Methodenartikel

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

DOI:

10.3791/63045

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24. September 2021

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1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, 5Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die hier vorgestellte Methode fasst optimierte Protokolle zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen (HSPCs) der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator zusammen, um die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von HSPCs in Echtzeit zu messen.

Zusammenfassung

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Im stationären Zustand bleiben hämatopoetische Stammzellen (HSCs) weitgehend ruhig und es wird angenommen, dass sie überwiegend auf Glykolyse angewiesen sind, um ihren energetischen Bedarf zu decken. Unter Stressbedingungen wie Infektionen oder Blutverlust werden HSCs jedoch proliferativ und produzieren schnell nachgeschaltete Vorläuferzellen, die sich wiederum weiter differenzieren und schließlich reife Blutzellen produzieren. Während dieses Übergangs- und Differenzierungsprozesses verlassen HSCs die Ruhephase und durchlaufen schnell einen metabolischen Wechsel von der Glykolyse zur oxidativen Phosphorylierung (OxPHOS). Verschiedene Stresszustände wie Alterung, Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit können sich negativ auf die mitochondriale Funktion auswirken und somit die metabolische Reprogrammierung und Differenzierung von HSCs und Vorläufern während der Hämatopoese verändern. Wertvolle Einblicke in die glykolytischen und mitochondrialen Funktionen von HSCs und Vorläufern unter Normal- und Stressbedingungen können durch die Beurteilung ihrer extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) und Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gewonnen werden, die Indikatoren für die zelluläre Glykolyse bzw. die mitochondriale Atmung sind.

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Messung von ECAR und OCR in Mausknochenmark-abgeleiteten liniennegativen Zellpopulationen bereitgestellt, die sowohl hämatopoetische Stamm- als auch primitive Vorläuferzellen (HSPCs) umfassen, mit dem extrazellulären Flussanalysator. Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Isolierung von liniennegativen Zellen aus dem Knochenmark der Maus, erklärt die Optimierung der Zellaussaatdichte und der Konzentrationen von 2-Desoxy-D-Glukose (2-DG, ein Glukoseanalogon, das die Glykolyse hemmt) und verschiedener OxPHOS-zielgerichteter Medikamente (Oligomycin, FCCP, Rotenon und Antimycin A), die in diesen Assays verwendet werden, und beschreibt medikamentöse Behandlungsstrategien. Schlüsselparameter des glykolytischen Flusses, wie Glykolyse, glykolytische Kapazität und glykolytische Reserve, und OxPHOS-Parameter wie Basalatmung, maximale Atmung, Protonenleck, ATP-Produktion, freie Atemkapazität und Kopplungseffizienz können in diesen Assays gemessen werden. Dieses Protokoll ermöglicht ECAR- und OCR-Messungen an nicht adhärenten HSPCs und kann verallgemeinert werden, um die Analysebedingungen für jede Art von Suspensionszellen zu optimieren.

Einleitung

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Hämatopoese ist der Prozess, bei dem verschiedene Arten von reifen Blutzellen mit hochspezialisierten Funktionen aus HSCs1 gebildet werden. HSCs sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und in verschiedene multipotente und linienspezifische Vorläuferpopulationen zu differenzieren. Diese Vorläufer produzieren letztendlich Zellen von lymphatischen, myeloischen, erythroiden und Megakaryozytenlinien. Um ihre Selbsterneuerungskapazität aufrechtzuerhalten, bleiben HSCs weitgehend ruhig und es wird angenommen, dass sie, wie andere Gewebestammzellen, auf Glykolyse und nicht auf mitochondriales OxPHOS für die ATP-Produktion angewiesen sind

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Protokoll

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Alle Tierversuche mit Wirbeltieren wurden von den Vorschriften des Ausschusses für die Verwendung und Pflege von Tieren der University of Michigan genehmigt und in Übereinstimmung mit diesen durchgeführt.

1. Tag vor dem Assay (Gesamtzeit: ~10 min)

  1. Hydratation der Sensorkartusche (Schrittzeit: ~10 min)
    1. Öffnen Sie das extrazelluläre Flux-Assay-Kit, und entfernen Sie die Sensorkassette und die Utility-Plate-Baugruppe. Speichern Sie Ladehilfswohnungen für die Verwendung am nächsten Tag.
    2. Trennen Sie die Sensorkassette (den oberen grünen Teil mit Deckel) manuell von der Utility-Platte (untere 96-Well-Mikroplatte) und ....

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Ergebnisse

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Mit diesem Protokoll wurden die Zellzahl und die Konzentrationen verschiedener OxPHOS-Targeting-Medikamente (die in den extrazellulären Flussassays verwendet werden) optimiert, um ECAR und OCR von HSPCs zu messen, die aus 24 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen isoliert wurden. Zunächst wurde der Glykolyse-Stresstest durchgeführt, um die Zellzahl und die Oligomycinkonzentration zu optimieren. In diesem Assay wurde eine unterschiedliche Anzahl von HSPCs pro Bohrloch im Bereich von 5 × 104 bis 2,5 × 105

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Diskussion

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Diese Methodenarbeit beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik (Glykolyse und OxPHOS) in Maus-HSPCs mit dem extrazellulären Flussanalysator Seahorse. Dieses Gerät ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das gleichzeitig die ECAR und OCR lebender Zellen misst, bei denen es sich um Metriken der Glykolyse bzw. der mitochondrialen Atmung handelt. So kann es verwendet werden, um die zelluläre Bioenergetik in Echtzeit zu beurteilen. Darüber hinaus bietet die 96-Well-Microplate-basierte Plattfo.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt vorliegt.

Danksagungen

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Die Arbeit im lombardischen Labor wird vom NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 und ME200030) und der Glenn Foundation for Medical Research unterstützt. Die Arbeit im Li-Labor wird vom NIH (NHLBI 5R01HL150707) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 μ m FilterCorning430626Wird zum Filtrieren und Sterilisieren des Assay-Mediums
verwendet 100 mM NatriumpyruvatLife Technologies11360-070Bestandteil des mitochondrialen Stresstest-Assay-Mediums
15 mL konische Falcon-RöhrchenCorning352096Wird während der HSPC-Ernte und zur Herstellung von Assay-Wirkstofflösungen
verwendet 200 mM L-GlutaminLife Technologies25030-081Bestandteil des Glykolyse-Stresstests und des mitochondrialen Stresstests Assay-Medien
2-Desoxy-D-Glukose (2-DG)Sigma-AldrichD83753. Medikamenteninjektion während des Glykolyse-Stresstests
5x Anreicherungspuffer (MojoSort)Biolegend480017Wird für Waschungen während der HSPC-Ernte verwendet
Ammoniumchlorid (NH4Cl)Fisher ScientificA661-3Bestandteil der ACK-Lyse Puffer
Antimycin ASigma-AldrichA86743. Medikamenteninjektion während des mitochondrialen Stresstests
Bio-Rad DC Protein Assay KitBio-Rad500-0112Wird gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet
Carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP)Sigma-AldrichC29202. Arzneimittelinjektion während des mitochondrialen Stresstests
Cell-TakCorning354240Zellkleber. Wird zur Beschichtung von Zell-Mikrotiterplatten
verwendet Countes 3 Automatisierter ZellzählerThermoFisher ScientificFür die Zellzählung
EDTAFisher ScientificO2793-500Komponente des ACK-Lysepuffers und des RIPA-Lysepuffers
Falcon 70 μ m FilterFisher Scientific08-771-2Wird als Zellsieb während der HSPC-Ernte
verwendet Gibco Fötales Rinderserum (FBS)Fisher Scientific26400044Wird zur Herstellung von Assay-Puffer während der HSPC-Ernte
verwendet Gibco HBSSFisher Scientific14175095Wird zur Herstellung von Assay-Puffer während der HSPC-Ernte
GlucoseSigma-AldrichG7528Bestandteil des mitochondrialen Stresstest-Assay-Mediums und der ersten Injektion des Glykolyse-Stresstests
OligomycinSigma-AldrichO48762. Arzneimittelinjektion während des Glykolyse-Stresstests und 1. Arzneimittelinjektion während des mitochondrialen Stresstests
PBSLife Technologies10010-049Wird zum Waschen von Zellen nach dem Assay zur Proteinquantifizierung
verwendet Kaliumbicarbonat (KHCO3)Fisher ScientificP235-500Bestandteil des ACK-Lysepuffers
Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC)Roche11836170001Lieferung in Form von Tabletten. Eine Tablette wurde in 10 ml RIPA-Puffer aufgelöst, um 1x PIC herzustellen.
Ratten-Biotin Antimaus-B220, Klon-ID: RA3-6B2Biolegend103203Wird für die Abstammungsdepletion während der HSPC-Ernte
Ratten-Biotin Antimaus-CD2, Klon-ID: RM2-5Biolegend100103Wird für die Abstammungsdepletion während der HSPC-Ernte
Ratten-Biotin Antimaus-CD3, Klon-ID: 17A2Biolegend100243Wird für die Abstammungsdepletion während der HSPC-Ernte
Rattenbiotin Antimaus-CD5, Klon ID: 53-7.3Biolegend100603Wird für die Erschöpfung der Abstammungslinie während der HSPC-Entnahme
Ratten-Biotin Antimaus-CD8, Klon-ID: 53-6.7Biolegend100703Wird für die Abstammungsarmierung während der HSPC-Entnahme verwendet Ratten-Biotin
Antimaus-Gr-1, Klon-ID: RB6-8C5Biolegend108403Wird für die Abstammungsarmierung während der HSPC-Ernte
Ratten-Biotin Antimaus-Ter-119, Klon-ID: TER-119Biolegend116203Wird für die Erschöpfung der Abstammungslinie während der HSPC-Ernte verwendet
RotenonSigma-AldrichR88753. Arzneimittelinjektion während des mitochondrialen Stresstests
Seahorse XFe96 extrazellulärer FlussanalysatorSeahorse Biosciences jetzt AgilentFür ECAR- und OCR-Messungen in Echtzeit.
NatriumbicarbonatSigma-AldrichS5761Wird zur Herstellung von Zelladhäsivlösung für die Beschichtung von Mikrotiterplatten
verwendet Natriumchlorid (NaCl)FisherBP358Bestandteil des RIPA-Lysepuffers
NatriumdesoxycholatSigma-AldrichD6750Bestandteil des RIPA-Lysepuffers
Natriumfluorid (NaF)Sigma-AldrichS7920Bestandteil des RIPA-Lysepuffers
Natriumhydroxid (NaOH)Sigma-AldrichS8045Hergestellte 1 N Lösung. Wird zur pH-Normalisierung
verwendet Streptavidin-Nanobeads (MojoSort)Biolegend480015Wird für die Erschöpfung der Abstammungslinie während der HSPC-Ernte verwendet
Tris-HClFisherBP153Bestandteil des RIPA-Lysepuffers
XF-BasismediumAgilent102353-100Basismedium zur Herstellung von Glykolyse-Stresstests und mitochondrialen Stresstest-Assaymedien
XF-VorbereitungsstationSeepferdchen BiowissenschaftenWird für Nicht-CO2 37 ° C-Inkubationen
XFe96 extrazelluläres FluxPakAgilent102416-100 oder 102601-100Enthält Assay-Kartuschen mit Utility-Platten, Ladeleitflächen zum Laden von
Medikamenten auf die Assay-Kartusche, XF-Kalibrierlösung und XF-Zellkultur-Mikrotiterplatte
verwendet verwendet verwendet verwendet verwendet verwendet

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250(2012).
  2. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019

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Schlagwörter

H matopoetische StammzellenBewertung der Glykolyseoxidative PhosphorylierungSauerstoffverbrauchsrateextrazellul re Ans uerungsratemitochondrialer StresstestGlykolyse Stresstest

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