Methodenartikel

Radiosynthese von 1-(2-[18F]Fluorethyl)-L-Tryptophan unter Verwendung eines Eintopf-, zweistufigen Protokolls

DOI:

10.3791/63025

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21. September 2021

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1Diagnostic & Research PET/MRI Center, Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children, 2Department of Radiology, Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children, 3Department of Neurology, Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children, 4Department of Biomedical Research, Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir die Radiosynthese von 1-(2-[18F]Fluorethyl)-L-Tryptophan, einem bildgebenden Mittel zur Positronen-Emissions-Tomographie zur Untersuchung des Tryptophanstoffwechsels, unter Verwendung einer ein-Topf-, zweistufigen Strategie in einem radiochemischen Synthesesystem mit guten radiochemischen Ausbeuten, hohem enantiomerenübermäßigem Überschuss und hoher Zuverlässigkeit.

Zusammenfassung

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Der Kynurenin-Signalweg (KP) ist ein primärer Weg für den Tryptophan-Stoffwechsel. Es gibt starke Hinweise darauf, dass Metaboliten des KP aufgrund ihrer immunmodulatorischen, neuromodulatorischen und neurotoxischen Wirkungen eine wichtige Rolle bei der Tumorproliferation, Epilepsie, neurodegenerativen Erkrankungen und psychiatrischen Erkrankungen spielen. Das am häufigsten verwendete Positronen-Emissions-Tomographie-Mittel (PET) zur Kartierung des Tryptophan-Metabolismus, α-[11C]methyl-L-tryptophan ([11C]AMT), hat eine kurze Halbwertszeit von 20 min bei mühsamen Radiosyntheseverfahren. Ein Zyklotron vor Ort ist erforderlich, um [11C]AMT zu radiosynthetisieren. Nur eine begrenzte Anzahl von Zentren produziert [11C]AMT für präklinische Studien und klinische Studien. Daher ist die Entwicklung eines alternativen Bildgebungsmittels, das eine längere Halbwertszeit hat, eine günstige In-vivo-Kinetik aufweist und einfach zu automatisieren ist, dringend erforderlich. Der Nutzen und Wert von 1-(2-[18F]fluorethyl)-L-tryptophan, einem fluor-18-markierten Tryptophan-Analogon, wurde in präklinischen Anwendungen in Zelllinien-abgeleiteten Xenotransplantaten, patientenabgeleiteten Xenotransplantaten und transgenen Tumormodellen berichtet.

Dieses Papier stellt ein Protokoll für die Radiosynthese von 1-(2-[18F]fluorethyl)-L-Tryptophan unter Verwendung einer zweistufigen Eintopfstrategie vor. Mit diesem Protokoll kann der Radiotracer in einer radiochemischen Ausbeute von 20 ± 5% (Zerfall am Ende der Synthese korrigiert, n > 20) hergestellt werden, wobei sowohl die radiochemische Reinheit als auch der Enantiomerenüberschuss über 95% liegen. Das Protokoll zeichnet sich durch eine kleine Vorläufermenge mit nicht mehr als 0,5 ml Reaktionslösungsmittel in jedem Schritt, eine geringe Belastung mit potenziell toxischen 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosan (K222) und eine umweltfreundliche und injizierbare mobile Phase zur Reinigung aus. Das Protokoll kann leicht konfiguriert werden, um 1-(2-[18F]fluorethyl)-L-tryptophan für die klinische Prüfung in einem kommerziell erhältlichen Modul herzustellen.

Einleitung

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Beim Menschen ist Tryptophan ein wesentlicher Bestandteil der täglichen Ernährung. Tryptophan wird hauptsächlich über den Kynurenin-Signalweg (KP) metabolisiert. Die KP wird durch zwei ratenbegrenzende Enzyme katalysiert, Indoleamin-2, 3-Dioxygenase (IDO) und Tryptophan-2,3-Dioxygenase (TDO). Mehr als 95% von Tryptophan wird in Kynurenin und seine nachgeschalteten Metaboliten umgewandelt, wodurch letztendlich Nicotinamidadenindinukleotid entsteht, das für die zelluläre Energietransduktion unerlässlich ist. Der KP ist ein wichtiger Regulator des Immunsystems und ein wichtiger Regulator für Neuroplastizität und neurotoxische Wirkungen1,2. Abnormale Tryptophan-Metabolismus ist an verschiedenen neurologischen, onkologischen, psychiatrischen und metabolischen Störungen beteiligt; Daher wurden radioaktiv markierte Tryptophan-Analoga in der klinischen Forschung umfassend eingesetzt. Die beiden häufigsten klinisch untersuchten Tryptophan-Radiotracer sind 11C-α-methyl-L-tryptophan ([11C]AMT) und 11C-5-hydroxytryptophan (11C-5-HTP)3.

In den 1990er Jahren wurde 11C-5-HTP verwendet, um serotonin-sezernierende neuroendokrine Tumore sichtbar zu machen4 und die Therapie des metastasierenden hormonrefraktären Prostata-Adenokarzinoms zu diagnostizieren und zu überwachen5. Später wurde es als bildgebendes Werkzeug zur Quantifizierung des serotonergen Systems in der endokrinen Bauchspeicheldrüse verwendet6. 11 C-5-HTP war auch ein vielversprechender Tracer für den nichtinvasiven Nachweis lebensfähiger Inseln bei intraportaler Inseltransplantation und Typ-2-Diabetes7,8. In den letzten zwei Jahrzehnten sind viele radioaktiv markierte Aminosäuren in die klinische Prüfung übergegangen9,10. Insbesondere das Kohlenstoff-11-markierte Tryptophan-Analogon [11C]AMT hat umfangreiche Aufmerksamkeit für die Kartierung der Serotoninsynthese im Gehirn11,12,13,14 und für die Lokalisierung von epileptischen Herden, epileptogenen Tumoren, tuberösen Sklerosekomplexen, Gliomen und Brustkrebs erhalten15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24,25,26. [11C] AMT hat auch eine hohe Aufnahme bei verschiedenen nieder- und hochgradigen Tumoren bei Kindern27. Darüber hinaus wurde die kinetische Tracer-Analyse von [11C]AMT bei menschlichen Probanden verwendet, um verschiedene Tumore zu differenzieren und zu bewerten und Gliome von strahleninduzierten Gewebeverletzungen zu unterscheiden15. [11C] Die AMT-geführte Bildgebung zeigt signifikante klinische Vorteile bei Erkrankungen des Gehirns3,25. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit von Kohlenstoff-11 (20 min) und der mühsamen Radiosyntheseverfahren ist der Einsatz von [11C]AMT jedoch auf die wenigen PET-Zentren mit einem Zyklotron vor Ort und einer Radiochemieanlage beschränkt.

Fluor-18 hat eine günstige Halbwertszeit von 109,8 min, verglichen mit der 20-minütigen Halbwertszeit von Kohlenstoff-11. Die Bemühungen konzentrieren sich zunehmend auf die Entwicklung von fluor-18-markierten Radiotracern für den Tryptophanstoffwechsel3,28. Insgesamt wurden 15 einzigartige Fluor-18-radioaktiv markierte Tryptophan-Radiotracer in Bezug auf Radiomarkierung, Transportmechanismen, In-vitro- und In-vivo-Stabilität, Bioverteilung und Tumoraufnahme in Xenotransplantaten berichtet. Eine schnelle In-vivo-Defluorierung wurde jedoch für mehrere Tracer beobachtet, darunter 4-, 5- und 6-[18F]fluorotryptophan, was eine weitere klinische Translation ausschließt29. 5-[18F]Fluor-α-methyltryptophan (5-[18F]FAMT) und 1-(2-[18F]fluorethyl)-L-tryptophan (L-[18F]FETrp, auch bekannt als (S)-2-amino-3-(1-(2-[18F]fluorethyl)-1H-indol-3-yl)propansäure, Molekulargewicht 249,28 g/mol), sind die beiden vielversprechendsten Radiotracer mit günstiger In-vivo-Kinetik in Tiermodellen und großem Überschreitungspotenzial [11 C]AMT zur Beurteilung klinischer Zustände mit dereguliertem Tryptophanstoffwechsel28. 5-[18F]FAMT zeigte eine hohe Aufnahme in IDO1-positiven Tumorxenotransplantaten von immungeschwächten Mäusen und ist spezifischer für die Abbildung des KP als [11C]AMT28,30. Die In-vivo-Stabilität von 5-[18F]FAMT bleibt jedoch ein potenzielles Problem, da über 30 Minuten nach der Injektion des Tracers keine In-vivo-Defluorierungsdaten berichtet wurden30.

Eine präklinische Studie in einem gentechnisch veränderten Medulloblastom-Mausmodell zeigte, dass L-[18F]FETrp im Vergleich zu 18F-Fluordesoxyglucose (18F-FDG) eine hohe Akkumulation bei Hirntumoren, eine vernachlässigbare In-vivo-Defluorierung und eine geringe Hintergrundaufnahme aufwies, was ein überlegenes Target-to-Nontarget-Verhältnis zeigte31,32. Strahlendosimetrie-Studien an Mäusen zeigten, dass L-[18F]FETrp eine um etwa 20 % niedrigere günstige Dosimetrie-Exposition aufwies als der klinische 18F-FDG PET-Tracer33. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen anderer Forscher liefern präklinische Studiendaten substanzielle Beweise für die klinische Translation von L-[18F]FETrp zur Untersuchung des abnormalen Tryptophanstoffwechsels bei Menschen mit Hirnerkrankungen wie Epilepsie, Neuroonkologie, Autismus und tuberöser Sklerose28,31,32,33,34,35,36 . Ein Gesamtvergleich zwischen den drei am häufigsten untersuchten Tracern für den Tryptophanstoffwechsel, 11C-5-HTP, [11C]AMT und L-[18F]FETrp, ist in Tabelle 1 dargestellt. Sowohl 11C-5-HTP als auch [11C]AMT haben eine kurze Halbwertszeit und mühsame Radiomarkierungsverfahren. Ein Protokoll für die Radiosynthese von L-[18F]FETrp unter Verwendung eines Eintopf-, zweistufigen Ansatzes wird hier beschrieben. Das Protokoll umfasst die Verwendung einer kleinen Menge radioaktiver Vorläufersubstanz, eines kleinen Volumens an Reaktionslösungsmitteln, einer geringen Belastung durch toxisches K222 und einer umweltfreundlichen und injizierbaren mobilen Phase zur Reinigung und einfachen Formulierung.

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Protokoll

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ACHTUNG: Das Protokoll beinhaltet radioaktive Stoffe. Jede zusätzliche Dosis radioaktiver Stoffe könnte zu einer proportionalen Erhöhung der Wahrscheinlichkeit von gesundheitsschädlichen Auswirkungen wie Krebs führen. Die Forscher müssen die "so niedrig wie vernünftigerweise erreichbar" (ALARA) Dosispraxis befolgen, um das Radiosyntheseprotokoll mit angemessenem Schutz in der heißen Zelle oder der Bleihaube zu führen. Die Minimierung der direkten Kontaktzeit, die Verwendung einer Bleiabschirmung und die Einhaltung des maximalen Abstands für jeden Strahlungsexpositionsschritt im Radiosyntheseprozess sind unerlässlich. Tragen Sie während des gesamten Experiments ein Strahlendosimetrie-Abzeichen und Handüberwachungsringe und überwachen Sie häufig potenziell kontaminierte Oberflächen wie Handschuhe, Ärmel und Füße. Die Nuclear Regulatory Commission (NRC), lokale und institutionelle Vorschriften müssen für die Verwendung, den Versand und die Entsorgung von radioaktivem Material befolgt werden.

1. Erste Vorbereitungen

  1. Bereiten Sie 10% Ethanol in der mobilen Phase von 50 mM Natriumacetat / Essigsäure für die semipräparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) vor.
    1. Geben Sie 3 ml Eisessigsäure in einen sauberen 1000 ml Messkolben. 900 ml Reinstwasser (18 Millionen Ohm-cm Widerstand bei 25 °C) in den Messkolben geben; Fügen Sie ungefähr 8 ml 6 M Natronlauge hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit einem kalibrierten pH-Messgerät und einem pH-Streifen auf 5,5 ein. Nachdem die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt ist, stellen Sie das Volumen mit Reinstwasser auf 1000 ml auf, um die 50 mM Natriumacetat / Essigsäure (pH 5,5) -Lösung herzustellen.
    2. Vakuumfiltern Sie die Lösung durch einen 0,2 μm Membranfilter und geben Sie die Lösung in zwei 500 ml Lösungsmittelflaschen.
    3. Legen Sie etwa 250 ml des oben genannten Puffers in einen 500 ml Meßkolben. Verwenden Sie einen Messzylinder, um 50 ml Ethanol der United States Pharmacopeia (USP) zu messen, und fügen Sie das Ethanol dem Messkolben hinzu. Erhöhen Sie das Volumen mit 50 mM Natriumacetat / Essigsäure auf 500 ml und messen Sie den pH-Wert mit einem pH-Streifen.
  2. Bereiten Sie Qualitätskontrolllösungen (QC) für einen Systemeignungstest vor.
    1. Füllen Sie die HPLC-Lösungsmittelflaschen mit frischem Reinstwasser (Lösungsmittel A) und Ethanol (Lösungsmittel B) auf. Grundieren Sie die HPLC-Pumpe und laden Sie das HPLC-Programm mit einer Durchflussrate von 1 ml/min, bestehend aus 30% Lösungsmittel A und 70% Lösungsmittel B (v/v).
    2. Erstellen Sie eine Steuerungslösung (Blankolösung) für QC. Fügen Sie 5 ml 0,9% Natriumchlorid in eine 20 ml Glasdurchstechflasche hinzu. Zugabe von 0,15 ml 23,4%igem Natriumchlorid in die obige Lösung. In Schritt 1.1.3 hergestellte semipräparative mobile HPLC-Phase (10 % Ethanol in 50 mM Natriumacetat/Essigsäure, pH 5,5) in die Durchstechflasche im Glas geben.
    3. Bereiten Sie 1 μg/ml nicht radioaktiv markiertes L-FETrp und 5 μg/ml racemische L-FETrp- und D-FETrp-Gemische (Standardlösungen) vor.
    4. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve mit Standard-L-FETrp-Lösungen (0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1,0 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml).
    5. Richten Sie die HPLC-Sequenz ein. Stellen Sie sicher, dass die Sequenz einen Durchlauf der leeren Probenlösung, zwei Durchläufe des Standard-L-FETrp (1 μg/ml), einen Durchlauf der racemischen L-FETrp- und D-FETrp-Gemische (5 μg/ml) und einen Durchlauf des endgültigen Radiopharmazeutikums umfasst.
    6. Führen Sie die partielle HPLC-Sequenz durch, um die Systemeignung zu testen, bevor Sie die radioaktiven Proben mit einer analytischen HPLC-Säule (250 x 4,6 mm) analysieren.
      1. Führen Sie eine leere Probe durch und stellen Sie sicher, dass das Chromatogramm der leeren Probe keine oder unbedeutende Spitzen zwischen dem Hohlraumvolumen und 10 Minuten des Chromatogramms aufweist.
      2. Führen Sie zwei Replikate der Standardlösung aus (enthält 1 μg/ml L-FETrp). Stellen Sie sicher, dass die Bereiche des L-FETrp in den beiden Replikaten innerhalb von ±5 % des Mittelwerts liegen.
      3. Lassen Sie eine Probe der Mischungen L-FETrp und D-FETrp (5 μg/ml L-FETrp bzw. D-EFTrp) laufen. Stellen Sie sicher, dass L-FETrp und D-FETrp auf dem Chromatogramm identifiziert und der Ausgangswert aufgelöst werden können.
  3. Bereiten Sie die Radiomarkierungslösungen und andere Verbrauchsmaterialien vor.
    1. Fügen Sie die folgenden Lösungen zu fünf 1,5-ml-V-förmigen Durchstechflaschen hinzu. Durchstechflasche 1: 1 ml Kaliumcarbonat (K2CO3)/K222-Lösung (5 mg/ml K222 und 1 mg/ml K2CO3 in einer Wasser-/Acetonitrillösung, 1/99, v/v) für [18F]fluoridelution; Durchstechflasche 2: 0,4 ml wasserfreies Acetonitril zur [18F]fluoridtrocknung; Durchstechflasche 3: radioaktive Vorstufe in wasserfreiem Acetonitril (1-2 mg in 0,5 ml wasserfreiem Acetonitril) für [18F]fluorideinbau; Durchstechflasche 4: Salzsäure (2 M, 0,25 ml) in Acetonitril (0,25 ml) zur Acidolyse; Durchstechflasche 5: 2 M Natriumhydroxid (0,25 ml) zur Neutralisation der Reaktionsgemische.
    2. Aktivieren Sie eine quartäre Methylammonium (QMA) leichte Kartusche, indem Sie zuerst 10 ml gesättigte Natriumbicarbonatlösung passieren, gefolgt von 10 ml Reinstwasser, und spülen Sie die Kartusche dann mit einem Stickstofffluss. Konditionieren Sie eine leichte C8-Kartusche und eine neutrale Aluminiumoxidpatrone, indem Sie 10 ml Ethanol passieren, gefolgt von 10 ml Reinstwasser.
    3. Fügen Sie 0,15 ml 23,4% Natriumchlorid und 5 ml 0,9% Natriumchlorid zu einer 30 ml sterilen Formulierungsdurchstechflasche hinzu, um die Tonizität anzupassen und die HPLC-Fraktion zu verdünnen.
    4. Eine Lösung (1 ml Natriumacetat/Essigsäurepuffer, 50 mM, pH = 5,5 in Schritt 1.1.1, 1 ml Ethanol und 0,5 ml Wasser [insgesamt 2,5 ml]) in einer Spritze zum Spülen des Reaktionsgefäßes herzustellen; in eine sterile 10-ml-Durchstechflasche geben.

2. Montieren Sie die radioaktiven Markierungsvorräte und synthetisieren Sie L-[18F]FETrp

  1. Montieren Sie die radioaktiven Kennzeichnungsmaterialien.
    1. Schalten Sie die Stromversorgung des Moduls, Kohlendioxid, Druckluft, Argonleitungen und die Stromversorgung der speicherprogrammierbaren Steuerung (SPS) ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche mod_pscf18, um das Programm des radiochemischen Synthesesystems zu aktivieren. Initialisieren Sie das Eingabe-, Ausgabe- und Formulierungs-MVP und stellen Sie sicher, dass sich die MVPs an den Positionen 4, 1 bzw. 1 befinden.
    2. Stellen Sie sicher, dass sich die HPLC-Schleife in der Inject-Position und die QMA-Lichtpatrone in der [18F]fluorid-Catching-Position befindet.
    3. Installieren Sie die semipräparative HPLC-Flasche mit mobiler Phase (mit der in Schritt 1.1.3 hergestellten Lösung). Gleichen Sie das HPLC-System aus, indem Sie die mobile Phase durch die chirale HPLC-Säule (250 x 10 mm) und die C18-Säule (100 x 10 mm) bei einer Durchflussrate von 2 ml/min für mindestens 30 min leiten, dann das Umleitungsventil umschalten, die HPLC-Mobilsäule nur durch die chirale HPLC-Säule passieren lassen und die Durchflussrate auf 3 ml/min erhöhen.
    4. Installieren Sie die QMA-Lichtpatrone in der [18F]fluorid-Fang-/Freigabelinie. Installieren Sie die gestapelten Aluminiumoxid/C8-Kartuschen zwischen der Eingangs-MVP-Position 6 und der Zwischendurchstechflasche, bei der es sich um eine 10-ml-V-förmige Durchstechflasche handelt, die mit der HPLC-Probenschleife verbunden ist. Installieren Sie eine leere 10-ml-Durchstechflasche (Belüftungsdurchstechflasche) an der Ausgangs-MVP-Position 4, wobei eine weitere Nadel als Entlüftung an der Durchstechflasche befestigt ist. Installieren Sie die Reagenzfläschchen 1-5 an den Eingangs-MVP-Positionen 1-5.
    5. Installieren Sie die Durchstechflasche mit der in Schritt 1.3.4 vorbereiteten Spüllösung an der Ausgangs-MVP-Position 6.
    6. Installieren Sie eine 500-ml-Abfallflasche (um den HPLC-Abfall zu sammeln, der sowohl die chirale als auch die C18-Säule passiert) an der MVP-Position 1 der Formulierung. Installieren Sie eine weitere 500-ml-Abfallflasche (zur Sammlung von HPLC-Abfällen, die durch die chirale Säule geleitet werden) am Abfallsammelende des Vier-Wege-Zwei-Wege-Ventils.
    7. Verbinden Sie die Durchstechflasche mit der Fraktionssammlung (vorgefüllte Lösung, die in Schritt 1.3.3 vorbereitet wurde) mit der Formulierungs-MVP-Position 2. Schließen Sie die Ausgangs-MVP-Position 3 (Gasleitung) und die Endproduktabgabelinie an die Formulierungs-MVP-Position 2-Durchstechflaschen an, um das endgültige formulierte Produkt zurückzugewinnen. Installieren Sie eine leere sterile Durchstechflasche mit 10 ml in der Formulierungs-MVP-Position 3, die als Backup-Durchstechflasche für die Sammlung der Zielfraktion verwendet wird.
    8. Installieren Sie die C18-Kurzsäule zwischen dem zweipoligen Umleitungsventil mit vier Anschlüssen und dem Formulierungs-MVP.
      HINWEIS: Stellen Sie während der Installation der Reagenz- und Formulierungsfläschchen sicher, dass die Argonversorgung im Bedienfeld ausgeschaltet ist und der Argondruck Null ist, um einen unerwarteten Flüssigkeitstransfer während der Fläschchenmontage zu vermeiden. Überprüfen Sie alle Nadelverbindungen, Fläschchenpositionen und MVP-Positionen auf reproduzierbare Radiosynthese.
  2. Radiosynthese von L-[18F]FETrp
    1. Empfangen und erfassen Sie [18F]fluorid.
      1. Wenn Sie die [18F]fluoridlösung (15 ± 3 gigabecquerel (GBq) zu Beginn der Synthese erhalten, siehe Materialtabelle), untersuchen Sie die Bleibox auf der Oberfläche und in 1 m, um die maximalen Strahlenexpositionsraten aufzuzeichnen. Führen Sie einen Wischtest durch, um sicherzustellen, dass der Versandkarton nicht verunreinigt ist. Notieren Sie die [18F]fluoriddosis und -zeit.
    2. Transfer [18F]fluorid.
      1. Übertragen Sie die Radioaktivität auf das radiochemische Synthesesystem.
      2. Verbinden Sie die Argonlinie mit einer kurzen Nadel und die [18F]fluorid-Transferleitung mit einer langen Nadel mit der [18F]fluorid-Durchstechflasche. Schließen Sie die Heißzellen-Glastür und die Bleitür.
        ACHTUNG: Verwenden Sie eine lange Klemme, um beide Nadeln nach unten zu drücken; Stellen Sie sicher, dass die lange Nadelspitze im Boden der [18F]fluorid-Durchstechflasche sitzt, damit das gesamte [18F]fluorid herausgetragen werden kann. Typischerweise wird ein V-förmiges Fläschchen für die [18F]fluoridabgabe angefordert.
    3. Einfangen, eluieren und azeotrop trocknen [18F]fluorid.
      1. Klicken Sie auf Ar-Versorgung, um die Argonversorgungsleitung einzuschalten, den Argondruck zu erhöhen, die [18F]fluorid-Schiebeleitung einzuschalten und das wässrige [18F]fluorid durch die QMA-Lichtpatrone zu drücken. Nachdem die Radioaktivität in der QMA-Lichtpatrone eingeschlossen ist und der Radioaktivitätsdetektorwert stabil ist, erhöhen Sie den Argondruck und blasen Sie Argon für weitere 5 Minuten durch die Patrone, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
      2. Schalten Sie die [18F]fluorid-Schiebeleitung aus, verringern Sie den Argondruck auf Null, schalten Sie das Zwei-Wege-Ventil mit sechs Anschlüssen von der [18F]fluorid-Einfangposition in die Elutionsposition. Öffnen Sie die Reaktionsdurchstechflasche, schalten Sie die Argonlinie der Eingangs-MVP-Position 1 ein, drücken Sie die K222/K2CO3-Lösung durch die QMA-Lichtkartusche in die Eingangs-MVP-Position 1-Durchstechflasche, um die Radioaktivität in die Reaktionsdurchstechflasche zu eluieren. Schalten Sie die [18F]fluorid-Elutionsposition auf die Fangposition um.
      3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Hitze , um den Reaktor auf 110 °C zu erhitzen, die Argonlinie (Kehrleitung) der Ausgangs-MVP-Position 4 einzuschalten, die mit dem Reaktor verbunden ist, und das Lösungsmittel in die Ausgangsdurchstechflasche der MVP-Position 4 zu verdampfen.
      4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kühlen , um den Reaktor mit komprimiertem Kohlendioxid auf Raumtemperatur abzukühlen, die Kehrleitung auszuschalten, die Eingangs-MVP-Position 1 auf Position 2 zu schalten und das wasserfreie Acetonitril in das Fläschchen 2 zu geben. Schalten Sie die Kehrleitung und die Heizung ein, um [18F]fluorid bei 110 °C azeotrop zu trocknen.
    4. Fügen Sie den radioaktiven Vorläufer hinzu und integrieren Sie [18F]fluorid.
      1. Kühlen Sie den Reaktor auf Raumtemperatur ab, schalten Sie die Kehrleitung aus, schalten Sie die Eingangs-MVP-Position 2 auf Position 3 und fügen Sie den Tosylat-Radiomarkierungsvorläufer in Durchstechflasche 3 hinzu. Schließen Sie den Reaktor und erhitzen Sie die Reaktionsgemische bei 100 °C für 10 min.
    5. Verdampfen Sie das Reaktionslösungsmittel und die Acidolyse.
      1. Kühlen Sie den Reaktor ab und öffnen Sie ihn, schalten Sie die Kehrleitung ein und verdampfen Sie das Reaktionslösungsmittel bei 100 °C.
      2. Kühlen Sie den Reaktor ab, schalten Sie die Kehrleitung aus, schalten Sie die Eingangs-MVP-Position 3 auf Position 4 und fügen Sie das Salzsäure / Acetonitril-Gemisch (0,5 ml, 1/1, v / v) hinzu. Erhitzen Sie die Reaktion bei 100 °C für 10 Minuten, um die tert-butyl- und tert-butyloxycarbonyl-schützenden Gruppen im radioaktiven Vorläufer zu entschützen.
    6. Neutralisieren Sie die Reaktion.
      1. Kühlen Sie den Reaktor auf Raumtemperatur ab und schalten Sie die Eingangs-MVP-Position 4 auf Position 5, um 2 M Natriumhydroxid hinzuzufügen, um das Reaktionsgemisch zu neutralisieren. Deaktivieren Sie die Eingabe-MVP-Argon-Zeile.
    7. Überführen Sie das Reaktionsgemisch in die Durchstechflasche mit Zwischendurchstechflasche.
      1. Klicken Sie im Ausgangs-MVP auf die Taste F, um das Ausgangs-MVP von der Entlüftungsposition 4 auf Position 5 umzuschalten , und klicken Sie dann auf die Schaltfläche F im Eingangs-MVP, um das Eingangs-MVP von Position 5 auf Position 6 umzuschalten. Aktivieren Sie die Ausgabe-MVP-Argonlinie. Drücken Sie die Reaktionsmischung durch die gestapelten neutralen Aluminiumoxid- und C8-Kartuschen zu der vor der HPLC-Probenschleife installierten Zwischendurchstechflasche.
    8. Spülen Sie den Reaktor aus und geben Sie die Lösung ab.
      1. Schalten Sie die Ausgangs-MVP-Position 5 auf Position 6, drücken Sie die Spüllösung in der Durchstechflasche der Ausgangs-MVP-Position 6 nacheinander durch die Reaktionsdurchstechflasche und die Kartuschen auf die Zwischendurchstechflasche. Beachten Sie, dass das Volumen der kombinierten Mischung ungefähr 3,5 ml beträgt. Schließen Sie das Reaktionsgefäß.
    9. Laden Sie die kombinierte Mischung in den HPLC-Kreislauf und reinigen Sie die Mischung.
      1. Schalten Sie die HPLC-Schleife von der Einspritzposition in die Lastposition, schalten Sie die Eingangs-MVP-Argonlinie ein und laden Sie die Mischungen in die 5-ml-HPLC-Schleife. Wenn die Last abgeschlossen ist, schalten Sie die Lasttaste auf Inject und klicken Sie auf Inject HPLC, um das HPLC-Chromatogramm mit einer Durchflussrate von 3 ml / min zu starten. Klicken Sie auf die Schaltfläche HPLC-Monitor, um auf das Echtzeit-HPLC-Chromatogramm zuzugreifen.
    10. Umleiten des Zielbruchs in die C18-Spalte.
      1. Klicken Sie auf die Umleitungs-MVP-Schaltfläche , um den HPLC-Anteil des Ziels nach ca. 12 min auf die kurze C18-Spalte umzuleiten.
    11. Spülen Sie die chirale HPLC-Säule und reinigen Sie den Anteil in der C18-Säule.
      1. Nachdem die Zielradioaktivität in der C18-Säule gesammelt wurde (und die mobile HPLC-Phase in die Abfallflasche der Formulierungs-MVP-Position 1 übergeht), schalten Sie das zweipolige Umleitungsventil mit vier Anschlüssen auf die Abfallsammelposition. Spülen Sie die chirale Säule 6 Minuten lang bei 4 ml/min, um das kleinere D-[18F]FETrp-Enantiomer und andere ultraviolette (UV) Verunreinigungen zu entfernen.
      2. Klicken Sie auf die Umleitungs-MVP-Schaltfläche, um die mobile HPLC-Phase mit einer Durchflussrate von 3 ml/min zurück zur MVP-Position 1 der Formulierung zu leiten. Beachten Sie, dass die mobile Phase durch die chirale Säule und die C18-Säule verläuft, um L-[18F]FETrp zu reinigen, das in der C18-Spalte zurückgehalten wird.
    12. Sammeln Sie den Zielbruchteil.
      1. Sammeln Sie das Eluent bei ca. 32-34 min in der Formulierung MVP Position 2 Durchstechflasche.
        HINWEIS: Typischerweise wird eine 2-minütige HPLC-Fraktion gesammelt, und das Gesamtvolumen plus der vorgefüllten Natriumchloridlösung beträgt 8-15 ml.
    13. Geben Sie die Dosis an eine sterile Durchstechflasche für das Endprodukt ab.
      1. Schieben Sie die Lösung in der Durchstechflasche mit der Formulierung MVP Position 2 durch die Verabreichungslinie und den Sterilfilter in die Durchstechflasche mit der endgültigen Dosis (über die vorinstallierte sterile Entlüftungsfilternadel).
        HINWEIS: Die Protokollschritte 2.2.9-2.2.13 sind Schritte, die für die HPLC-Reinigung von L-[18F]FETrp verwendet werden.
    14. Untersuchen Sie die Radioaktivität und das Dosisvolumen.
      1. Entfernen Sie den Sterilfilter und untersuchen Sie die endgültige Dosisaktivität und das Volumen.
      2. Spülen Sie das System mit Reinstwasser, gefolgt von Ethanol mit 4 ml / min für jeweils mindestens 15 Minuten. Schalten Sie die HPLC-Pumpe und die SPS-Box aus. Schließen Sie das Programm; Schalten Sie die Druckluftleitung, die Argonlinie und die Kohlendioxidleitung ab; und schalten Sie die Hauptstromversorgung des Moduls aus.
    15. Entnehmen Sie die QC-Dosis und führen Sie die QC-Proben aus.
      1. Etwa 0,1 ml der Enddosis werden in einen 0,2 ml Einsatz einer QC-Durchstechflasche entnommen. Führen Sie das Hot-Sample als "Partialsequenz"-Programm nach dem in Schritt 1.2.6 beschriebenen Systemeignungstest aus.
    16. Analysieren Sie die QC-Daten und geben Sie die Dosis frei.
      1. Berechnen Sie die chemischen und radiochemischen Reinheiten, den enantiomeren Überschusswert und die molare Aktivität; den pH-Wert bestimmen.
      2. Geben Sie die Dosis ab, wenn alle Testergebnisse den akzeptablen Bereich überschreiten.

3. Nach der Ausführung des Systems sauber

  1. Untersuchen Sie das Radiomarkierungsmodul mit einem Geiger-Mueller (GM) Survey-Meter, um sicherzustellen, dass die Radioaktivität vor der Systemreinigung ausreichend zerfallen ist (mindestens 24 h).
  2. Schalten Sie die Stromversorgung des Radiomarkierungsmoduls und die Stromversorgung der SPS-Box ein. das Programm des radiochemischen Synthesesystems aktivieren; und initialisieren Sie das Eingabe-MVP, das Ausgabe-MVP und das Formulierungs-MVP. Schalten Sie den Spaltenwähler auf die Bypass-Position.
  3. Trennen Sie die QMA-Licht-, Aluminiumoxid- und C8-Patronen.
  4. Spülen Sie zuerst alle Fläschchen und Linien mit Reinstwasser, gefolgt von Ethanol. Trocknen Sie die Fläschchen und Linien mit hochreinem Argon.
  5. Verschließen Sie jede Leitungsentlüftung mit einer sterilen Nadel mit einer Kappe. Ersetzen Sie die Reagenzfläschchen und das Reaktionsgefäß durch im Ofen gebrannte Durchstechflaschen bzw. Reaktionsgefäße.
  6. Schalten Sie die HPLC-Pumpe und die SPS-Box aus. Schließen Sie das Programm; Schalten Sie die Druckluftleitung, die Argonlinie und die Kohlendioxidleitung ab; und schalten Sie die Hauptstromversorgung des Moduls aus.

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Ergebnisse

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Das Reaktionsschema ist in Abbildung 1 dargestellt. Die radioaktive Markierung umfasst die folgenden zwei Schritte: 1) Die Reaktion des Tosylat-Radiomarkierungsvorläufers mit [18F]fluorid liefert das 18F-markierte Zwischenprodukt und 2) die Detektion der tert-Butyloxycarbonyl- und tert-Butyl-schützenden Gruppen im Zwischenprodukt bietet das Endprodukt L-[18F]FETrp. Beide Reaktionsschritte setzen sich bei 100 °C für 10 min fort.

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Diskussion

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Tryptophan ist eine essentielle Aminosäure für den Menschen. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung von Stimmung, kognitiver Funktion und Verhalten. Radioaktiv markierte Tryptophanderivate, insbesondere das Kohlenstoff-11-markierte [11C]AMT, wurden aufgrund ihrer einzigartigen Rolle bei der Kartierung der Serotoninsynthese38,39, der Erkennung und Einstufung von Tumoren40, der Steuerung der Epilepsiechirurgie41,42 und der Bewertung des Behandlungsansprechens bei

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom Diagnostic & Research PET/MRT Center und von den Abteilungen für Biomedizinische Forschung und Radiologie am Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
[18F]Fluorid in [18O]H2OPETNET Solutions Inc.N/A
4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosanACROS291950010Kryptofix 222 oder K222, 98%
EssigsäureACROS22214250099,8%
AcetonitrilSigma-Aldrich271004wasserfrei, 99,8
Agilent 1260 HPLC-SystemAgilent TechnologiesAgilent 1260Agilent 1260 Serie
Analytische chirale HPLC-SäuleSigma-Aldrich12024ASTAstec CHIROBIOTIC T, 25 cm & 4,6 mm
Kohlendioxid, 60 lbsAirgasREFR744R200S99,99%
D-FETrp StandardreferenzAffinity Research Chemicals IncN/AKundenspezifische Synthese
Leeres steriles FläschchenJubilant HollisterStier751520 mm Verschluss, 10 mL
EthanolDecon Labs2716200 Polierte Platte, USP-Güte. ≥ 99,9%
Fisherbrand 13 mm Spritzenvorsatzfilter, 0,22 & Mikro; m, PVDF, sterilFisher Scientific09-720-3
SalzsäureSigma-Aldrich30721≥ 37%
IsopropanolDecon Labs831670%, steril
L-[18F]FETrp Vorläufer für die RadiomarkierungAffinity Research Chemicals IncN/AKundenspezifische Synthese
L-FETrp StandardreferenzAffinity Research Chemicals IncN/AKundenspezifische Synthese
Light C8 KartuscheWasserWAT036770Sep-Pak  C8 plus Light Patrone
Nadel, 20 G x 1Becton-Dickinson & Co.
Nadel, 20 G x 1 & frac12;Becton-Dickinson & Co.
Nadel, 21 g x 2Becton-Dickinson & Co.
Neutrales AluminiumoxidWatersWAT023561Sep-Pak Aluminiumoxid N plus leichte
Nylonmembran (0,20 µ m )MilliPoreGNWP0470047 mm
Pall Acrodisc 25 mm Spritzen-SterilfilterPall Corporation4907
PETCHEM Radiochemie-SynthesesystemPETCHEM Solutions Inc. Pinckney, MIN/ARadiosynthesizer
pH-Streifen 2,0 - 9,0EMD Millipore1,09584,0001
KaliumcarbonatSigma-Aldrich36787799.995
Quartäre Methylammonium-Light-KartuscheWaters186004051Sep-Pak QMA light
Semi-präparative C18 HPLC-SäulePhenomenex00D-4253-N0100 & 10 mm
Semi-präparative chirale HPLC-SäuleSigma-Aldrich12034ASTAstec CHIROBIOTIC T, 25 cm & 10 mm
Natriumchlorid-Injektion 23,4%APP Pharmaceutical, LLC18730in USP-Qualität
0,9 %HospiraNDC 0409-4888-10in USP-Qualität
Honeywell30657699,99 %
Spinalnadel, 20 G x 3 ½Becton-Dickinson & Co.
Sterile Alkohol-VorbereitungspadsBioMed Resource Inc.PC661
Sterile leere Fläschchen, 2 mLHollister Stier7505ZA13 mm
Verschluss Sterile leere Fläschchen, 30 mLJubilant HollisterStier7520ZA20 mm
Verschlussspritze PP/PE, 3 mL, Luer LockAir-Tite4020-X00V0
Spritze PP/PE, 5 mL, Luer LockBecton-Dickinson & Co.
Spritze  PP/PE, 10 mL, NORM-JECTAir-Tite4100-000V0
Spritze, 1 mL, Luer SlipBecton-Dickinson & Co.
Spritze, 3 mL, Luer-LockBecton-Dickinson & Co.
Ultrahochreines ArgonAirgasAR UHP30099,999%
ReinstwasserMilliporeSigmaZRQSVP300Direct-Q 3 zapft ein Rein- und Reinstwasser-Reinigungssystem an
%305175305176305129% Natriumchlorid-Injektion Natriumhydroxid 405182309646 KG309659309657

Referenzen

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