenzyl-trimethylammoniumkloridgel (PLPP) på gallret. Pipetten försiktigt för att blanda (rör inte vid gallret med pipettspetsen).
  5. Flytta täcket med gallret till en mörk plats för att torka. Gelén torkar om cirka 15-30 min.

4. Kalibrering och utformning av mikromönster

  1. Färg ena sidan av ett glasöverdrag med en överstrykningspenna. Lägg till svarta linjer från en finspetsad permanent markör för att göra fokuseringen enklare. Placera täcket på mikroskopet så att den färgade sidan är vänd mot objektivet. Använd brightfield-läge och fokusera på överstrykningspenna.
  2. Se till att mikroskopet och mikropapperssystemet är påslagna och att rätt ljusväg är inställd. Öppna Micromanager och Leonardo-programvaran (Plugins > Leonardo) på mikroskopdatorn.
  3. Välj kalibrera och följ anvisningarna på skärmen. Justera mikroskopfokuset så att bilden som projiceras på bilden är i fokus. Exponeringstiden kan behöva minskas. Efter kalibrering väljer du Mönster nu.
  4. Registrera förhållandet mikrometer/pixel (μm/px) som rapporteras under kalibreringsdata i programmets övre vänstra fönster (figur 2, område 1). Använd det här förhållandet om du vill bestämma hur många pixlar som ska användas per mikrometer när du utformar ett mönster.
  5. Efter kalibrering, se till att programvaran nu är öppen med en levande ljusfältsvy från mikroskopet. Ladda ett förberett galler på ett täckslip (avsnitt 3) på scenen med gallret vänt mot objektivet. Placera scenen och justera fokus så att rutnätet är synligt i programfönstret.
  6. Mät storleken på rutnätsrutorna och rutnätsstängerna i mikrometrar. Programvaran innehåller en linjal som aktiveras av knappen nära det nedre vänstra hörnet för att mäta rutnätet (bild 2, område 2). Till exempel motsvarar de mönster som används här för ett 200-nätnät ~ 87 × 87 μm rutnätsrutor och ~ 36 μm rutnätsstänger.
    OBS: Programvaran erbjuder flexibilitet i storleksändringsmönster i farten, så att mindre felaktigheter i mätningen kan tolereras.
  7. Baserat på mätningarna och proportionerna ovan skapar du mönster med alla program för att skapa bilder. Minsta funktionsstorlek med ett mål på 20 × är 1,2 μm. Mönster bör sparas som okomprimerade 8-bitars .tiff filer.
    1. Se till att programvaran inte skalar om bilder till en annan pixelstorlek när du sparar. Mönstret ska passa i en 800 × 800 pixellåda, tillräcklig för att täcka fyra rutnätsrutor.
      OBS: Pixlar med värdet 255 (vit) mönstras med högsta intensitet (laserns totala dos) och pixlar med värdet noll (svart) kommer inte att mönstras. Alla pixlar med ett mellanvärde kommer att mönstras med en dos på ungefär (X/255)*total dos. I figur 3A användes pixelvärdena 255 och 129 för gråskalemönstren. När mönstret är utformat kan det sparas och återanvändas utan modifiering.

5. Micropatterning

  1. Efter kalibrering, se till att programvaran nu är öppen med en levande ljusfältsvy från mikroskopet. Ladda ett förberett galler på ett täckslip (avsnitt 3) på scenen med gallret vänt mot objektivet. Placera scenen och justera fokus för att se rutnätet i programvaran.
  2. För en första körning utformar du en ny mall. I programvaran väljer du Lägg till ROI (visas inte, på platsen för figur 2 område 3) och väljer en cirkel på 3 000 μm. Placera cirkeln ROI över rutnätet med hjälp av brightfield-bilden på skärmen som en guide. Tryck på lås för att säkra AVKASTNINGEN.
  3. När du har låst ROI-spärren väljer du Lägg till mönster (visas inte på platsen för figur 2 område 3). Välj det mönster som är utformat i avsnitt 4. Dela upp rutnätet i sex regioner så att oberoende fokusering och positionering i varje region kan vägas in i ojämna rutnät. En 8 × 8 rutnät kvadratiska region för varje hörn av rutnätet och en 2 × 8 rutnät kvadratisk region på varje sida av mitten, lämnar mitten fyra rutnät kvadrater unpatterned (bild 2, mitt bild).
  4. Använd replikeringsalternativen (bild 2, område 4) för att generera kopior av det ursprungliga mönstret för att nå önskat antal totala kopior av mönstret. Justera avståndet mellan kopiorna så att avståndet mellan rutnätsrutorna om det behövs.
  5. Ställ in den totala dosen för mönstret. 30 mJ/mm2 är en bra utgångspunkt. Mer information finns i diskussionsavsnittet.
  6. Under Expertalternativ (bild 2, område 4) justerar du regionens vinkel så att den matchar rutnätsrutornas. Regioner kan flyttas med musen. Förhållandet (storleken) på mönstren kan också justeras. Iterera genom att justera vinkeln, positionen, mellanrummet mellan och förhållandet mellan mönstret tills mönstren ligger i linje med rutnätsrutorna. Flytta mikroskopstadiet för att ändra rutnätets region i den levande brightfield-skärmen.
  7. Tryck på Lås för att spara ändringarna i regionen.
  8. Om du vill kopiera ett område klickar du på knappen Duplicera (bild 2, område 5, två pappersark) bredvid namnet på åtgärdspanelen till vänster. Om du vill flytta, byta namn på eller redigera kopian klickar du på dess namn på åtgärdspanelen.
  9. Upprepa steg 5.4-5.9 om det behövs för att fylla alla önskade regioner.
  10. När den fullständiga mallen har utformats och placerats sparar du mallfilen i programvaran (bild 2, område 6, stapel med upppilsikon i det övre verktygsfältet).
  11. När du läser in en tidigare sparad mall (stapel med nedpilsikon) centrerar du avkastningen över rutnätet och trycker på Lås. Klicka på varje region i åtgärdspanelen för att ändra vinkel, position, dos och/eller mönsterfil.
  12. När mallen och mönstren är placerade avmarkerar du alla regioner utom en av regionerna i åtgärdspanelen i programvaran.
  13. Använd mikroskopstadiet för att navigera till den regionen och fokusera på kolfolien. Om du klickar på ögongloben på åtgärdspanelen (bild 2, område 5) aktiveras eller inaktiveras visningen av mönsteröverlägget.
  14. När rutnätet är i fokus stänger du brightfield-slutaren och trycker på Play-ikonen längst ner till höger i programvaran för att påbörja mönstraringsprocessen, som kan övervakas live.
  15. Markera rutan för nästa region på åtgärdspanelen. Öppna brightfield-slutaren så att rutnätet är synligt och centrera regionen med hjälp av mikroskopstadiet. Upprepa steg 5.13-5.14 för varje region i åtgärdspanelen.
  16. Ta bort täcket med gallret från mikroskopet och rör omedelbart 10 μL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på gallret.
  17. Efter 10 min, ta bort stencilen med pincett och tvätta sedan gallret 3x med 15 μL PBS. Efter den slutliga tvätten placerar du varje galler i 15 μL PBS och flyttar gallret till en mörk plats.

6. Nedfall av ECM-proteiner

  1. För odlade celler, följ steg 6.2-6.5; för primära Drosophila nervceller, följ steg 6,6-6,10.
  2. Förbered minst 15 μL ECM för varje rutnät. För BEAS-2B-celler, bered en slutlig koncentration av 0, 01 mg/ml bovin fibrokectin och 0, 01 mg/ml fluoroforkonjugerad fibrinogen i steril PBS. För HeLa-celler bereder du 0,01 mg/ml bovint kollagen I och 0,1 mg/ml fluoroforkonjugerad fibrinogen i steril PBS.
  3. Ta bort det mesta av PBS från varje nät och applicera 15 μL ecm. Inkubera gallret i en fuktig kammare vid rumstemperatur i minst 1 h.
    OBS: Detta steg kan förlängas till över natten vid 4 °C.
  4. Efter inkubation i ECM, tvätta varje galler 5x med steril PBS. För varje tvätt, ta bort det mesta av vätskan med en pipett utan att låta gallret torka, tillsätt 15 μL färsk PBS, inkubera i minst 30 s och upprepa. Lämna varje galler i PBS efter den slutliga tvätten.
    OBS: Galler kan förvaras i upp till en vecka i PBS vid 4 °C utan observerad kvalitetsförsämring.
  5. Använd ett fluorescensmikroskop för att detektera fluoroforen i ECM för att bekräfta mönstrar och att kolfolien förblev intakt. Några trasiga rutor är i allmänhet tolerabla.
  6. För primära Drosophila-nervceller , flytta de mönstrade gallren till en 30 mm glasbottenskål som innehåller steril PBS.
  7. Aspirera ut PBS från skålen och applicera 2 ml fluoroforkonjugerat konjugerat konanavalin A. Inkubera över natten vid 25 °C i steril miljö.
  8. Ta bort konanavalin En lösning från skålen (utan att torka gallren) och tvätta gallret 3x med PBS. För varje tvätt, tillsätt och ta bort 2 ml PBS från skålen.
  9. Använd ett fluorescensmikroskop för att detektera fluoroforen i ECM för att bekräfta mönstrar och att kolfolien förblev intakt. Några trasiga rutor är i allmänhet tolerabla.
  10. Efter den slutliga tvätten, ta bort PBS från glasbottenskålen och tillsätt 2 ml nyberedd, sterilfiltrerad kompletterad Schneiders Drosophila media21, innehållande 20% värmeinaktiverat fetalt bovinserum (FBS), 5 μg/ml insulin, 100 μg/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin och 10 μg/ml tetracyklin. Inkubera vid 25 °C i en steril miljö tills nervcellerna är redo att pläteras.

7. Beredning av primära Drosophilaceller före sådd

  1. Sterilisera en 55 mm dissekeringsfat med 70% EtOH och tillsätt sedan till skålen 2-3 ml sterilfiltrerad 1× dissekeringssaltlösning (9,9 mM HEPES pH 7,5, 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM NaH2PO4, 0,22 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM NaH2PO4, 0,22 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM NaH2PO4, 0,22 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0
  2. Välj 30-40 3: e instar larver försiktigt från maten med ett par pincett.
  3. Placera larverna i röret med 1× PBS och överför dem sedan till det andra röret med 1× PBS för att tvätta larverna.
  4. Överför larverna till röret med 70% EtOH för att tvätta av PBS och överför dem sedan till det andra röret med 70% EtOH. Lämna larverna i det andra röret i 2-3 min för att sterilisera larverna.
  5. Överför larverna till ett rör med 1× dissekeringssaltlösning och överför dem omedelbart till det andra röret med 1× dissekeringssaltlösning.
  6. Överför enskilda larver till dissekeringsfatet som innehåller 1× dissekeringssaltlösning. Med ett par tångar och ett dissekeringsmikroskop, riv snabbt varje larver för att extrahera hjärnan och överföra den till det tredje röret med 1× dissekeringssaltlösning. Upprepa tills alla hjärnor extraheras.
  7. Centrifugera röret som innehåller hjärnorna vid 300 x g i 1 min.
  8. Kassera supernatanten och tvätta med 1 ml 1× dissekeringssaltlösning och centrifugera röret vid 300 x g i 1 min. Upprepa det här steget en gång till.
  9. Kassera supernatanten tills 200-250 μL lämnas kvar i röret och tillsätt 20 μL 2,5 mg/ml Liberase i 1x dissekeringssaltlösning.
  10. Rotera röret på en rotator i 1 h vid rumstemperatur; under denna timme, pipetten lösningen 25-30 gånger var 10: e minut. I slutet bör lösningen vara något ogenomskinlig.
  11. Centrifugera cellerna vid 300 × g i 5 min.
  12. Kassera supernatanten och tillsätt sedan 1 ml kompletterade Schneiders media. Pipettera lösningen 30 gånger för att blanda.
  13. Centrifugera cellerna vid 300 × g i 5 min.
  14. Kassera supernatanten och tvätta cellpelleten genom att tillsätta 1 ml kompletterat Schneiders media. Pipettera lösningen 30 gånger för att blanda.
  15. Centrifugera cellerna vid 300 × g i 5 min.
  16. Kassera supernatanten och återanvänd sedan cellpelleten med 300 μL kompletterat Schneiders media. Pipettera lösningen 30-40 gånger för att blanda.

8. Kultur- och RSV-infektion av BEAS-2B- och HeLa-celler

  1. Underhåll HeLa-celler och BEAS-2B-celler i T75-flaskor vid 37 °C och 5 % CO2. Passageceller var 3-4 dagar när de når cirka 80% sammanflöde. Underhåll HeLa-celler i DMEM + 10% FBS + 1× Antibiotisk- antimykotisk. Behåll BEAS-2B i RPMI + 10% FBS + 1× Antimycotic6,22,23.
  2. För sådd av oinfekterade celler, hoppa till avsnitt 9. BEAS-2B och HeLa celler är mottagliga för RSV infektion; BEAS-2B celler användes för alla experiment med RSV visas här.
    OBS: Utför alla BSL-2 steg i enlighet med institutionella protokoll med hjälp av ett lämpligt biosäkerhetsskåp (BSC) och personlig skyddsutrustning (PPE).
  3. Före RSV-infektion av celler, passage 5 × 104 celler per brunn i en 6-brunnsplatta (yta ~ 9,6 cm2) med 2 ml tillväxtmedium och inkubera över natten.
  4. Prova och räkna en brunn av celler. För att trypsinize, aspirera media från en brunn och tvätta med 2 ml steril PBS utan Mg2 + och Ca2 + för att ta bort restmedia. Tillsätt 500 μL trypsinlösning på 0,25 %. Inkubera vid 37 °C i 5-10 min. Kontrollera regelbundet cellerna för att se om de frigörs från ytan. När cellerna har släppts lägger du till 1,5 ml kulturmedium.
  5. Blanda 100 μL trypsiniserade celler med 100 μL trypanblått. Pipetten 10 μL utspädd cellblandning till en hemocytometer. Räkna cellerna och beräkna antalet celler per brunn. Använd det här talet för att beräkna MOI nedan.
  6. Förbered en utspädning av RSV-A2mK+24 i tillväxtmedier för att uppnå en MOI på 10 per brunn i 750 μL media. MOI för RSV-A2mK+ kan beräknas från fluorescerande fokusenheter (FFU) titrar i beståndet (till exempel: för 1,0 × 105 celler per brunn och ett RSV-lager på 1,0 × 108 FFU / ml, späd viruslagret 1:75 till 1 × 106 FFU / 750 μL eller 1.×750 μL).
  7. Aspirera media från cellerna i 6-brunnsfatet och tillsätt 750 μL av viruslösningen ovanifrån till varje brunn.
  8. Gunga plattan i rumstemperatur i 1 h.
  9. Efter 1 h, ta den totala volymen per brunn upp till 2 ml med tillväxtmedier förvärmda till 37 °C och placera plattan i en inkubator inställd på 37 °C med 5% CO2 för 6 h.
  10. Prova cellerna för att frigöra dem och fortsätt till sådd enligt beskrivningen nedan. Efter sådd, inkubera gallret i ytterligare 18 timmar före doppfrysning (för totalt 24 h efter infektion).

9. Cellsådd på mikromönster

  1. För odlade celler, följ steg 9.2-9.8; för primära Drosophila nervceller, följ 9,9-9,11.
  2. Prova cellerna för att frigöra dem (se steg 4 i avsnitt 8 ovan). Om du vill minska cellaggregeringen provar du cellerna med 60 % eller mindre sammanflöde.
  3. Blanda 100 μL trypsiniserade celler med 100 μL trypanblått. Pipetten 10 μL av den utspädda cellblandningen i en hemocytometer och räkna cellerna.
  4. Späd cellerna i media till 2 × 104 celler/ml.
  5. Tillsätt 1 μL media i mitten av en 30 mm glasbottenskål för att hjälpa till att placera gallret och förhindra att det torkar. Överför gallret från PBS på täckslipet till mitten av glasbottenskålen. Tillsätt 10 μL celllösning i gallret.
  6. Använd ett ljusfältsmikroskop och observera cell vidhäftningen till rutnätet efter 5 minuter. Om en majoritet av mönstren förblir obemannade, tillsätt ytterligare 10 μL droppe av celllösningen. Håll galler och celllösning vid 37 °C under inkubationerna.
  7. Upprepa steg 9.6 tills de flesta mönster är upptagna eller många upptagna mönster börjar ha flera celler. Inkubera gallret i 2 timmar i inkubatorn (37 °C, 5% CO2).
  8. Översvämma skålen med 2 ml förvärmt media och inkubera över natten (37 °C, 5% CO2).
  9. För primära Drosophila-nervceller , ta bort mediet från den gallerhaltiga skålen och platta cellerna på skålen.
  10. Vänta 30-60 min på att cellerna ska fästas och tillsätt sedan 2 ml kompletterat Schneiders media.
  11. Odla nervcellerna i en 25 °C inkubator i minst 2-3 dagar före doppfrysning.

10. Avbildning och vitrifikation av mönstrade galler

  1. Placera glasbottenskålen som innehåller det mönstrade gallret och de odlade cellerna på fluorescensmikroskopet.
  2. Hämta bilder av rutnätet med hjälp av brightfield och lämpliga fluorescerande kanaler för att upptäcka mönstret och annan märkning i cellerna. Se till att celltätheten och placeringen är lämpliga för nedströms avbildning och analys.
    OBS: Brightfield och fluorescerande bilder bearbetades i FIJI-programvarupaketet25.
  3. Förbered en kryo-dopp frys; Vilken typ av frysanordning beror på tillgänglighet, kostnad och funktioner som är mest lämpliga för provet.
    OBS: Primära Drosophila nervceller förbereddes på en automatiserad avsvalkning-frys, och BEAS-2B celler förbereddes med hjälp av en halvautomatisk avsvalkning-frys.
  4. Applicera guldfiducials på proverna för korrekt inriktning av tiltserien. Blot prover för att ta bort överflödiga medier, sedan dopp-frysa proverna i en kryogen, såsom flytande etan kyls av flytande kväve. För primära Drosophila nervceller, fläcka i 4 s från baksidan. För HeLa och BEAS-2B celler, fläck från båda sidor för 4-6 s. De frusna galler kan sedan förvaras i flytande kväve tills vidare.
  5. Bild vitrifierade celler i ett kryoelektronmikroskop, som drivs vid 300 kV med en direkt elektrondetektorkamera. Konfigurera insamling av tilt-serien för varje region av intresse med programvara som SerialEM26 för insamling av cryo-EM/cryo-ET-data.
    OBS: Tilt-serien av primära Drosophila nervceller samlades på en direkt elektrondetektor från -60° till 60° dubbelriktade i 2° steg vid -8 μm defokus med en pixelstorlek på 4.628 Å för en total dos av 70-75 e-/Å2. Tilt-serien av RSV-infekterade BEAS-2B samlades på en direkt elektrondetektor med ett energifilter (20 eV slits) vid -5 μm defokus med en pixelstorlek på 4.603 Å och en total dos på ~80 e-/Å2.
  6. Bearbeta tiltserien för att rekonstruera tomogram.
    OBS: Tomogram som presenteras här rekonstruerades med hjälp av IMOD-paketet27; lowpass-filtrering gjordes med hjälp av EMAN2-programvarupaketet28.

Representative Results

Denna procedur användes för att mönster EM galler för hela cell cryo-ET experiment. Hela arbetsflödet som presenteras i denna studie, inklusive initiala cellodlingspreparat, mikropatterning (figur 1) och avbildning, omfattar 3-7 dagar. Ett tvåstegsförfarande användes för att generera antifoulingskiktet genom att applicera PLL på gallret och därefter länka PEG genom tillsats av den reaktiva PEG-SVA. Antifoulingskiktet kan också appliceras i ett enda steg genom att tillsätta PLL-g-PEG i en inkubation. PLPP-gelen är en katalysator för UV-mikropapper, som också finns som en mindre koncentrerad vätska. Gelén möjliggör mönstra med en signifikant reducerad dos jämfört med vätskan, vilket resulterar i mycket snabbare mönstra. Med det här systemet var den faktiska mönseringstiden för ett fullständigt TEM-rutnät ~ 2 minuter. Mikropappersarbetsflödet ensamt sträcker sig i allmänhet över 5-6 timmar och gör det möjligt för en individ att mönstra åtta rutnät för standardcellkultur på TEM-rutnät.

Ett antal av stegen under mikropappersprocessen kräver långa inkubationstider (se steg 2.1, 2.3, 6.4). Bekvämt kan vissa av dessa steg, såsom PLL-passivering (2.1) eller PEG-SVA-passivering (2.3), utvidgas till en inkubation över natten. Dessutom kan galler mönstras i förväg och lagras i en lösning av ECM-proteinet eller PBS för senare användning. I vår studie var dessa alternativ värdefulla i fall där tidpunkten för cellberedning och sådd är avgörande, såsom primära Drosophila nervceller och RSV-infektion av BEAS-2B celler.

Galler förbereddes i en allmän biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) labbinställning med hjälp av rena verktyg, sterila lösningar och inkluderade antibiotika/ antimykotika i tillväxtmediet6,22,29,30. För prover som är särskilt känsliga för mikrobiell kontaminering kan antifoulingskiktet och ECM appliceras i en mjukpappersvåg eller annan steril miljö. Dessutom kan gallret tvättas i etanol mellan mönstrar och ECM-applikation. Vid arbete med smittämnen är det viktigt att anpassa proceduren för att följa lämpliga biosäkerhetsprotokoll.

Detta arbetsflöde och de förfaranden som presenterades (figur 1) tillät HeLa-celler (figur 4), RSV-infekterade BEAS-2B-celler (figur 3, figur 5) och primära Drosophila larvneuroner (figur 6, figur 7) att sådd på mönstrade EM-rutnät för optimal insamling av kryo-ET-data.

HeLa-celler som såts på mikropatternerade TEM-galler förblir livskraftiga enligt fluorescerande färgning med hjälp av en kalcein-AM och etidium homodimer-1 baserad cell livskraft analys (figur 4A, B). Med hjälp av en blandad ECM av kollagen och fibrinogen klibbar HeLa-celler lätt till mönster över gallret (figur 4A, C). Den övergripande morfologin för celler som expanderar längs mönstret liknar den för celler som odlas på ej uppredda rutnät (figur 4C,D). När det gäller HeLa-celler förblir den totala celltjockleken ~< 10 μm med betydligt tunnare områden ~< 1 μm tjocka nära cellens periferi (figur 4E,F).

För RSV-studier mönstrade vi hela rutnätsrutor med en gradient, med låg dosexponering på kanterna och ett högre dosmönster mot mitten (figur 3A). Gradientmönster gav bättre resultat när man söker efter utsläppta virus som finns nära cellernas periferi. Med dessa mönster, celler konstaterades företrädesvis hålla sig till den högre ECM koncentrationen, men också kunna hålla sig till och växa på de lägre ECM koncentrationerna. Den relativa dosen mellan områden måste optimeras vid användning av mönster som kräver flera doser. Om doserna och därmed ECM koncentrationerna är för lika eller alltför olika varandra, effekten av att använda flera doser kommer att gå förlorad.

I figur 3 mönstrades ett TEM-rutnät och såddes därefter med RSV-infekterade BEAS-2B-celler och användes för insamling av kryo-EM-data. Figur 4A är en fluorescerande bild av ECM mönstrad på ett TEM-rutnät med hjälp av ett gradientmönster. Cell vidhäftning och tillväxt längs den centrala regionen av mönstret kan ses i figur 3B som en ljusfältsbild av cellerna 18 timmar efter sådd. I figur 3C överlagras fluorescerande signal (röd) från replikering av RSV-A2mK+ med signal från ECM. Majoriteten av de infekterade cellerna är placerade längs den centrala regionen med högre densitet i gradientmönstret. En TEM-karta med låg mag av rutnätet efter kryofixering avslöjar ett antal celler, inklusive RSV-infekterade celler, placerade på kolfolien nära mitten av rutnätsrutorna. Som tidigare visats för celler som odlats på standard TEM-galler22, var tilt-serien lokaliserade och samlades in av RSV-virions i närheten av periferin av infekterade BEAS-2B celler odlade på mikromönster galler (figur 5A,B). Många av RSV strukturella proteiner kan identifieras inom tomogrammen inklusive nukleokapslar (N) och viral fusion protein (F) (figur 5C, blå och röda pilar).

För primära Drosophila neuron studier, det konstaterades att det smala mönstret, nära upplösningsgränsen som erbjuds av programvaran (där tjockleken på mönstret var 2 μm), tillåtet från en till några celler att isoleras inom en rutnät kvadrat (figur 6). Neuronal soma kunde förlänga sina neuriter under en period av flera dagar inom mönstret. Detta möjliggjorde enkel identifiering och tiltserieförvärv av neuriterna jämfört med nervceller odlade på icke-sända rutnät (figur 7). Det konstaterades också att fluorescerande märkta concanavalin A, ett lektin som har använts som ecm för in vitro Drosophila neuronal kulturer20,21, är mottaglig för mönstraring.

Drosophila nervceller från tredje instar larver isolerades enligt tidigare publicerade protokoll20,21,31. Neuronal preparat tillämpades på micropatterned cryo-EM galler där concanavalin A deponerades på mönstret för att reglera cell placering, spridning och organisation. Nervcellerna på mönstrade eller unpatterned galler tilläts inkubera i minst 48-72 timmar, och gallren var sedan dopp frusna. En representativ bild av ett mikropatterned EM-rutnät med flera Drosophila nervceller distribueras över de mönstrade regionerna visas i figur 6A. Dessa nervceller, härledda från en transgen flugstam som har pan-neuronal GFP uttryck i membranet, kan lätt spåras av ljusmikroskopi inte bara på grund av dess fluorescerande märkning, men också på grund av dess placering inom mikromönster. Medan nervceller odlade på icke-sända galler också kan spåras genom sin GFP-signalering genom ljusmikroskopi (figur 7A, gul cirkel), blev det betydligt svårare att hitta dem i kryo-EM på grund av närvaron av cellulärt skräp och förorening från media (figur 7B, gul cirkel). Sådan närvaro minskades för nervceller på mönstrade galler, sannolikt på grund av PEG i anti-fouling skiktet i de icke-mönstrade regionerna avvisa cellen skräp från att följa. På grund av dimensionerna på neuroncellkroppen och de förlängda neuriterna (figur 6A, B, gul cirkel) samlades kryo-ET tilt-serien längs tunnare regioner i cellerna (figur 6C, D, röd cirkel). Neuronal cellmembranet, en mitokondrion (cyan), mikrotubuler (lila), aktinfilament (blå), vesikulära strukturer (orange och grön) och makromolekyler som ribosomer (röd) löstes väl i bildmontage med högre förstoring och skivor genom 3D-tomogrammet (figur 6E). Medan liknande subcellulära funktioner kan ses från 3D-tomogram av icke-sända nervceller (figur 7E), minskade svårigheten att hitta livskraftiga cellulära mål för datainsamling avsevärt.

I figur 8 har representativa bilder från rutnät med några av dessa problem sammanställts för att hjälpa till med identifiering och felsökning. När optimala förhållanden har fastställts är mikropapper en pålitlig och reproducerbar metod för placering av celler på galler för cryo-TEM.

Figure 1
Bild 1: Allmänt arbetsflöde för mikropapper för cryo-EM. Arbetsflödet kan grovt delas upp fyra delar: gridpreparation, mikropapperning, ECM och cellsådd samt kryoberedning och datainsamling. Viktiga steg i varje avsnitt listas under rubrikerna och den ungefärliga tiden för att slutföra varje avsnitt visas till vänster. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Bild 2: Skärmbild av programvaran med mönster placerat på rutnätet. Område 1 innehåller förhållandet μm/pix för mönsterdesign. Område 2 är linjalen för mätning av ett rutnät. Område 3 är var man ska lägga till eller ändra mönster och ROM. Område 4 innehåller all information för mönsterpositionering och dos. Område 5 innehåller alternativ för mönster, inklusive att växla överlägg, kopiera eller ta bort mönster och välja mönster för mikropapper. Område 6 är där mallar kan sparas och laddas. Större vyer över områdena 4 och 5 visas nedan för tydlighetens skull. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: RSV-infekterade BEAS-2B celler på det mönstrade cryo-TEM rutnätet. (A) Fluorescerande bild av det mönstrade rutnätet efter tillsats av fluorescerande märkt ECM. Indatamönstret visas i det nedre vänstra hörnet. B) Brightfield-bild av BEAS-2B-celler som odlas på rutnätet i A. C) Sammanfoga bilden i A (cyan) och B (grå) med fluorescerande bild av RSV-infekterade celler (röda) omedelbart före doppfrysning. infekterade celler uttrycker mKate-2. Skalstänger är 500 μm. (D) Cryo-TEM-karta med låg förstoring av rutnätet i B efter doppfrysning. Fluorescerande bilder är pseudofärgade. Skalstänger är 500 μm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Levande/död färgning av mönstrade och icke-sända celler. (A) Fluorescerande bild av HeLa-celler som odlas på ett mönstrat galler och färgas med kalcein-AM (levande cellfläck, grön) och etidium homodimer-1 (död cellfläck, röd). B) HeLa-celler som odlas på ett icke patenterat galler och färgas som i A. C) Projektion av konfokala z-staplar av en HeLa-cell på ett mönstrat Quantifoil R2/2-rutnät med 0,01 mg/ml kollagen och fibrinogen 647 ECM (röd). Cellen var färgade med calcein-AM (grön) och Hoechst-33342 (blå). D) HeLa-celler på ouppternerat galler inkuberas med 0,01 mg/ml kollagen och fibrinogen 647 ECM, inkuberade och färgade med kalcein-AM och Hoecsht-33342. De fluorescerande bilderna slogs samman med överfört ljus (gråskala). (E) X,Z-projektionen av C. (F) X,Z-projektion av D. Bilder är pseudocolored. Skalstänger i A och B är 500 μm; skalstänger i (C) - (F) är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5: Cryo-ET av RSV-infekterade BEAS-2B cell på det mönstrade cryo-TEM rutnätet. (A) Cryo-EM rutnät kvadratisk karta över RSV infekterade BEAS-2B cell. Ungefärlig cellgräns indikeras av den streckade gröna linjen. (B) Bild med högre upplösning av området i rött i (A). Ungefärlig cellgräns indikeras med streckad grön linje. RSV-virions kan ses nära cellens periferi (vit pil och gul låda). C) En z-skiva från tomogram som samlats in i den gula rutan i B. Röda pilar pekar på RSV F fusion protein, blå pilar pekar på ribonucleoprotein (RNP) komplexet. Skalningsstaplarna i (A)-(C) är inbäddade i bilden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Primära nervceller som härrör från hjärnan hos 3: e instar Drosophila melanogaster larver på det mönstrade cryo-TEM rutnätet. (A) Överlagrat live-cell fluorescensmikroskopi rutnät montage av Drosophila nervceller uttrycker membran-riktade GFP på mönstrade rutnät rutor med 0,5 mg/mL fluorescerande konanavalin A. Grön: Drosophila nervceller. Blå: Fotopattern. (B) Cryo-EM bildmontage av rutnätet i (A) efter kryobevarande. Gul cirkel noterar samma rutnätsruta som i (A). C) Cryo-EM bildmontage av torget markerat av den gula cirkeln i (A) och (B). D) Högre förstoringsbild av det område som avgränsas av den röda cirkeln i C, där en lutningsserie samlades in på cellens neuriter. E. 25 nm tjock skiva av ett tomogram rekonstruerat från tilt-serien som förvärvades från den röda cirkeln i (C). Olika organeller kan ses i detta tomogram, såsom mitokondrierna (cyan), mikrotubuler (lila), täta kärnblåsor (orange), ljusblåsor (gröna), endoplasmiskt retikulum (gult) och aktin (blå). Makromolekyler, såsom ribosomer (röda), kan också ses i det övre högra hörnet. Fluorescerande bilder är pseudofärgade. Skalningsstaplarna i (A)-(E) är inbäddade i bilden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Primära nervceller som härrör från hjärnan hos 3: e instar Drosophila melanogaster larver på unpatterned galler. (A) Live-cell fluorescensmikroskopi rutnät montage av Drosophila nervceller uttrycker membran-riktade GFP på rutnät rutor med 0,5 mg/mL concanavalin A. Grön: Drosophila nervceller. B) Kryo-EM-rutnätsmontage av samma rutnät i (A) efter doppfrysning. Gul cirkel visar samma rutnätsruta som i (A). Observera förekomsten av cellulärt skräp och medieförorening, vilket gjorde målidentifiering svårt jämfört med mönstrade galler. C) Cryo-EM bildmontage av torget markerat av de gula cirklarna i (A) och B) kartorna. D) Högre förstoringsbild av det område som avgränsas av den röda cirkeln i C, där en lutningsserie samlades in på cellens neuriter. (E) 25 nm tjock del av det rekonstruerade tomogrammet från tiltserien från (C) och (D). Ett antal organeller är synliga i detta tomogram, såsom mikrotubuli (lila), aktin (blå), endoplasmiskt retikulum (gult) och täta kärnblåsor (orange). Makromolekyler, såsom ribosomer (röda), kan också ses. Fluorescerande bilder är pseudofärgade. Skalningsstaplarna i (A)-(E) är inbäddade i bilden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 8
Figur 8: Exempel på möjliga problem med mönstra. Fluorescerande bilder av märkta ECM deponeras på mikropatternerade galler. (A) Ojämn mönstra över gallret på grund av ojämn fördelning av PLPP-gel. B) ECM kan inte följa områden som omfattas av PDMS-stencilen under mönstraring. (C) Mättat gradientmönster (höger sida) eller inverterat mönster (vänster) på ett rutnät mönstrat med för hög total dos. D) ECM håller sig till områden på gallerstängerna samt mönstrade områden på grund av reflektioner av UV-lasern under mönstra. Bilderna är pseudofärgade. inmatningsmönstret visas längst ned till vänster. skalstänger är 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Utfärda Potentiella orsaker Felsökning
Mikropapper
Kan inte se belysning från PRIMO-laser • Ljusbanan är inte korrekt konfigurerad • Kontrollera att mikroskopets ljusväg är korrekt inställd
• PRIMO-lasern är inte på eller lasern är förreglad
Många trasiga rutnätsrutor • Vidrör gallerfolie med pincett eller pipa under hantering • Hantera galler med omsorg
• Gallret torkas ut under inkubationer eller tvätt • Låt inte gallret torka under tvättar och inkubationer
Stora icke-patenterade områden • Otillräcklig geltäckning • Se till att gelen sprids jämnt över gallret samtidigt som du lägger till
• Gallerfolie ur fokus under mönstra • Tillsätt ytterligare en mikroliter gel
•Yta täckt av stencil • Kontrollera fokus innan du mönstrar varje region
• Centrera försiktigt gallret i stencilen
Mättat eller inverterat mönster • Felaktig dos • Prova en rad totala doser för mönster
• Otillräcklig geltäckning • Se till att gallret är jämnt täckt med gel
• Prova olika värden för gråskalemönster
Suddigt mönster • Dåligt fokus under mönstra • Upprepa PRIMO-kalibrering i samma höjd som provet
• Felaktig kalibrering • Fokusera på gallerfolie före mönstra
• Dela upp mönstret i ytterligare regioner för mönstraring
ECM som klibbar utanför mönstret • Reflektioner från gel eller damm • Se till att gelén är torr före mönstra
• Se till att täcket och objektivet är rena
ECM inte synlig efter mönstra • Fotoblekning • Minimera ljusexponeringen för ECM före avbildning
• Felaktig dos under mönstra • Prova en rad totala dosvärden för mönster
• Otillräcklig ECM-inkubationstid • Öka inkubationstiden för ECM
Cellutsäde
Celler som klumpar ihop sig • Över matsmältningen • Använd lägre andel trypsin eller tid för frisättning av vidhäftande celler
• Hög celltäthet • Passage- och/eller smältceller vid lägre sammanflöde
• Omrör inte celler under frisättningen
• Rörcellslösning försiktigt eller använd cellsiler
Celler som inte följer mönstrade områden • ECM är inte lämplig för celltyp • Prova olika ECM-koncentrationer och sammansättning
• Cellernas livskraft minskar före sådd • Se till att cellodlings- och cellfrisättningsförhållandena inte skadar celler
Celler expanderar inte efter vidhäftning • ECM eller mönster som inte är lämpligt för celltyp • Prova olika mönster och ECM
• I vissa fall kan en mer kontinuerlig folie (R1.2/20 vs R2/1) främja cellexpansion

Tabell 1: Potentiella problem vid mikropatterning. I den här tabellen beskrivs vissa problem som en användare kan uppleva under mikropapper eller cellutsöndning. Potentiella orsaker och felsökning tillhandahålls för varje problem. Representativa bilder av vissa problem kan ses i figur 8.

Discussion

Moderna, avancerade elektronmikroskop och programvarupaket stöder nu strömlinjeformad automatiserad kryo-EM och kryo-ET datainsamling där hundratals till tusentals positioner kan riktas och avbildas inom några dagar32,33,34,35. En viktig begränsande faktor för helcelliga kryo-ET-arbetsflöden har varit att få tillräckligt många insamlingsbara mål per rutnät. Nyligen har ett antal grupper utvecklat protokoll för mikropappersnät för cryo-EM, med en fördel som förbättrad datainsamlingseffektivitet16,17,18. Här presenteras ett protokoll för att använda ett kommersiellt tillgängligt mikropapperssystem till mikromönster TEM-rutnät för cryo-ET-studier av primära Drosophila-nervceller och odlade mänskliga cellinjer (oinfekterade eller RSV-infekterade). Detta mikropapperssystem är mångsidigt och många steg kan optimeras och skräddarsys för att passa specifika experimentella mål. En användare med TEM- och fluorescensmikroskopi erfarenhet kan snabbt bli skicklig på nätberedning och mikropatterning. Med noggrann praxis bör goda resultat uppnås efter några iterationer. Nedan diskuteras några av de tillgängliga alternativen, användaröverväganden, potentiella fördelar och framtida tillämpningar av mikropatterning för cryo-EM.

En av de viktiga övervägandena för hela cell cryo-ET är EM-rutnätsval. EM-galler består av två delar: en maskram (eller strukturellt stöd) och folien (eller filmen), som är den kontinuerliga eller håliga filmytan på vilken cellerna kommer att växa. Kopparnätnät används ofta för kryo-EM av proteiner och isolerade komplex. De är dock olämpliga för helcells cryo-ET på grund av kopparns cytotoxicitet. Istället används ett guldnät ofta för cellulär tomografi. Andra alternativ inkluderar nickel eller titan, vilket kan ge fördelar jämfört med guld som ökad styvhet16. EM-nät finns med olika nätdimensioner för att stödja en rad olika applikationer. Större maskstorlekar ger mer utrymme för celler att växa mellan gallerstänger och fler områden som är mottagliga för insamling av tiltserier, men på bekostnad av ökad övergripande provskörhet. Den vanligaste folien är perforerat eller håligt amorft kol, såsom Quantifoils eller C-platta galler. Biologiska mål kan avbildas antingen genom hålen i kolet eller genom det elektrontranslucenta kolet. Galler som R 2/1 eller R 2/2, där hålen är 2 μm breda och som är åtskilda 1 respektive 2 μm, ger ett stort antal hål och därmed ett stort antal potentiella områden för datainsamling. Vissa celler kan dock växa och expandera bättre på mer enhetliga ytor som R 1.2/20-nät eller kontinuerligt kol. För nedströms provbearbetning genom fräsning av fokuserad jonstråle (cryo-FIB) avlägsnas folien genom fräsning, vilket minskar oron för den underliggande filmens fortsatta förekomst. Precis som med nätet finns även folier från andra material, där mönseringsprotokollet som presenteras här är lika lämpligt för SiO2-galler . Vanliga rutnät inkluderar guld Quantifoil, kontinuerligt kol eller SiO2 film 200-mesh rutnät (~ 90 μm avstånd mellan galler barer) för helcell cryo-ET.

Det finns ett antal överväganden när du utformar ett mönster. En majoritet av dessa beslut styrs av experimentets celltyp och syfte. En bra utgångspunkt är att välja ett mönster som approximerar cellernas form och dimensioner i kulturen. Många studier har visat betydande effekter av mönsterform på celltillväxt och cytoskeletal arrangemang13,36,37. Särskild försiktighet bör iakttas under mönsterdesignen om detta kan ändra målet av intresse. Flera mönster för varje celltyp testades för att avgöra vilka mönster främjas cellulär vidhäftning och tillväxt. Flexibiliteten i mikropapperssystemet gör det möjligt att testa flera mönster i ett enda rutnät och ändra mönster för olika rutnät inom ett enda experiment. Större mönster (~ 50-90 μm), såsom de som används här, ökar sannolikheten för att flera celler håller sig till en enda region i mönstret och tillåter celler att expandera och förlänga efter vidhäftning. Mer begränsade mönster (20-30 μm) kan vara lämpliga i experiment där cellisolering är mer kritisk än cellexpansion, t.ex. för experiment med kryo-FIB(focused-jon beam milling). För tomografitillämpningar kan man behöva överväga lutningsaxelns inverkan. Om ett mönster är placerat så att alla celler växer parallellt med varandra i en enda riktning, är det möjligt att alla celler kommer att vara vinkelräta mot lutningsaxeln när de laddas på mikroskopstadiet, vilket resulterar i en lägre datakvalitet.

På icke-upprutade rutnät håller cellerna ofta företrädesvis vid rutnätsstaplarna, där de inte kan avbildas av TEM. Även på mönstrade galler observeras celler ofta placeras i hörnen av rutnätsrutor delvis på både den mönstrade kolfolien och gallerstången. Nyligen användes micropatterning för att avsiktligt placera en del av cellen över rutnätsfältet18. Detta kan övervägas för experiment där det inte är viktigt att ha hela cellens periferi på folien. Detta kan vara särskilt viktigt för celler som kan växa större än en enda rutnät kvadrat, såsom primära nervceller växer under flera dagar.

Det finns många verktyg som kan användas för att utforma ett mönster. Här var mönstret begränsat till mindre än 800 pixlar i en dimension så att mönstret kan roteras till vilken vinkel som helst och fortfarande passa inom det maximala området som kan mönstras i en enda projektion av detta mikropatterningssystem. Detta gör det möjligt för användaren att rotera mönstret för att vara korrekt orienterad med rutnätet oavsett orienteringen av rutnätet på mikroskopet. Här delades rutnätet in i sex mönstrar. I första hand möjliggör detta fokusjustering mellan olika regioner i rutnätet. Särskilt guldgaller är mycket formbara och får inte lägga sig helt platt på glaset. Rätt fokus är viktigt för rena, raffinerade mönstrar. Genom att använda segmenterade mönster behöver endast mindre justeringar av mönsterpositionen göras om rutnätet skiftar något under mönstningsprocessen, även om detta vanligtvis inte är ett problem när du använder PLPP-gelén med PDMS-stencilerna. Slutligen förblev de centrala fyra rutnätsrutorna i rutnätet oförändrade. Detta stöder en användare som tydligt kan identifiera mitten av rutnätet, vilket är mycket användbart för korrelativa avbildningsexperiment.

Mönskningsprogramvaran för detta mikropapperssystem, Leonardo, har också mer avancerade funktioner som sömnad och möjligheten att importera mönster som PDF-filer, som ligger utanför detta protokoll. Denna programvara innehåller också mikrostrukturdetektering och automatiserad mönsterpositionering som kan användas på TEM-nät. Den här funktionen är mest användbar när rutnätet är mycket platt och kan mönstras utan att behöva justera fokus mellan olika områden.

Val av ett ECM-protein kan ha en betydande inverkan på cell vidhäftning och expansion. Vissa celler är kända för att genomgå fysiologiska förändringar när de odlas på specifika substrat38. Flera ECM-proteiner och koncentrationer testades för någon ny celltyp baserat på tidigare arbete som rapporterats i litteraturen. Laminin, fibrinogen, fibronectin och kollagen används ofta för odlade celler och kan användas som utgångspunkt om andra data inte är tillgängliga. Andra ECM-proteiner måste dock också övervägas om de vanliga ECM-proteinerna inte ger cellerna korrekta vidhäftande egenskaper. Detta var särskilt sant för primära Drosophila nervceller, som en hög koncentration av växten lectin concanavalin A var nödvändigt för korrekt cellulära adherence. Kompatibiliteten hos cellulär vidhäftning och tillväxt med ECM kan testas genom mönstra på glasfat eller diabilder innan de övergår till TEM-galler. Denna förundersökningsmetod är tids- och kostnadseffektiv om ett stort antal kombinationer behöver undersökas. Införandet av ett fluorescerande konjugerat ECM-protein är värdefullt för att bedöma framgången och kvaliteten på mönstrar.

Cellsådd är ett av de viktigaste stegen för hela cell cryo-ET, antingen med eller utan mikropapper6,16,39. För primära Drosophila eller andra nervceller, som är bräckliga, instabila i suspension och kan begränsas i kvantitet, föredras enstaka såddmetoder framför övervakad, sekventiell cellsådd. Ett enda såddsteg vid en optimerad celldensitet, som beskrivs i protokollet för Drosophila-nervceller, är ett genomförbart alternativ för de flesta celltyper. Det är dock också möjligt att så celler på substratet vid en lägre initial koncentration och lägga till fler celler på ett övervakat sätt som beskrivs här och i annan litteratur18. Denna sekventiella sådd kan ge mer konsekventa resultat i vissa fall. I likhet med standardcellskultur bör man alltid vara noga med att upprätthålla cellens livskraft och minimera cellklumpning under isolering.

När du först börjar med mikropapperning finns det några potentiella fallgropar som är skadliga för slutresultatet. Noggrann näthantering och steril teknik, en enhetlig fördelning av PLPP-gelen, korrekt dos och fokus under mönstraring och underhåll av cellens livskraft före sådd är bland de viktigaste övervägandena för framgång. En förteckning över några av de potentiella problemen och lösningarna sammanställdes i tabell 1.

Mikromönster kan användas för att positionera celler för att upprätta en konsekvent celltäthet över rutnätet och för att placera områden av intresse i områden som är lämpliga för insamling av tiltserier16,18. Placering och placering av celler kan användas som fiducial markörer för korrelation i cryo-CLEM experiment, vilket minskar behovet av bräckliga finder-grids och fluorescerande fiducial markörer. Det bör dock noteras att sådana fiducial markörer fortfarande kan vara användbara för korrelationen med submikrometernoggrannhet29,40. Dessutom är en jämn fördelning av isolerade celler också mycket fördelaktig för experiment-jonstrålefräsning (cryo-FIB) experiment för att maximera antalet celler från vilka lameller kan skäras16.

Tillägget av mikropapper till kryo-EM-arbetsflöden kommer att resultera i mätbara förbättringar av datagenomströmningen och potentiellt möjliggöra nya experiment. När tekniken antas och utvecklas ytterligare kommer mer avancerade tillämpningar av mikropapper, inklusive ECM-gradienter, flera ECM-deponering och mikrostrukturmontering, att ytterligare utöka kryo-ET: s kapacitet att studera biologiska mål och processer i fullständigt cellulärt sammanhang.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Jill Wildonger, Dr. Sihui Z. Yang och Mrs. Josephine W. Mitchell vid institutionen för biokemi, University of Wisconsin, Madison för att generöst dela elav-Gal4, UAS-CD8::GFP flugstam (Bloomington stock center, #5146). Vi vill också tacka Dr. Aurélien Duboin, Laurent Siquier och Marie-Charlotte Manus från Alvéole och Serge Kaddoura från Nanoscale Labs för deras generösa stöd under detta projekt. Detta arbete stöddes delvis av University of Wisconsin, Madison, Institutionen för biokemi vid University of Wisconsin, Madison och folkhälsobidrag R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 och U24 GM139168 till E.R.W. och R01 AI150475 till P.W.S. En del av denna forskning stöddes av NIH-anslag U24 GM129547 och utfördes vid PNCC vid OHSU och nås via EMSL (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsrad av Office of Biological and Environmental Research. Vi är också tacksamma för användningen av faciliteter och instrumentering vid Cryo-EM Research Center vid institutionen för biokemi vid University of Wisconsin, Madison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% (w/v) Poly-L-Lysine Sigma P8920-100ML
0.22 µm syringe filters PVDF membrane Genesee 25-240
22x60-1 Glass cover slip Fisher 12545F
5/15 Tweezers EMS (Dumont) 0203-5/15-PO
Antibiotic-Antimycotic (100X) ThermoFisher (Gibco) 15240096
BEAS-2B cells ATCC CRL-9609
Collagen I, bovine ThermoFisher (Gibco) A1064401
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate ThermoFisher (Invitrogen) C11254
DMEM Fisher (Lonza) BW12-604F
EtOH Fisher (Decon Labs) 22-032-600
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate ThermoFisher (Invitrogen) F35200
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher (Gibco) 33010018
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-20-C
Glucose VWR 0643-1KG
Grid prep holder EMS 71175-01
HeLa cells ATCC CCL-2
Hemacytometer Fisher (SKC, Inc.) 22600100
HEPES Fisher (ACROS Organics) AC172572500
Hoechst 33342 ThermoFisher (Invitrogen) H3570
Insulin Fisher (Sigma Aldrich) NC0520015
KCl MP Bio 194844
KH2PO4 Fisher (ACROS Organics) AC212595000
Leica-DMi8 Leica Microsystems Can be customized with camera, stage, and objective attachments
Leonardo Alvéole https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/
Liberase Research Grade Fisher (Supply Solutions) 50-100-3280
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit ThermoFisher (Invitrogen) L3224
Microscope camera Hammamatsu C13440-20CU
Motorized stage Märzhäuser Wetzlar 00-24-599-0000
NaCl Fisher (Fisher BioReagents) BP358-1
NaH2PO4 Fisher (ACROS Organics) AC207802500
NaOH Fisher (Alfa Aesar) AAA1603736
PBS Corning 21-040-CV
PDMS stencils nanoscaleLABS PDMS_STENCILS_EM https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/
PEG-SVA nanoscaleLABS PEG-SVA-1GR mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000
Penicillin Fisher (Research Products International Corp) 50-213-641
pH strips Fisher (Millipore Sigma) M1095350001 pH probe can also be used
PLPP gel nanoscaleLABS PLPP-GEL-300UL https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/
PRIMO Alvéole https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/
pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA ) BEI Resources NR-36460 https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx
Quantifoil grids EMS (Quantifoil) Q2100AR1 2 µm holes spaced 1 µm apart, other dimensions are available
RPMI Fisher (Lonza) BW12-702F
RSV A2-mK+ see entry for pSynkRSV-19F - Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F
Schneider's Media ThermoFisher (Gibco) 21720-024
SerialEM SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ ) https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Straight tweezers EMS (Dumont) 72812-D
Streptomycin Fisher (Fisher BioReagents) BP910-50
Sucrose Avantor 4097-04
Tetracycline Sigma T8032-10MG
Titan Krios electron microscope ThermoFisher 300kV, with direct electron detector camera and energy filter
Trypsin ThermoFisher (Gibco) 15090046
Tube Revolver/Rotator Fisher (Thermo Scientific) 11676341
UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain Bloomington Drosophila Stock Center 5146 http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
  2. Martynowycz, M. W., Gonen, T. From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).
  3. Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  4. Wan, W., Briggs, J. A. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).
  5. Bäuerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing. bioRxiv. , 437159 (2021).
  6. Hampton, C. M., et al. Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells. Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).
  7. Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections. Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).
  8. Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues. Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).
  9. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  10. Gorelick, S., et al. PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy. Elife. 8, 45919 (2019).
  11. Wu, G. H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).
  12. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  13. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
  14. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  15. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).
  16. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  17. Engel, L., et al. Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).
  18. Engel, L., et al. Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts. bioRxiv. , 272237 (2021).
  19. Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids. bioRxiv. , 447251 (2021).
  20. Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
  21. Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).
  22. Ke, Z., et al. The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography. Viruses. 10 (8), (2018).
  23. Stobart, C. C., et al. A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation. Nature Communications. 7, 13916 (2016).
  24. Hotard, A. L., et al. A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis. Virology. 434 (1), 129-136 (2012).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  29. Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. , 107709 (2021).
  30. Ke, Z., et al. Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein. Nature Communications. 9 (1), 1736 (2018).
  31. Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. A new in situ neuronal model for cryo-ET. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).
  32. Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (2021).
  33. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  34. Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visual Experiments. (169), e62383 (2021).
  35. Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition. Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716 (2021).
  36. Anderson, D. E., Hinds, M. T. Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications. Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).
  37. McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
  38. Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. Use of extracellular matrix components for cell culture. Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).
  39. Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. 3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633 (2020).
  40. Schellenberger, P., et al. High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers. Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).

Tags

Biokemi nummer 175 cellkultur masklös fotopapper mikropatterning kryoelektronmikroskopi cryo-EM kryoelektrontomografi kryo-ET korrelativt ljus och elektronmikroskopi CLEM fluorescensljusmikroskopi fLM
Mikropapper transmission elektronmikroskopinät till direkt cellpositionering inom arbetsflöden för hela cell cryo-elektrontomografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J.… More

Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows. J. Vis. Exp. (175), e62992, doi:10.3791/62992 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter