Methodenartikel

Bestimmung der Gesamtprotein- und bioaktiven Proteinkonzentrationen in Rinderkolostrum

DOI:

10.3791/63001

⸱

10. Dezember 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, Reno, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, Lincoln, 5Evolve BioSystems Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Rinderkolostrum ist sowohl eine primäre Nährstoffquelle als auch eine immunologische Unterstützung für das neugeborene Kalb. Das Verständnis des Gehalts an therapeutischen Proteinen (Lactoferrin und IgG) ist wichtig für die Dosierung und Standardisierung des Rinderkolostrums für den menschlichen Verzehr.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolostrum ist eine komplexe biologische Flüssigkeit, die von Säugetieren unmittelbar nach der Geburt produziert wird. Es erfüllt alle Ernährungsbedürfnisse von Neugeborenen als gute Quelle für Makro- und Mikronährstoffe, bioaktive Peptide und Wachstumsfaktoren. Rinderkolostrum ist aufgrund seines hohen Proteingehalts, zu dem Immunglobulin G (IgG) und Lactoferrin gehören, auch eine potenzielle Nahrungsquelle und bioaktiv. Der Lactoferrin- und IgG-Spiegel im Rinderkolostrum ändert sich jedoch während der Laktationszeit deutlich. Daher ist die Überwachung der Konzentration von IgG und Lactoferrin für die Verwendung von Rinderkolostrum als Proteinquelle eine wichtige Frage, die untersucht werden muss. Die Methoden in diesem Artikel beschreiben, wie der Proteingehalt sowie die spezifischen Konzentrationen von Lactoferrin und IgG bestimmt werden. Diese Methoden umfassen die folgenden Schritte: Isolierung von bovinen Kolostrumproteinen, Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Bicinchoninsäure-Assay (BCA), Visualisierung von Proteinen mittels SDS-PAGE, Bestimmung der Lactoferrin- und IgG-Konzentration mit einem ELISA-Assay.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolostrum ist die anfängliche Sekretion der Brustdrüse, die von Säugetieren kurz nach der Geburt produziert wird. Kolostrum ist reich an Makro- und Mikronährstoffen, antimikrobiellen Peptiden und Wachstumsfaktoren 1,2,3,4. Die Zusammensetzung variiert allmählich im Laufe der Zeit durch den Übergang zur reifen Milch 5,6,7, am deutlichsten jedoch innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt8. Die Zusammensetzung des Kolostrums wird auch von mütterlichen Faktoren beeinflusst, einschließlich Alter, Parität, Rasse, Gesundheit und Ernährungszustand, sowie von extrinsischen Faktoren, einschließlich Jahreszeit, vorzeitige Geburt, vorzeitige Laktation, kolostrale Handhabungsfaktoren (Pooling des Kolostrums und Lagertemperatur) und Geburtsinduktion 9,10,11. Im Vergleich zu reifer Milch enthält Kolostrum weniger Laktose und mehr Fett, Proteine, Peptide, Nicht-Protein-Stickstoff, Asche, Hormone, Wachstumsfaktoren, Zytokine, Nukleotide, Vitamine und Mineralien12. Rinderkolostrum enthält eine breite Palette von Proteinen, darunter Immunglobuline, Lactoferrin, α-Lactalbumin (α-LA), β-Lactoglobulin (β-Lg), Lactoperoxidase und mehrere Wachstumsfaktoren13. Die Gesamtproteinkonzentration von Rinderkolostrum liegt zwischen 11,26 mg/ml und 169,55 mg/ml14. Der Proteingehalt setzt sich aus Molke und Kasein in einer durchschnittlichen Konzentration von 124,00 mg/ml bzw. 26,00 mg/mlzusammen 15. Der Molkeanteil enthält drei Haupttypen von Immunglobulinen (Igs) als IgG (85 %-90 %), IgM (7 %) und IgA (5 %)16. Das wichtigste Ig im bovinen Kolostrum ist IgG, das für passive Immunität sorgt und das adaptive und angeborene Immunsystem im Kalb moduliert17. Die anfängliche Ig-Konzentration des ersten melkenden Rinderkolostrums kann zwischen 20 und 200 mg/ml liegen und auf etwa 0,4-1,0 mg/ml sinken18. Die mittlere IgG-Konzentration liegt bei etwa 60 mg/ml und sinkt während des Übergangs zu reifer Milch stetig auf unter 1 mg/ml19.

Ein weiteres wichtiges bioaktives Protein im Kolostrum ist Lactoferrin, ein eisenbindendes Glykoprotein mit einer Konzentration von 1,5-5 mg/ml. Zu den Eigenschaften von Lactoferrin gehören die Verbesserung der Eisenabsorption sowie die antimikrobielle Aktivität20,21, die Bindung von Lipopolysacchariden, die Immunmodulation und die Stimulierung des Wachstums von Darmepithelzellen und Fibroblasten22. Rinderkolostrum enthält auch α-Lactalbumin und β-Lactoglobulin. Diese Proteine sind Quellen für essentielle Aminosäuren und haben auch bakterizide Wirkung 23,24,25. Die mittleren α-LA- und β-Lg-Konzentrationen im Kolostrum betragen durchschnittlich 2,77 mg/ml2 bzw. 11,5 mg/ml26. Danach sinken diese Konzentrationen auf 1-1,5 mg/ml27 und 4,8 mg/ml26 in reifer Milch. Colostrum enthält auch eine signifikante Menge an Lactoperoxidase (durchschnittlich 22,8 μg/ml) und Lysozym (durchschnittlich 0,40 μg/ml)26. Lactoperoxidase ist ein Glykoprotein, das eine antimikrobielle Aktivität gegen grampositive und negative Bakterienbesitzt 28, indem es reaktive Sauerstoffspezies produziert. Lysozym wirkt als antimikrobielles Mittel, indem es die Peptidoglykankomponente der bakteriellen Zellwände spaltet, was zum Zelltod führt29,30.

Aufgrund ihrer Eigenschaften werden IgG und Lactoferrin zu verschiedenen Lebensmitteln verarbeitet, um Säuglingsanfangsnahrung, Nahrungsergänzungsmittel, proteinreiche Präparate für Rekonvaleszenten und Sportler sowie in der Pharmakologie und Kosmetik anzureichern 31,32,33. Rinderkolostrum stellt eine wichtige Quelle für IgG und Lactoferrin dar. Die Zusammensetzung dieser bioaktiven Proteine im bovinen Kolostrum ändert sich jedoch während der Laktationsperiode deutlich. Daher ist die Überwachung von Änderungen der Konzentration dieser bioaktiven Proteine in Kolostrumproben, die für die Forschung und Lebensmittelverarbeitung verwendet werden, von entscheidender Bedeutung. Ziel dieser Studie ist es, die Methoden zur Überwachung der Konzentration und Zusammensetzung des Gesamtproteins, des Lactoferrins und des IgG im Rinderkolostrum während der 6 Tage nach der Kalbung zu beschreiben.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Im Zeitraum Juli-August wurden 6 Tage nach dem Kalben mittags Kolostrumproben von 28 Holstein-Milchkühen der Uluova Milk Trading Company in Çanakkale, Türkei, entnommen und tiefgefroren. Die Proben, die am selben Tag entnommen wurden, wurden entsprechend dem Tag jeder Probe gepoolt und auf ihre Gesamtprotein-, Lactoferrin- und IgG-Konzentrationen analysiert. Alle Proben wurden in doppelter Ausfertigung untersucht.

1. Vorbereitung der Probe

  1. 200 μl Rinderkolostrum werden mit 400 μl dH2O gemischt, um eine verdünnte Probe für die Analyse zu erhalten. Verdünnen Sie alle Proben entsprechend.
  2. Zentrifugieren Sie verdünnte und unverdünnte Proben bei 4 °C, 1000 x g für 30 min.
  3. Trennen Sie die mittlere Phase von einem entsprechend beschrifteten neuen Röhrchen. Wiederholen Sie Schritt 1.2. um eine klare Mittelphase zu erhalten. Die gesamte Mittelphase und die verdünnten Proben bei -20 °C lagern, wenn sie nicht sofort verwendet werden.
  4. Verwenden Sie die mittlere Phase, die aus verdünnten Proben gewonnen wurde, für BCA-, SDS-PAGE- und Lactoferrin-Assays. Entnehmen Sie die mittlere Phase aus unverdünnten Proben für den IgG-Assay.
  5. Bereiten Sie Probenverdünnungen für jede Probe vor, um sicherzustellen, dass die Messwerte innerhalb des Standardkurvenbereichs liegen. Verdünnen Sie jede mittlere Phase, die aus den verdünnten Proben gewonnen wird, auf 1:300 für den BCA-Assay und 1:30.000 für den Lactoferrin-Assay und verdünnen Sie jede mittlere Phase, die aus unverdünnten Proben gewonnen wird, auf 1:400.000 für den IgG-Assay.
    HINWEIS: Die Verdünnungsfaktoren werden auf der Grundlage des Absorptionswerts und der Standardkurve bestimmt.

2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Protein-Assay-Kit

  1. Erstellung von Standards und Reagenzien
    1. Verwenden Sie die Reagenzien, die im kommerziell erhältlichen Kit (siehe Materialtabelle) für den Assay verwendet werden sollen: BCA-Reagenz A, das Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Bicinchoninsäure und Natriumtartrat in 0,1 M Natriumhydroxid enthält. BCA-Reagenz B enthält 4% Kupfersulfat. Albumin (BSA)-Standards, enthält Rinderserumalbumin in einer Menge von 2,0 mg/ml in 0,9 % Kochsalzlösung und 0,05 % Natriumazid.
    2. Alle Proben und Proteinstandards werden auf Raumtemperatur (RT) äquilibriert.
    3. Bereiten Sie ausreichende Volumina des Arbeitsreagenzes (WR) vor, indem Sie das Reagenz A:B im Verhältnis 50:1 mischen. Für jede Probe und jeden Standard sind 200 μl WR erforderlich.
    4. Bereiten Sie verdünnte Albuminstandards (BSA) gemäß dem folgenden Verdünnungsschema (Tabelle 1) vor, das einen Arbeitsbereich zwischen 20 und 2.000 μg/ml BSA-Endkonzentration aufweist. Verwenden Sie dH2O als Verdünnungsmittel.

Tabelle 1: Verdünnungsschema der BSA-Normen.

PhioleVolumen des Verdünnungsmittels (μL)Volumen und Quelle von BSA (μL)Endgültige BSA-Konzentration (μg/ml)
Ein0300 μl Vorrat2000
B125375 μL Vorrat1500
C325325 μl Vorratsmaterial1000
D175175 der Durchstechflasche B verdünnt750
E325325 der C-Verdünnung der Durchstechflasche500
F325325 der Fläschchen E Verdünnung250
G325325 der F-Verdünnung des Fläschchens125
H400100 der Durchstechflasche G Verdünnung25
Ich40000 = leer
  1. BCA-Assay-Verfahren
    1. Übertragen Sie 25 μl jedes BCA-Standards oder jeder Probe in eine 96-Well-Platte. Geben Sie 200 μl WR zu jedem Well-haltigen Standard oder jeder Probe. Die Platte auf einem Plattenschüttler 30 s gründlich mixen.
    2. Die Platte mit einem Plattenversiegeler abdecken und bei 37 °C 30 min inkubieren. Lassen Sie die Reaktionen nach der Inkubation etwa 10 Minuten lang zu RT äquilibrieren. Lesen Sie jede Platte bei 562 nm mit einem Mikroplatten-Reader mit der zugehörigen Software ab.
  2. Normkurve generieren und Ergebnisse ermitteln
    1. Notieren Sie die Absorptionswerte für die Standards und Proben. Die Verdünnungsreihen finden Sie in Tabelle 1 . Subtrahieren Sie die Absorptionswerte des Standardblindwerts von jedem Absorptionswert der Standards und der Probe. Mittelung der doppelten Messwerte für jeden Standard und jede Probe, um die Gesamtproteinkonzentration zu schätzen.
    2. Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie die korrigierte mittlere Extinktion für jeden Standard auf der x-Achse und die Konzentration auf der y-Achse darstellen. Zeichnen Sie eine lineare Kurve mit der entsprechenden Software, die die Kurvenanpassung mit vier Parametern unterstützt.
    3. Verwenden Sie die Standardkurve, um die Konzentration jeder Probe zu bestimmen, indem Sie ihre Reaktion auf die Konzentration interpolieren. Mit dem Verdünnungsfaktor (Schritt 1.5) wird multipliziert, um die tatsächliche Konzentration der Probe zu erhalten.

3. Visualisierung des Proteins mittels SDS-PAGE-Assay

  1. Vorbereitung der Probe und der Lösungen
    1. Vorbereiten von Stammlösungen
      1. Bereiten Sie 10% (w/v) SDS, 1,5 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w/v) Ammoniumpersulfat (APS)-Lösung (frisch zubereiten) zu.
      2. (w/v) SDS: Wiegen Sie 1 g SDS und fügen Sie 10 mL dH2O hinzu.
      3. M Tris-HCl pH 8,8: Wiegen Sie 18,15 g Tris und lösen Sie es mit ~60 mL dH2O auf. Stellen Sie es mit HCl auf pH 8,8 ein. Fügen Sie dH2O hinzu, um das Volumen auf 100 mL zu bringen.
      4. M Tris-HCl pH 6,8: Wiegen Sie 6,00 g Tris und lösen Sie es mit ~60 mL dH2O auf. Stellen Sie es mit HCl auf pH 6,8 ein. Fügen Sie dH2O hinzu, um das Volumen auf 100 mL zu bringen.
      5. APS: Wiegen Sie 15 mg APS und fügen Sie 150 μl dH2O hinzu.
        ACHTUNG: Acrylamid und SDS sind giftig und gesundheitsschädlich. Tragen Sie Schutzhandschuhe und arbeiten Sie unter einer Kapuze.
    2. Bereiten Sie den Probenpuffer vor, indem Sie 50 μl β-Mercaptoethanol in 950 μl 2x SDS-PAGE-Probenpuffer geben.
      ACHTUNG: β-Mercaptoethanol ist giftig, wenn es eingeatmet wird. Tragen Sie Schutzhandschuhe und arbeiten Sie unter einer Kapuze.
    3. Bereiten Sie den Laufpuffer vor, indem Sie 100 mL 10x Tris-Glycin SDS Running Buffer mit 900 mL dH2O mischen.
    4. Bereiten Sie die Färbelösung vor (45 % dH2O, 45 % Methanol, 10 % Eisessig, 2 g Coomassie Brilliant Blue R).
    5. Bereiten Sie die Entfärbungslösung vor (50 % dH2O, 40 % Methanol, 10 % Eisessig).
  2. Zubereitung des Gels
    1. Bereiten Sie die Ausrüstung der Elektrophoreseeinheit vor, einschließlich Gelkassette, Netzteile, Elektroden und Kabel für den Assay. Reinigen Sie die Glasplatten mit Ethanol und bauen Sie das Sandwich zusammen. Achten Sie darauf, dass die Unterkanten von Glasplatten und Abstandhaltern gut ausgerichtet sind.
    2. Bereiten Sie die Trenngelmischung vor, die 3,5 mL dH2O, 2,4 mL 40 % Acrylamid/Methylen bis Acrylamid, 2 mL 1,5 M Tris-HCl, 100 μL 10 % (w/v) SDS, 80 μL 10 % APS, 8 μL N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin (TEMED) enthält.
      ACHTUNG: TEMED ist giftig und/oder reizend. Tragen Sie Schutzhandschuhe und arbeiten Sie unter einer Kapuze.
    3. Gießen Sie die Trenngelmischung in die Gelplatten bis zu einer Höhe, die ca. 1-1,5 cm unter der Oberseite der kürzeren Platte liegt.
    4. Schichten Sie die Oberseite des Trenngels mit Isopropanol, um Blasen an der Oberseite des Gels zu entfernen und das polymerisierte Gel vor dem Austrocknen zu bewahren.
    5. Gießen Sie Isopropanol auf das Trenngel, nachdem das Trenngel mindestens 15 Minuten lang polymerisiert hat.
    6. Bereiten Sie die Stapelgelmischung vor, die 1,92 mL dH2O, 300 μL 40 % Acrylamid/Methylen bis Acrylamid, 750 μL 0,5 M Tris-HCl, 100 μL 10 % (w/v) SDS, 30 μL 10 % APS und 3 μL TEMED enthält.
    7. Gießen Sie die Stapelgellösung auf das Trenngel, so dass die Gelplatten gefüllt sind. Führen Sie den Kamm an die Oberseite der Abstandshalter ein.
    8. Lassen Sie das Stapelgel bei Raumtemperatur ca. 15 min polymerisieren.
  3. Das Gel laufen lassen
    1. Befestigen Sie das Gel an der Elektrodenanordnung. Geben Sie frisch zubereitetes 1x Tris-Glycin SDS Running Buffer in beide Kammern des Geräts.
    2. Den Kamm entfernen.
    3. Laden Sie 5 μl der Leiter (10-250 kDa) und 8 μl der mittleren Phase der verdünnten Proben in die Vertiefungen des Gels. Lassen Sie das Gel bei 80 V laufen, bis der Farbstoff in das Trenngel migriert, und erhöhen Sie es auf 120 V, bis der Farbstoff den Boden des Gels erreicht. Schalten Sie die angewendete Leistung aus, nachdem der Farbstoff den Boden des Gels erreicht hat.
  4. Färben und Entfärben des Gels
    1. Entfernen Sie das Gel aus dem Gerät, sobald der Lauf abgeschlossen ist, und entfernen Sie die Abstandshalter und Glasplatten. Lege das Gel in eine kleine Schale.
    2. Das Gel durch Zugabe von Färbelösung (Schritt 3.1.4) für 30 min unter leichtem Schütteln bei 55 U/min färben.
    3. Gießen Sie die Färbelösung aus dem Gel ab. Spülen Sie das Gel mit etwas Entfärbungslösung ab und entsorgen Sie den Farbstoff.
    4. Fügen Sie eine ausreichende Menge Entfärbungslösung hinzu, um das Gel zu bedecken, und entfärben Sie es unter leichtem Schütteln für ~1 h, bis die Banden sichtbar sind.

4. Lactoferrinkonzentration unter Verwendung eines Rinder-Lactoferrin-ELISA

  1. Erstellung von Standards und Reagenzien
    1. Verwenden Sie für diesen Assay das im Handel erhältliche Rinder-LF/LTF/Lactoferrin-ELISA-Kit.
    2. Äquilibrieren Sie alle Proben und Standards auf RT.
    3. Bereiten Sie ausreichende Mengen an Nachweisreagenz A und Arbeitslösung B vor, die für die Bindung an das eingefangene Antigen verantwortlich sind.
    4. Die Nachweisreagenzien A und B werden mit den Assay-Verdünnungsmitteln A bzw. B auf ein Verhältnis von 1:100 verdünnt.
    5. Bereiten Sie einen 1x Arbeitswaschpuffer vor, indem Sie das 30x Waschpufferkonzentrat mit dH2O verdünnen.
    6. Geben Sie eine ausreichende Menge 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) Substratlösung in ein steriles Mikroröhrchen.
    7. Ein Röhrchen mit lyophilisiertem Standard (100 ng/ml) mit 0,5 ml des Probenverdünnungsmittels resuspendieren und 10 Minuten lang unter leichtem Rühren bei RT inkubieren. Drehen Sie das Fläschchen, um sicherzustellen, dass das gesamte lyophilisierte Sanple am Boden gesammelt wird.
    8. Eine Standardverdünnungsreihe nach folgendem Verdünnungsschema (Tabelle 2) vorbereiten.

Tabelle 2: Verdünnungsschema von Rinderlactoferrin-Standards.

PhioleVolumen des Verdünnungsmittels (μL)Volumen und Quelle von Lf (μL)Abschließende Elfkonzentration (ng/ml)
D10500 μL Vorrat100
D2250250 Fläschchen D1 Verdünnung50
D3250250 der Durchstechflasche D2 Verdünnung25
D4250250 der Durchstechflasche D3 Verdünnung12.5
D5250250 der Durchstechflasche D4 Verdünnung6.25
D6250250 der Durchstechflasche D5 Verdünnung3,125
D7250250 Fläschchen D6 Verdünnung1,563
D825000 = leer
  1. Messung der Konzentration von Rinderlactoferrin
    1. Pipettieren Sie 100 μl jedes Lactoferrin-Standards oder jeder Probe in die beschichtete 96-Well-Streifenplatte. Decken Sie die Platte mit einem Plattenversiegeler ab, um Verdunstung zu vermeiden. Bei 37 °C 1 h inkubieren.
    2. Saugen Sie die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung an. Geben Sie 100 μl der Arbeitslösung des Nachweisreagenzes A in jede Vertiefung. Mit einem Plattenversiegeler abdecken und vorsichtig umrühren, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Bei 37 °C 1 h inkubieren.
    3. Waschen Sie dreimal, indem Sie ca. 350 μl 1x Waschpuffer hinzufügen, nachdem Sie die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung angesaugt haben. Lassen Sie jede Wäsche 1-2 Minuten einwirken, bevor Sie vollständig absaugen. Nach dem letzten Waschen aspirieren, um den restlichen Waschpuffer zu entfernen, dann die Platte umdrehen und gegen ein sauberes, saugfähiges Papier klopfen.
    4. Geben Sie 100 μl der Arbeitslösung des Nachweisreagenzes B in jede Vertiefung. Mit einem neuen Plattenversiegeler abdecken. Bei 37 °C 30 min inkubieren. Die Flüssigkeit wird aus jeder Vertiefung abgesaugt und fünfmal gewaschen, wie in Schritt 4.2.3 beschrieben. Geben Sie 90 μl TMB-Substratlösung in jede Vertiefung und bedecken Sie sie mit einem neuen Plattenversiegeler.
    5. Inkubieren Sie bei 37 °C für 10-20 Minuten ohne Licht. Überprüfen Sie die optimale Farbe, indem Sie regelmäßig überwachen. Beachten Sie, dass die intensive blaue Farbe in der Vertiefung hochkonzentriertes Lactoferrin enthält.
    6. Geben Sie 50 μl Stopplösung in jede Vertiefung. Die Farbe ändert sich von Blau zu Gelb. Messen Sie die Absorption jeder Vertiefung sofort bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader mit der zugehörigen Software.
      HINWEIS: Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um ein gründliches Mischen zu gewährleisten, bis die Farbänderung gleichmäßig ist.
  2. Normkurve generieren und Ergebnisse ermitteln
    1. Befolgen Sie Schritt 2.3.1 zur Datengenerierung zur Schätzung der Lactoferrinkonzentration.
    2. Konstruieren Sie eine Standardkurve, indem Sie die korrigierte mittlere Absorption für jeden Standard zeichnen, wie in Schritt 2.3.2 beschrieben, aber eine Polynomkurve mit geeigneter Software zeichnen, die die Kurvenanpassung mit vier Parametern ermöglicht.
    3. Berechnen Sie den Lactoferringehalt jeder Probe, indem Sie den Absorptionswert auf die generierte Gleichung interpolieren, wie in Schritt 2.3.3 beschrieben.

5. Bestimmung der IgG-Konzentration von Proben mittels Rinder-IgG-ELISA

  1. Erstellung von Standards und Reagenzien
    1. Verwenden Sie die erforderlichen Elemente aus den im Rinder-IgG-ELISA-Kit enthaltenen Elementen.
    2. Äquilibrieren Sie alle Proben und Standards auf RT.
    3. Bereiten Sie ausreichende Mengen der funktionierenden Enzym-Antikörper-Konjugatlösung vor, indem Sie 10 μl Meerrettichperoxidase (HRP)-Avidin Konzentrat (100x) mit 990 μl Enzym-Antikörper-Konjugat-Verdünnungsmittel verdünnen.
    4. Bereiten Sie ausreichende Mengen von 1x Waschpuffer vor, indem Sie das 20x Waschpufferkonzentrat mit dH2O verdünnen.
    5. Bereiten Sie ausreichende Mengen der 1x Verdünnungslösung vor, indem Sie das 20x Verdünnungsmittelkonzentrat mit dH2O verdünnen.
    6. 1,0 ml dH2O werden in den Rinder-IgG-Kalibrator gegeben und vorsichtig gemischt, bis es sich aufgelöst hat. Die Endkonzentration des Kalibrators beträgt 123.000 ng/mL.
    7. Die Standardverdünnungsreihen sind nach dem in Tabelle 3 beschriebenen Verdünnungsschema zu erstellen.

Tabelle 3: Verdünnungsschema von IgG-Standards für Rinder.

PhioleVolumen des Verdünnungsmittels (μL)Volumen und Quelle von IgG (μL)Abschließende IgG-Konzentration (ng/ml)
D1900100 μL Vorrat12300
D2900100 Fläschchen D1 Verdünnung1230
D3178122 der D2-Verdünnung des Fläschchens500
D415050 der Durchstechflasche D3 Verdünnung250
D5150150 der Durchstechflasche D4 Verdünnung125
D6100100 Fläschchen D5 Verdünnung62.5
D7100100 Fläschchen D6 Verdünnung31.25
D8100100 Fläschchen D7 Verdünnung15,625
D9100100 Fläschchen D8 Verdünnung7,813
Nr. D1010000 = leer
  1. Verfahren des Rinder-IgG-ELISA-Assays
    1. Pipettieren Sie 100 μl jedes IgG-Standards oder jeder IgG-Probe in die beschichtete 96-Well-Streifenplatte. Die Platte mit einem Plattenversiegeler abdecken und 30 min bei RT inkubieren. Saugen Sie die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung an.
    2. Waschen Sie viermal, indem Sie die Vertiefungen mit 1x Waschpuffer füllen und aspirieren. Nach dem letzten Waschen aspirieren, um alle verbleibenden Waschpuffer zu entfernen, dann die Platte umdrehen und gegen sauberes, saugfähiges Papier klopfen. 100 μl angemessen verdünntes Enzym-Antikörper-Konjugat in jede Vertiefung geben. Mit einem Plattenversiegeler abdecken und vorsichtig umrühren, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.
    3. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT. Waschen und entfernen Sie den restlichen Waschpuffer aus den Vertiefungen, wie in Schritt 5.2.2 beschrieben. Geben Sie 100 μl TMB-Substrat in jede Vertiefung; Mit einem neuen Plattenversiegeler abdecken.
    4. Inkubieren Sie bei RT genau 10 Minuten lang ohne Licht. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 100 μl Stopplösung in jede Vertiefung geben. Lesen Sie jede Platte bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader und der zugehörigen Software ab.
  2. Normkurve generieren und Ergebnisse ermitteln
    1. Führen Sie Schritt 2.3.1 für die Datenausgabe aus, um die IgG-Konzentration zu schätzen.
    2. Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie die Konzentration auf der x-Achse und die korrigierte mittlere Absorption für jeden Standard auf der y-Achse darstellen. Zeichnen Sie eine Polynomkurve mit der entsprechenden Software, die die Kurvenanpassung mit vier Parametern unterstützt.
    3. Berechnen Sie den IgG-Gehalt jeder Probe, indem Sie den Absorptionswert auf die generierte Gleichung interpolieren, wie in Schritt 2.3.3 beschrieben.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gemäß dem Protokoll wurden die Rinderkolostrumproben analysiert, um die Protein-, Lactoferrin- und IgG-Konzentration zu bestimmen. Die Ergebnisse der Protein-, Lactoferrin- und IgG-Analysen von Rinderkolostrum sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4: Konzentration von Protein, Lactoferrin und IgG von Rinderkolostrum.

...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie gibt Aufschluss über erhebliche Veränderungen der Protein-, Lactoferrin- und IgG-Konzentrationen im Kolostrum während des Übergangs zu reifer Milch. Der Nachweis von Veränderungen der Lactoferrin- und IgG-Konzentration erfolgte mittels Sandwich-ELISA und die Gesamtproteinkonzentration wurde durch den BCA-Assay analysiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass frühes Kolostrum die höchste Protein-, Lactoferrin- und IgG-Konzentration aufweist, die anschließend in den nächsten...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wird von Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.) unterstützt. RMD und BMH sind Mitarbeiter von Evolve BioSystems, einem Unternehmen, das sich auf die Wiederherstellung des Mikrobioms von Säuglingen konzentriert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10X Running Buffer (Tris-Glycin-SDS)ClearBandTGS10SDS-Page Analyse
2-Mercaptoethanolgibco31350-010SDS-Page Analyse
Essigsäure GLACIALIsolab901,013,2500SDS-Page Analyse
IgG ELISA KitAviva Systems BiologyOKIA00005Bestimmung der IgG-Konzentration
Rinder LF / LTF / Lactoferrin ELISA KitLSBio Lifespan BiosciencesLS-F4884Bestimmung der Lactoferrinkonzentration
Coomassie Brillant Blue R 250amresco0472-25GSDS-Seitenanalyse
Salzsäure Fuming 37%Isolab932,103,2501SDS-Seitenanalyse
IsopropanolIsolab961,023,2500SDS-Seitenanalyse
Laemmli Probe Puffer (2X)ClearBandLSB-2xSDS-Seitenanalyse
MethanolIsolab947,046,2500SDS-Seitenanalyse
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder 10 bis 250Thermo Scientific26619SDS-Seitenanalyse
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225Bestimmung der Proteinkonzentration
Natriumdodecylsulfat (SDS)BioShopSDS001.500SDS-Seitenanalyse
SureCast Acrylamid Lösung 40% (w/v)InvitrogenHC2040SDS-Seitenanalyse
SureCast Ammoniumpersulfat (APS)Thermo Scientific17874SDS-Seitenanalyse
SureCast Tetramethylethylendiamin (TEMED)InvitrogenHC2006SDS-Seitenanalyse
TECAN Infinite M200 Plate ReaderTecan30035094Messung der Absorption
Tris-BaseBioShopTRS001.1SDS-Page-Analyse
Rinder

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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