Method Article

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

DOI:

10.3791/63015

⸱

November 20th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1School of Molecular Sciences, Arizona State University, 2Center for Applied Structural Discovery, Biodesign Institute, Arizona State University, 3Eyring Materials Center, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipidmonoschichten werden seit Jahrzehnten als Grundlage für die Bildung von zweidimensionalen (2D) Proteinkristallen für Strukturstudien verwendet. Sie sind an der Luft-Wasser-Grenzfläche stabil und können als dünnes Trägermaterial für die Elektronenbildgebung dienen. Hier stellen wir die bewährten Schritte zur Herstellung von Lipidmonolayern für biologische Studien vor.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Elektronenkristallographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur hochauflösenden Strukturbestimmung. Makromoleküle wie lösliche oder Membranproteine können unter günstigen Bedingungen zu hochgeordneten zweidimensionalen (2D) Kristallen gezüchtet werden. Die Qualität der gezüchteten 2D-Kristalle ist entscheidend für die Auflösung der finalen Rekonstruktion mittels 2D-Bildverarbeitung. Im Laufe der Jahre wurden Lipidmonoschichten als unterstützende Schicht verwendet, um die 2D-Kristallisation von peripheren Membranproteinen sowie löslichen Proteinen zu fördern. Diese Methode kann auch auf die 2D-Kristallisation integraler Membranproteine angewendet werden, erfordert jedoch umfangreichere empirische Untersuchungen, um Waschmittel- und Dialysebedingungen zu bestimmen, um die Aufteilung auf die Monoschicht zu fördern. An der Luft-Wasser-Grenzfläche bildet sich eine Lipidmonoschicht, so dass die polaren Lipidkopfgruppen in der wässrigen Phase hydratisiert bleiben und die unpolaren Acylketten, Schwänze sich in die Luft aufteilen, die Oberflächenspannung brechen und die Wasseroberfläche abflachen. Die geladene Natur oder die charakteristischen chemischen Bestandteile der Kopfgruppen bieten eine Affinität für Proteine in Lösung und fördern die Bindung für die Bildung von 2D-Arrays. Eine neu gebildete Monoschicht mit dem 2D-Array kann leicht in ein Elektronenmikroskop (EM) auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter übertragen werden, das zum Heben und Unterstützen des kristallinen Arrays verwendet wird. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Lipid-Monolayer-Methodik für die kryogene elektronenmikroskopische (Kryo-EM) Bildgebung.

Introduction

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Elektronenbeugung durch 2D-Kristalle oder spiralförmige Arrays von Proteinen können in günstigen Fällen Sub-Nanometer-Auflösungen erreichen1,2,3. Von besonderem Interesse sind rekonstituierte 2D-Membranproteinarrays oder Kristalle in ihren nahezu nativen Umgebungen1. Da ein Kristall als Signalverstärker fungiert, der die Dichte der strukturellen Faktoren bei bestimmten räumlichen Frequenzen erhöht, ermöglicht die Elektronenkristallographie die Sondierung eines Ziels mit einer kleineren Größe bei hohen Auflösungen, z. B. kleinen Molekülen, als bei Einzelpartikel-Kryo-EM. Der Elektronenstrahl kann durch ein geordnetes 2D-Array von Proteinen gebeugt werden, wodurch ein Beugungsmuster oder ein Gitterbild erzeugt wird, je nachdem, wo die Bildebene auf demDetektor aufgezeichnetwird 4 . Die gebeugten Intensitäten können dann extrahiert und verarbeitet werden, um eine 2D-Projektionsstruktur des Kristalls zu rekonstruieren. Elektronen haben einen größeren Streuquerschnitt als Röntgenstrahlen und ihre Streuung folgt größtenteils dem Rutherford-Modell, das auf der Coulomb-Wechselwirkung zwischen den Elektronen und den geladenen Atomen imMolekül basiert 5. Die Dicken von 2D-Membrankristallen betragen in der Regel weniger als 100 nm, geeignet für die Elektronenübertragung ohne dynamische Streuung innerhalb der Probe6. Elektronenkristallographische Studien haben sich als leistungsfähiges Werkzeug erwiesen, um hochauflösende Strukturinformationen von Membranproteinen und Lipid-Protein-Interaktionen zu untersuchen7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Eine Lipidmonoschicht ist eine einzelne Lipidschicht, die aus Phospholipiden besteht, die dicht an einer Luft-Wasser-Grenzfläche6gepackt sind und die 2D-Array-Bildung für lösliche Proteine oder periphere Membranproteine unterstützen können18. Abhängig von der Dichte der Lipide und ihrem lateralen Druck können die Lipidmoleküle ein geordnetes 2D-Array an der Luft-Wasser-Grenzfläche bilden, wobei ihre acylketten auf die Luft ausgedehnt sind und hydrophile Kopfgruppen in der wässrigen Lösung1,6,19freigelegt werden . Die Lipidkopfgruppe kann über elektrostatische Interaktion mit Proteinen interagieren oder modifiziert werden, um ein Affinitäts-Tag bereitzustellen, um eine bestimmte Proteindomäne zu binden. Zum Beispiel wird das DOGS-NTA-Ni (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2-Ni2+ ) häufig bei der Bildung einer Lipidmonoschicht verwendet, um die Proteine mit einem Poly-Histidin-Tag20,21,22zu binden . Auch das Choleratoxin B kann ein bestimmtes Pentasaccharid von Gangliosid GM1 in einer Lipidmonoschicht für Strukturstudienbinden 23,24. Durch die Verankerung der Proteine auf den Lipidkopfgruppen kann die Lipidmonoschicht die Bildung der dünnen 2D-Arrays für hochauflösende elektronenkristallographische Studien unterstützen. Die Lipid-Monolayer-Technik wurde in der Elektronenkristallographie für Strukturstudien von Proteinen wie Streptavidin2,25, Annexin V26, Choleratoxin27, E. coli gyrase B Untereinheit28, E. coli RNA Polymerase25,29,30, Carboxysomenschalenproteine31 und die Kapsidproteine des HIV-132 und Moloney murinen Leukämievirus verwendet 33. Aufgrund der Stabilität und chemischen Eigenschaften der Lipidmonoschicht wurden verschiedene Anwendungen für die Probenvorbereitung für die Kryo-EM-Bildgebung untersucht34. Für die Bildung von Protein-Arrays ist jedoch eine Optimierung erforderlich.

Hier geben wir ausführliche Details zur allgemeinen Herstellung von Lipidmonoschichten für die Kryo-EM-Bildgebung und einige Überlegungen, die die Qualität der gebildeten Monoschichten beeinflussen könnten.

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Protocol

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1. Teflonblock-Zubereitung

  1. Bereiten Sie den Teflonblock aus chemikalienbeständigem PTFE-Harz (Polytetrafluorethylen) vor. Machen Sie Löcher auf dem Block mit einem allgemeinen Bohrer, gefolgt von den in Abbildung 1beschrifteten Abmessungen.

2. Monolayer-Lipidpräparation

HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 30- 45 Minuten

  1. Lipid-Stoffaufbereitung
    1. Ein 0,01 mg/ml Lipidgemisch in 9:1 (v/v) Chloroform/Methanol wird unter Verwendung von 8,91 ml Chloroform, 0,99 ml Methanol und 0,01 ml 10 mg/ml Lipiden vorbereitet.
  2. Teflonplattenzubereitung
    1. Beschallen Sie eine Teflonplatte in einem Methanolbad für 5 Minuten.
    2. 15 Minuten mit heißem Wasser waschen.
    3. Mit destilliertem Wasser abspülen.
    4. Trocknen Sie die Teflonplatte 30 Minuten lang in einem Trockener und halten Sie sie bei Nichtgebrauch unter Vakuum (Abbildung 1).

3. Bildung von Lipidmonoschichten auf Pufferreservoir

HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 1,5 Stunden

  1. Bereiten Sie am Tag des Experiments eine Lipidmischung von 0,01 mg/ ml in einer 9:1-Mischung aus Chloroform/Methanol frisch vor.
  2. Legen Sie ein Typ-1-Filterpapier in eine Petrischale und ordnen Sie den Teflonblock auf dem Filterpapier an.
  3. Füllen Sie die Vertiefungen der Teflonplatte mit 60 μL des Puffers.
  4. Fügen Sie vorsichtig lipidische Mischung Tropfen für Tropfen (idealerweise 1 μL pro Tropfen) mit einer Hamilton-Spritze auf die Pufferoberfläche hinzu.
  5. Befeuchten Sie das Filterpapier mit destilliertem Wasser, um die Feuchtigkeit in der Petrischale zu halten.
  6. 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Chloroform sollte verdampfen und eine Monoschicht Lipid auf der Oberfläche des Puffers sollte gebildet werden.

4. Aufbringung eines EM-Gitters auf einer Lipid-Monoschicht

HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 1,5 Stunden

  1. Legen Sie vorsichtig ein löchriges, kohlenstoffbeschichtetes EM-Gitter ohne Glühen, Kohlenstoffseite nach unten, auf die Oberseite jedes Pufferreservoirs.
  2. Injizieren Sie Proteine vorsichtig in die seitliche Injektionsbrunnen. Verwenden Sie die endgültigen Proteinkonzentrationen in der Vertiefung um 1 μM Protein als Ausgangspunkt. Optimieren Sie die Proteinkonzentration vor dem Experiment.
  3. 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Vorsichtig ca. 20-30 μL Puffer in den seitlichen Injektionsanschluss injizieren. Dadurch wird das Gitter über die Oberfläche des Teflonblocks erhöht.
  5. Nehmen Sie das Gitter sofort mit einer Pinzette auf und heben Sie es vertikal vom Tröpfchen ab.
  6. Vorbereitung von Monolayer-Proben für negative Färbung oder Kryo-TEM-Bildgebung (Abbildung 2). Wenn die Proteine ein 2D-Array bilden, zeigt das Bildleistungsspektrum oder Das Fourier-Periodogramm Beugungsdichten bei den räumlichen Frequenzen basierend auf der Kristallsymmetrie. Wenn im Leistungsspektrum keine Beugungsflecken gezeigt werden, ist es unwahrscheinlich, dass die Proteine einen 2D-Kristall bilden.
  7. Überprüfen Sie die Abdeckung der Lipidmonoschicht auf dem EM-Gitter mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Ein tiefer vergrößertes Elektronenbild ist hilfreich, um die Morphologie der bedeckten Monoschicht zu identifizieren. Normalerweise ist der Bildkontrast des mit einer Einschicht bedeckten Bereichs etwas geringer als der der unbedeckten Bereiche. Darüber hinaus hilft das berechnete 2D-Bildleistungsspektrum, den Standort des 2D-Kristallins zu identifizieren.

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Results

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Eine auf dem EM-Gitter abgeschiedene Lipidmonoschicht kann unter einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) ohne Färbung visualisiert werden. Die Monoschichtpräsenz ist an der Kontrastdifferenz zur Fläche ohne Probe im Strahlengang zu erkennen. Bereiche mit Lipid-Monolayer-Abdeckung haben einen geringeren lokalen Kontrast als solche ohne Abdeckung, da der Elektronenstrahl durch die leeren Löcher keine Streuung aufweist und eine hellere Beleuchtung zeigt (Abbildung 3).

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Discussion

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Eine Lipidmonoschicht ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das das Wachstum großer 2D-Kristalle für Strukturstudien biologischer Makromoleküle erleichtert. Um eine intakte Lipidmonoschicht an der Luft-Wasser-Grenzfläche erfolgreich vorzubereiten, wird dringend empfohlen, die Lipide am Tag des Experiments frisch aufzubereiten, da eine Oxidation der Lipid-Acylkette zu einer Packungsstörung in der Monoschicht führen und die resultierende Kristallbildung beeinträchtigen könnte. Gekaufte Lipide in Pulverform sollten mit einer M...

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Disclosures

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Acknowledgements

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Die Vorbereitung dieses Manuskripts wurde teilweise vom US Army Research Office (W911NF2010321) und den Startfonds der Arizona State University für P.-L.C unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14:0 PC (DMPC)Avanti Lipids8503451,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin,
1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2,5 mL
Bulb für kleine PipettenFisher Scientific03-448-21
ChloroformSigma-AldrichC2432
Exsikkator-VakuumSouthern Labware55207
EM GitterElektronenmikroskopieCF413-50CF-1.2/1.3-4C 1.2 µ m Loch, 1,3 &Mikro; m space
FilterpapierGE Healthcare Life Sciences1001-090Durchmesser 90 mm
GlaspasteurpipettenFisher Scientific13-678-20A
Hamilton Spritze (25 & Mikro; L)Hamilton Company80465
Hamilton Spritze (250 &Mikro; L)Hamilton Company81165
Hamilton Spritze (5 & Mikro; L)Hamilton Company87930
Hamilton Spritze (500 &Mikro; L)Hamilton Company203080
MethanolSigma-AldrichM1775-1GA
PetrischaleVWR25384-342100 mm &fach 15 mm
TeflonblockGrainger55UK0560 & micro; L Vertiefungen mit seitlichen Injektionsöffnungen, manuell hergestellt
PinzetteElektronenmikroskopie Wissenschaften78325Verschiedene Ausführungen
Reinstwasser
UltraschallreinigerVWR97043-996

References

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