Eine wirksame Impfmethode für Phytophthora capsici auf schwarzen Pfefferpflanzen

Summary

Das Nadelstechen des Basalkopfes der schwarzen Pfefferpflanze ist eine kurze und zeitsparende Methode, um sie zu beschädigen. Hier haben wir detaillierte Schritte mit einem Video zur Infektion von schwarzen Pfefferpflanzen bereitgestellt.

Abstract

Piper nigrum L. (schwarzer Pfeffer) ist eine typische holzige Rebe, die weltweit eine wirtschaftlich wichtige Gewürzpflanze ist. Die Produktion von schwarzem Pfeffer wird erheblich durch die durch Phytophthora capsici verursachte Wurzelfäulekrankheit beeinträchtigt, die die Branchenentwicklung als "Engpassproblem" ernsthaft beeinflusst hat. Der molekulargenetische Mechanismus der Resistenz in schwarzem Pfeffer ist jedoch unklar, was zu langsamen Fortschritten bei der Entwicklung neuer schwarzer Pfeffersorten führt. Eine effektive Impfung und ein präzises Probenahmesystem für Phytophthora capsici an schwarzen Pfefferpflanzen sind für die Untersuchung dieser Pflanzen-Krankheitserreger-Interaktion unerlässlich. Das Hauptziel dieser Studie ist es, eine detaillierte Methodik zu demonstrieren, bei der der basale Kopf von schwarzem Pfeffer mit Phytophthora capsici beimpft wird, und gleichzeitig eine Referenz für die Impfung von holzigen Rebpflanzen zu liefern. Der Basalkopf der schwarzen Pfefferpflanze wurde gestochen, um sie zu beschädigen, und Myzelpellets bedeckten die drei Löcher, um die Feuchtigkeit zu speichern, damit der Erreger die Pflanze gut infizieren konnte. Diese Methode bietet eine bessere Möglichkeit, die Instabilität zu lösen, die durch traditionelle Impfmethoden verursacht wird, einschließlich Bodentränken oder Wurzeltauchen. Es bietet auch ein vielversprechendes Mittel, um die Wirkungsweise zwischen Pflanzen und anderen bodenbürtigen Pflanzenpathogenen in der landwirtschaftlichen Präzisionszüchtung zu untersuchen.

Introduction

Schwarzer Pfeffer (Piper nigrum L.) ist ein holziger Kletterer und eine der wichtigsten Gewürzpflanzen. Er ist als "König der Gewürze^"1 bekannt und wird in über 40 Ländern und Regionen in Asien, Afrika und Lateinamerika angebaut. Phytophthora-Wurzelfäule ist die verheerendste Krankheit des schwarzen Pfeffers und wird durch den Oomyceten Phytophthora capsici verursacht. Dieser Erreger infiziert auch Kürbisgewächse, Auberginen, Chilischoten und Tomaten ^2,3. Mit schwarzem Pfeffer kann manchmal eine ganze Ernte durch diese Krankheit dezimiert werden. Die Ausweitung der Pfefferanbauflächen ist aufgrund der Nichtverfügbarkeit resistenter Sorten eingeschränkt, was die Entwicklung der chinesischen Schwarzpfefferindustrie erheblich behindert hat. Eine effektive Impfung und ein präzises Probenahmesystem für Phytophthora capsici an schwarzen Pfefferpflanzen sind für die Untersuchung dieser Pflanzen-Pathogen-Interaktion unerlässlich.

Die Identifizierung und das Screening von Resistenzen in Keimplasmaressourcen ist die Grundvoraussetzung für die Erforschung der Pathogenität des Erregers und die Züchtung und Verwertung resistenter Sorten. Ein weit verbreiteter Ansatz ist die Verwendung einer Vielzahl von Identifizierungsmethoden, die auf Pflanzenarten und Krankheitserregergruppen basieren. Zu den derzeitigen Identifizierungsmethoden gehören die Identifizierung von Populationen, die Identifizierung von Einzelpersonen, die Identifizierung von Organen, die Identifizierung von Geweben, die Identifizierung von Zellen, die biochemische Identifizierung und die molekulare Identifizierung, die in den letzten Jahren entwickelt wurden ^4,5. In diesen Bereichen gab es Erfolge, aber es gibt auch viele Probleme. Unabhängig davon, welche Methode gewählt wird, sind die grundlegenden Anforderungen an die Identifizierung von Pflanzenresistenzen konsistent, einschließlich klarer Ziele, zuverlässiger Ergebnisse und Methoden, die einfach, schnell und leicht zu standardisieren sind. Dieses Prinzip muss auch bei der Identifizierung von Schwarzpfefferresistenzen befolgt werden.

Unter natürlichen Feldbedingungen kann die Identifizierung von Krankheitsresistenzen durch viele Umweltfaktoren beeinflusst werden. Daher wurde vorgeschlagen, abgelöste Blätter und bewässerte Wurzeln im Labor zu verwenden, um Krankheitsresistenzen zu identifizieren. Junge Blätter von gesunden Pflanzen wurden in vitro im Labor geimpft, und die erkrankte Blattfläche wurde durch Impfung des Erregers gemessen, um die Krankheitsresistenz von Pflanzen zu identifizieren⁶. Die In-vitro-Blattimpfung kann jedoch nur zur allgemeinen Resistenzidentifizierung und nicht für molekulare Interaktionsstudien verwendet werden. Trotzdem zeigt sich der krankheitsresistente Status häufig in der bewässerten Wurzelimpfung, was zu Unsicherheit in der Folgestudie der molekularen Züchtung auf Krankheitsresistenz führt. Daher sind schnelle und einfache Indoor-Detektionsmethoden unerlässlich. Diese Studie zielt darauf ab, eine Methode zur Resistenzidentifikation im Labor bereitzustellen.

Protocol

1. Vorbereitung von schwarzen Pfefferschneidepflanzen für Infektionen

1. Nehmen Sie einen etwa 40 cm langen Fünfknotenschnitt mit einem Durchmesser von 0,5 cm aus einem gesunden und kräftig wachsenden orthotropen Zweig aus schwarzem Pfeffer mit einem desinfizierten Schnittmesser oder einer Gartenschere. Beschneiden Sie die unteren drei Knoten der plagiotropen Zweige, wobei die oberen beiden Knoten mit etwa 10 Blättern intakt bleiben.
2. Bewurzelungssubstrat mit Erde und Tierdung (Kuhdung oder Schafdung) im Verhältnis 1:1 vorbereiten. Autoklavieren Sie das Wurzelsubstrat bei 121 °C für 20 min.
3. Setzen Sie die Stecklinge in einem Winkel von ca. 50° in das Wurzelsubstrat ein, wobei der dritte Knoten nur die Oberfläche des Substrats und die Achselknospe auf diesem Knoten über dem Substrat berührt.
   HINWEIS: Die hier verwendete Tasche hat folgende Abmessungen: Höhe von 40-60 cm, Durchmesser von 25-30 cm.
4. Gießen Sie 10-20 L Wasser über die Wurzeln der Pflanze. Stellen Sie die Stecklinge in ein Gewächshaus mit 90% Schatten bei einer Temperatur von 25-30 ° C für die Bewurzelung und das Wachstum.

2. Vermehrung von Phytophthora capsici (P. capsici)

HINWEIS: Ein Bestand an Phytophthora capsici-Kultur wird im Pflanzenschutzlabor des Gewürz- und Getränkeforschungsinstituts der Chinesischen Akademie der tropischen Agrarwissenschaften⁷ gehalten.

1. Bürsten und reinigen Sie die Kartoffelknollen unter fließendem Leitungswasser und schneiden Sie dann 200 g Kartoffeln in Würfel von 1 cm³. Einige der Würfel in ein Becherglas mit 800 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) geben und 20 min kochen lassen.
2. Filtern Sie die Brühe durch doppelte Gaze mit Schwerkraftfiltration. Kartoffeldextrose-Agar (PDA) vorbereiten, indem Sie dem Filtrat 20 g Dextrose und 15 g Agar hinzufügen und das Volumen bis zu 1 l mit ddH 2 O belegen. Autoklavieren Sie die Mischung bei 121 °C für 20 min⁸_.
3. Gießen Sie 20 ml des sterilisierten PDA in flüssiger Form in eine runde Petrischale mit einem Durchmesser von 9 cm in einer laminaren Luftstromhaube. Lassen Sie die PDA-Platten mit Deckeln über Nacht in der laminaren Luftstromhaube geöffnet, um Kondensation zu vermeiden.
4. Verwenden Sie eine Impfschleife, um Myzelien aus dem Phytophthora capsici-Bestand in einem Reagenzglas aufzunehmen. Stellen Sie das Inokulum mit der Myzelseite in Kontakt mit dem PDA in einer Petrischale.

3. Infektion von schwarzem Pfeffer

1. Inkubation
   1. Identifizieren Sie einen Bereich 5 cm über der Substratoberfläche und in der Nähe der Wurzeln am Stiel für die Impfung.
   2. Kernen Sie eine Myzelienscheibe mit einem Durchmesser von 0,5 cm am wachsenden Rand der Phytophthora capsici-Kultur auf PDA in einer Petrischale mit einem Stopperbohrer.
   3. Beschädigen Sie den Stiel mit einer Spritzennadel und machen Sie drei Löcher in einem dreieckigen Muster an der ausgewählten Impffläche. Bedecken Sie jedes Loch mit einer Myzelscheibe. Positionieren Sie die Löcher nahe beieinander, um sicherzustellen, dass der verwundete Bereich vollständig mit den Myzelscheiben bedeckt ist.
   4. Decken Sie die Myzelscheiben mit sterilisierten, angefeuchteten Wattepads ab, um das Austrocknen zu verhindern. Binden Sie das Pad mit einem Polyethylenstreifen auf den Stiel, um die Position der Impfscheiben beizubehalten.
      HINWEIS: Um 8 Uhr nach der Impfung wurden die geimpften Löcher schwarz und die Läsion dehnte sich im Laufe der Zeit aus. Die Blätter färbten sich gelb und fielen ab, und die geimpfte Pflanze starb 7-10 Tage nach der Impfung. In den Kontrollanlagen entwickelten sich keine Läsionen. Die meisten Gene exprimierten nach der Impfung mit Phytophthora capsici im Vergleich zur Kontrollgruppe anders. Die histopathologische Analyse der infizierten Gewebe zeigte, dass Phytophthora capsici im Xylem besiedelte.
2. Probieren Sie die Pflanzenmaterialien von Interesse und lagern Sie sie bei -80 ° C in flüssigem Stickstoff für die Verwendung in nachfolgenden Studien.
   HINWEIS: Flüssiger Stickstoff, Plastiktüten, Markerstifte, Astscheren und andere Materialien wurden vor den Experimenten vorbereitet.
3. Nachdem die spezifischen Pflanzenmaterialien für die Verwendung beprobt wurden, autoklavieren Sie alle verbleibenden Pflanzenmaterialien, übrig gebliebene Phytophthora capsici-Kultur und -Kulturmedium sowie alle Instrumente und Laborutensilien, die bei dieser Impfarbeit verwendet werden.

Results

Abbildung 1 zeigt die Symptome von schwarzen Pfefferblättern nach der Impfung von P. capsici. Abbildung 2 zeigt die Symptome von schwarzen Pfefferstängeln nach P. capsici Impfung. Der Erreger infizierte den schwarzen Pfeffer am basalen Stamm; Symptome wie Blattvergilbung, Welken auftreten, Xylembräunung und allmähliches Auftreten von Gefäßschwärzungen. Abbildung 3 zeigt, dass die meisten Gene nach der Impfung mit ...

Discussion

In dieser Studie wurde der Basalkopf gestochen, um ein wirksames Impfsystem in der schwarzen Pfefferpflanze zu schädigen und bereitzustellen. Myzelpellets bedeckten dann die drei Löcher, um Feuchtigkeit zu speichern und es dem Erreger zu ermöglichen, die Pflanze gut zu infizieren. Nach der Impfung färbten sich die Blätter gelb und fielen ab und die geimpften Pflanzen starben. In den Kontrollanlagen entwickelten sich keine Läsionen. Die meisten Gene exprimierten nach der Impfung mit Phytophthora capsici im Vergle...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Pulver	Solarbio	A8190
Reinbank	Haier
Dextrose	Xilong Scientific	15700501
Hochtemperatur-Sterilisationsofen	Zaelway
Petrischalenplatten	Biosharp	BS-90-D