Methodenartikel

Immunpeptidomik: Isolierung von Maus- und humanen MHC-Klasse-I- und II-assoziierten Peptiden für die Massenspektrometrie-Analyse

DOI:

10.3791/63052

⸱

15. Oktober 2021

 ,  ,  ,  , 
1CHU Sainte-Justine Research Center, 2Department of Pathology and Cellular Biology, Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Aufreinigung von MHC-Klasse-I- und Klasse-II-Peptidkomplexen aus Maus- und humanen Zelllinien vor, das qualitativ hochwertige Immunopeptidomik-Daten liefert. Das Protokoll konzentriert sich auf die Probenvorbereitung unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper.

Zusammenfassung

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Die Immunpeptidomik ist ein aufstrebendes Gebiet, das die Entwicklung von Impfstoffen und Immuntherapien vorantreibt und leitet. Genauer gesagt bezieht es sich auf die Wissenschaft der Untersuchung der Zusammensetzung von Peptiden, die von Major Histocompatibility Complex (MHC) Klasse I und Klasse II Molekülen unter Verwendung von Massenspektrometrie (MS) Technologieplattformen präsentiert werden. Unter allen Schritten in einem MS-basierten Immunopeptidomics-Workflow ist die Probenvorbereitung von entscheidender Bedeutung für die Erfassung hochwertiger Daten von therapeutischer Relevanz. Hier werden Schritt-für-Schritt-Anweisungen beschrieben, um MHC-Klasse-I- und II-assoziierte Peptide durch Immunoaffinitätsreinigung aus Qualitätskontrollproben, aus Maus- (EL4 und A20) und humanen (JY) Zelllinien genauer zu isolieren. Die verschiedenen Reagenzien und spezifischen Antikörper werden ausführlich beschrieben, um MHC-assoziierte Peptide aus diesen Zelllinien zu isolieren, einschließlich der Schritte zur Überprüfung der Perlenbindungseffizienz des Antikörpers und der Elutionseffizienz der MHC-Peptidkomplexe aus den Kügelchen. Das Protokoll kann verwendet werden, um einen Immunopeptidomics-Workflow zu etablieren und zu standardisieren sowie neue Protokolle zu benchmarken. Darüber hinaus stellt das Protokoll einen guten Ausgangspunkt für alle Nicht-Experten dar und fördert die Reproduzierbarkeit des Probenvorbereitungsverfahrens innerhalb und zwischen laborintern in der Immunpeptidomik.

Einleitung

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In den letzten zehn Jahren hat das Interesse an der Erforschung des Repertoires von MHC-assoziierten Peptiden den akademischen Sektor übertroffen und die Biotech- und Pharmaindustrie erreicht. Tatsächlich stellt die Entdeckung verwertbarer tumorspezifischer Neoantigene bei Krebs einen wichtigen Forschungsschwerpunkt im Industriesektor dar, um klinische Immuntherapien zu entwickeln, die zu einer personalisierten Onkologie führen1,2,3. Grundsätzlich werden MHC-assoziierte Peptide im gesamten Körper präsentiert, spiegeln das intrazelluläre Stadium der Zelle wider und sind bei verschiedenen Krankheitszuständen wie Autoimmunität, Transplantation, Infektionskrankheiten, Entzündungen, Krebs und Allergien von Bedeutung1,4. Daher sind MHC-assoziierte Peptide oder humane Leukozytenantigen (HLA) -Liganden beim Menschen von großem medizinischem Interesse und werden zusammenfassend als Immunpeptidom5 bezeichnet.

MS ist ein leistungsfähiger analytischer Ansatz zur Charakterisierung des Immunpeptidoms6,7, einschließlich der Entdeckung tumorspezifischer Neoantigene8,9,10,11. Ein typischer Arbeitsablauf zur Durchführung eines Immunpeptidomik-Experiments umfasst drei Hauptschritte: 1) Probenvorbereitung für die Isolierung von MHC-assoziierten Peptiden, 2) Datenerfassung durch MS und 3) Datenanalyse mit verschiedenen Computer-Software-Tools12. Die Generierung von qualitativ hochwertigen Proben, die in diesem visualisierten Protokoll beschrieben werden, ist entscheidend für den Erfolg jedes Projekts in der MS-basierten Immunpeptidomik. Das unten beschriebene Protokoll konzentriert sich auf die Isolierung von MHC-Klasse-I- und II-assoziierten Peptiden aus etablierten Zelllinien, die zur Generierung hochwertiger Immunopeptidomik-Daten geeignet sind. Repräsentative Ergebnisse aus diesen Zelllinien sind im aktuellen Protokoll dargestellt.

Protokoll

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Das hier bereitgestellte Protokoll wurde von den etablierten Protokollen 13,14,15,16,17,18,19,20 übernommen. Das Gesamtverfahren zur Immunoaffinitätsreinigung (IP) von MHC-Peptiden der Klassen I und II ist in Abbildung 1 dargestellt. Siehe Tabelle der Materialien für Details über die verwendeten Zelllinien und Antikörper.

1. Perlenkopplung mit den Antikörpern (Tag 1): Kopplung von Antikörpern an Sepharose CNBr-aktivierte Kügelchen

HINWEIS: Bereiten Sie für jedes neue Experiment neue Lösungen vor. Die Liste der Reagenzien und Lösungsrezepte finden Sie in der Materialtabelle und in der ergänzenden Tabelle 1 . Alle Schritte werden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Wenn Sie einen neuen Antikörper verwenden, überprüfen Sie die Bindungseffizienz, indem Sie wichtige Aliquots sammeln (siehe Indikation OPTIONAL) und Coomassie Blue Staining SDS-PAGE durchführen (Abbildung 2).

  1. Aktivierung der Sepharose CNBr Perlen
    1. 80 mg Sepharose-CNBr-aktivierte Kügelchen pro Probe einwiegen und in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführen.
    2. Um die Wiederverwendung von getrockneten Perlen zu erleichtern, fügen Sie zuerst 5 ml 1 mM HCl hinzu und pipettieren Sie 5 Mal auf und ab. Füllen Sie dann das konische Rohr mit zusätzlichen 8,5 ml 1 mM HCl.
    3. Drehen Sie mit 20 U / min (Umdrehungen pro Minute) für 30 minuten bei RT mit einem Rotatorgerät. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 200 x g für 2 min bei RT und entfernen Sie den Überstand durch Absaugen.
    4. 500 μL Koppelpuffer in das Perlenpellet geben und in ein neues 2,0 ml Zentrifugenröhrchen geben und für Schritt 1.2.2 beiseite legen.
  2. Kopplung von Antikörpern an CNBr-aktivierte Kügelchen
    1. Den für die Isolierung der MHC-Klasse-I- oder -II-Peptide ausgewählten Antikörper in einem neuen 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 2 mg des Antikörpers (entsprechend der vom Hersteller angegebenen Konzentration) herstellen. Vervollständigen Sie das Volumen auf 1 ml mit der Kopplungspufferlösung, um eine Endkonzentration von 2 mg / ml zu erhalten.
    2. Zentrifugieren Sie die Perlen aus Schritt 1.1.4 bei 200 x g für 2 min bei RT und entfernen Sie dann den Überstand durch Ansaugen.
    3. Geben Sie die Antikörperlösung in das 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das die aktivierten Kügelchen enthält.
    4. (OPTIONAL) Nehmen Sie ein Aliquot von 18 μL (INPUT), fügen Sie 6 μL 4x SDS-PAGE Puffer hinzu und frieren Sie sofort ein.
    5. Drehen Sie das Mikrozentrifugenrohr von Schritt 1.2.3 bei 20 U / min für 120 min mit einer Rotatorvorrichtung. Die Perlen bei 200 x g für 2 min zentrifugieren und dann den Überstand entfernen.
    6. (OPTIONAL) Nehmen Sie ein Aliquot von 18 μL des Überstandes (ungebundener Antikörper), fügen Sie 6 μL 4x SDS-PAGE-Puffer hinzu und frieren Sie sofort ein.
  3. Blockieren und Waschen von Antikörper-gekoppelten Kügelchen
    1. Dem Mikrozentrifugenröhrchen, das die Antikörper-gekoppelten Kügelchen aus Schritt 1.2.5 enthält, 1 ml 0,2 M Glycin zuzusetzen. Drehen Sie mit 20 U / min für 60 min bei RT mit einem Rotatorgerät.
    2. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 200 x g für 2 min und entfernen Sie dann den Überstand. Fügen Sie 1 ml PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) hinzu.
    3. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 200 x g für 2 min und entfernen Sie dann den Überstand.
    4. (OPTIONAL) Nehmen Sie ein Aliquot von 18 μL des Überstands (ungebundener Antikörper, letzte Wäsche), fügen Sie 6 μL 4x SDS-PAGE-Puffer hinzu und frieren Sie sofort ein.
    5. Fügen Sie den Perlen in Schritt 1.3.3 1 ml PBS hinzu.
    6. (OPTIONAL) Nehmen Sie ein Aliquot von 18 μL Perlenmischung (Perlen gekoppelt mit Antikörper), fügen Sie 6 μL 4x SDS-PAGE-Puffer hinzu und frieren Sie sofort ein.
    7. Bei 4 °C aufbewahren, bis sie am selben Tag in Schritt 2.5 verwendet werden.
      HINWEIS: Perlen können am Tag vor der Immunkapselung zubereitet werden, aber eine längere Lagerung wurde nicht getestet.

2. Zelllyse und Immunkapselung mit Antikörper-gekoppelten Kügelchen (Tag 1)

HINWEIS: Das Niveau der MHC-Moleküle variiert von Zelltyp zu Zelltyp, und die Quantifizierung von MHC/HLA-Molekülen pro Zelle wird vorgeschlagen21 (Abbildung 4A). Wir empfehlen mindestens 1 x 108 Zellen für jede IP. Diese Anzahl von Zellen entspricht 6-10 mg Protein aus JY-, EL4- und A20-Zellen, die mit 0,5% Chaps-Puffer gelöst sind. Um Zellpellets für IPs vorzubereiten, sollten Zellen geerntet, zentrifugiert und zweimal mit 5 ml PBS gewaschen werden. Dann können Zellpellets in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen oder einem 15 mL konischen Rohr bei -80 °C bis zum Zeitpunkt der IP gelagert werden. Beachten Sie, dass IPs auf frisch geernteten oder gefrorenen Zellpellets durchgeführt werden können.

  1. Um MHC-Peptide der Klasse I oder II zu isolieren, tauen Sie ein gefrorenes Pellet von 1 x 108 Zellen auf, indem Sie den Boden der Röhre mit der Handfläche erwärmen. 500 μL PBS in das Pellet geben und auf und ab pipettieren, bis die Suspension homogen ist.
    HINWEIS: Je nach Zelltyp kann das Zellpelletvolumen stark variieren. Wenn 500 μL PBS nicht ausreichen, um das Zellpellet aufzulösen, verwenden Sie mehr PBS, bis sich die Zellen beim Pipettieren auf und ab leicht disaggregieren.
  2. Messen Sie das Gesamtvolumen des in PBS resuspendierten Pellets und übertragen Sie in ein neues Röhrchen 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Bei Bedarf in weitere Röhren aufteilen.
  3. Fügen Sie ein Volumen des Zelllysepuffers hinzu (1% Chaps-Puffer in PBS, das Proteaseinhibitoren enthält, 1 Pellet / 10 ml Puffer), das dem Volumen des in PBS resuspendierten Zellpellets entspricht, das im vorherigen Schritt gemessen wurde. Die Endkonzentration des Lysepuffers beträgt 0,5% Chaps.
  4. Drehen Sie mit 10 U / min für 60 min bei 4 ° C mit einer Rotatorvorrichtung. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 18.000 x g für 20 min bei 4 °C mit Vollbremse und übertragen Sie den Überstand (der die MHC-Peptidkomplexe enthält) in ein neues 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  5. Gewinnen Sie die Antikörper-gekoppelten Kügelchen aus Schritt 1.3.7 durch Zentrifugation bei 200 x g für 2 min zurück und entfernen Sie den Überstand.
  6. Den Zelllysatüberstand in Schritt 2.4 auf die Antikörper-gekoppelten Kügelchen übertragen und mit Rotation (10 U/min) für 14-18 h (über Nacht) bei 4 °C mit einer Rotatorvorrichtung inkubieren.

3. Elution von MHC-Peptiden (Tag 2)

HINWEIS: Die Polypropylensäule ermöglicht die Elution von MHC-Peptidkomplexen, während die Kügelchen in der Säule verbleiben. Um den Anteil der MHC-Peptidkomplexe, die vor und nach der sauren Elution mit 1% TFA (Trifluoressigsäure) an die Kügelchen gebunden sind, zu bewerten, ist es möglich, einen Western Blot mit Aliquots durchzuführen, der in wichtigen Schritten während des Protokolls eingenommen wird (siehe Indikation OPTIONAL). Western Blotting in Abbildung 3 zeigt die Anreicherung von MHC-Peptidkomplexen nach saurer Elution mit 1% TFA. Das Fehlen eines Signals in diesem Bruchteil würde darauf hindeuten, dass der Elutionsschritt nicht erfolgreich war. Es ist zu beachten, dass der Anteil der ungebundenen MHC-Peptidkomplexe an den Kügelchen auch parallel durch Western Blotting mit einem in Schritt 3.1.6 beschriebenen Aliquot bewertet werden kann.

  1. Elution von MHC-Peptidkomplexen aus den Antikörper-gekoppelten Kügelchen
    1. Entfernen Sie den unteren Deckel der Polypropylensäule, legen Sie die Säule auf das Polypropylen-Säulengestell und installieren Sie einen leeren Behälter darunter, um den Durchfluss zu sammeln.
      HINWEIS: Eine Spalte pro Probe ist erforderlich.
    2. Spülen Sie die Polypropylensäule mit 10 ml Puffer A ab und lassen Sie sie durch Schwerkraft abfließen. Wenn die Fließgeschwindigkeit der flüssigen Elution zu langsam ist, schneiden Sie die untere Spitze der Polypropylensäule weiter ab.
    3. Das Perlen-Lysat-Gemisch (~2 ml) aus Schritt 2.5 wird gemessen, gesammelt und in die Polypropylensäule überführt.
    4. (OPTIONAL) Nehmen Sie ein Aliquot von 20 μL (oder 1/100 aus dem Gesamtvolumen) für das Western Blotting und frieren Sie es sofort ein. Diese Fraktion entspricht der Summe der mit den Kügelchen inkubierten MHC-Peptidkomplexe.
    5. Lassen Sie das flüssige Gemisch durch Schwerkraft eluieren.
    6. (OPTIONAL) Sammeln und messen Sie den Durchfluss und nehmen Sie ein Aliquot von 20 μL (oder 1/100 aus dem Gesamtvolumen) für das Western Blotting und frieren Sie sofort ein. Diese Fraktion stellt die verbleibenden ungebundenen MHC-Peptidkomplexe dar.
    7. Um das Perlen-Lysat-Gemisch so weit wie möglich zurückzugewinnen, spülen Sie das Röhrchen aus Schritt 3.1.3 mit 1 mL Puffer A aus und übertragen Sie es auf die Polypropylensäule.
    8. Waschen Sie die in der Polypropylensäule zurückgehaltenen Perlen, indem Sie 10 ml Puffer A hinzufügen. Lassen Sie den Waschpuffer durch schwerkraft eluieren.
    9. Wiederholen Sie den Waschschritt mit 10 mL Puffer B, 10 mL Puffer A und dann 10 mL Puffer C.
    10. Entfernen Sie die Polypropylensäule aus dem Rack und legen Sie sie auf die Oberseite eines neuen 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchens. Halten Sie die Säule und das Rohr zusammen mit der Hand.
    11. Fügen Sie 300 μL 1% TFA zur Polypropylensäule hinzu und mischen Sie die Perlen durch 5-faches Pipettieren auf und ab.
      HINWEIS: Die Kügelchen werden in der Polypropylensäule zurückgehalten, und die MHC-gebundenen Peptide werden im 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen eluiert.
    12. Übertragen Sie das Eluat in ein neues 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie Schritt 3.1.11 und bündeln Sie die 2 Eluate (die Eluate, die die MHC-Peptidkomplexe enthalten, sollten insgesamt 600 μL entsprechen und werden bei Schritt 3.2.4 verwendet).
    13. (OPTIONAL) Sammeln Sie ein Aliquot von 6 μL (oder 1/100 des Gesamtvolumens) für das Western Blotting und frieren Sie es sofort ein. Diese Fraktion entspricht den aus den Kügelchen eluierten MHC-Peptidkomplexen.
  2. Entsalzung und Elution von MHC-Peptiden
    HINWEIS: Die Entsalzung und Elution von MHC-Peptiden könnte durch Installation der C18-Säule auf einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen erfolgen. Für eine bessere Passform installieren Sie die vom Hersteller bereitgestellten Glühen zwischen der C18-Säule und dem 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. In diesem Protokoll wird eine C18-Säule mit einer Volumenkapazität von 5-200 μL (6-60 μg) verwendet. Alle Schritte werden bei RT durchgeführt.
    1. 200 μL Methanol auf die C18-Säule geben und dann bei 1546 x g für 3 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
    2. 200 μL 80%ACN (Acetonitril)/0,1%TFA auf die C18-Säule geben und dann 3 min bei 1546 x g zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
    3. 200 μL 0,1% TFA auf die C18-Säule geben und dann 3 min bei 1546 x g zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
    4. Laden Sie 200 μL der MHC-Peptidkomplexe aus Schritt 3.1.12 auf die C18-Säule. Zentrifugiere bei 1546 x g für 3 min und verwerfe den Durchfluss.
    5. Wiederholen Sie Schritt 3.2.4 zweimal, bis das gesamte Volume geladen ist. Beachten Sie, dass MHC-Peptide in der C18-Spalte zurückgehalten werden.
    6. 200 μL 0,1% TFA in die C18-Säule geben und dann 3 min bei 1546 x g zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.
    7. Übertragen Sie die C18-Säule in ein neues 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Eluieren Sie MHC-Peptide aus der C18-Säule durch Zugabe von 150 μL 28% ACN/0,1% TFA.
    8. Zentrifuge bei 1546 x g für 3 min.
    9. Übertragen Sie den Durchfluss in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Achten Sie darauf, den Durchfluss nicht zu verwerfen. es enthält die isolierten MHC-Peptide der Klasse I oder II.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.7-3.2.9 zweimal für ein Gesamtvolumen von 450 μL.
    11. Die 450 μL Eluat (gereinigte MHC-Peptide der Klasse I oder II) bei -20 °C einfrieren, bis die Proben mittels LC-MSMS analysiert werden.
    12. Vor der LC-MS/MS-Analyse werden die gereinigten MHC-Peptide der Klasse I oder II aus Schritt 3.2.11 mit einem Vakuumkonzentrator mit Voreinstellungen von 45 °C für 2 h, Vakuumniveau: 100 mTorr und Vakuumrampe: 5 bis zur Trockenheit verdampft.
      HINWEIS: Die Verdampfung von gefrorenen Proben ist hocheffizient. Getrocknete Peptide können bis zur Analyse wieder eingefroren werden.

4. Identifizierung von MHC-Klasse-I- und -II-Peptiden mittels LC-MS/MS

HINWEIS: Analysieren Sie das MHC-Immunpeptidom der Klassen I und II mit einem Hochleistungs-Orbitrap und hochauflösenden Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometern6. Die folgenden Informationen dienen nur als Anhaltspunkt, wobei zu berücksichtigen ist, dass die verschiedenen vorhandenen Tandem-Massenspektrometriegeräte nach unterschiedlichen Betriebsnormen arbeiten. Ein kurzer Überblick über die Schritte wird im Folgenden erläutert:

  1. Die getrockneten Proben (ab Schritt 3.2.12) werden in 50 μL 4% Ameisensäure (FA) gelöst.
  2. Laden Sie drei Injektionen von 16 μL für jede Probe und trennen Sie sie auf einer hausgemachten Umkehrphasensäule (150 μm i.d. x 250 mm Länge, Jupiter 3 μm C18 300 Å) mit einem Gradienten von 5% -30% ACN-0,1% FA und einer Durchflussrate von 600 nL/min auf einer Nano-Durchfluss-UHPLC, die mit einer MS verbunden ist.
  3. Erfassen Sie jedes volle MS-Spektrum mit einer Auflösung von 120000, einen AGC von 4 x 105 mit Automatikmodus für die Injektionszeit und Spektren unter Verwendung von Tandem-MS (MS-MS) auf den am häufigsten vorkommenden mehrfach geladenen Vorläuferionen für maximal 3 s.
    HINWEIS: Tandem-MS-Experimente werden mit einer höherenergetischen Kollisionsdissoziation (HCD) bei einer Kollisionsenergie von 30%, einer Auflösung von 30.000, einer AGC von 1,5 x 105 und einer Injektionszeit von 300 ms durchgeführt.
  4. Verarbeitung der Datendateien aus den drei Injektionen/Proben mit einer Proteomik-LC-MS/MS-Analysesoftware (z.B. PEAKS X) unter Verwendung der Maus- und Humandatenbanken (UniProtKB/Swiss-Prot (2019_09)).
  5. Wählen Sie "Nicht spezifizierte Enzymverdauung" für den Enzymparameter und 10 ppm bzw. 0,01 Da für Massentoleranzen für Vorläufer- bzw. Fragmentionen.
    ANMERKUNG: Variable Modifikationen sind Deamidierung (NQ) und Oxidation (M). Alle anderen Suchparameter sind die Standardwerte. Die endgültigen Peptidlisten werden mit ALC von 80% und mit einer False Discovery Rate (FDR) von 1% unter Verwendung der Proteomik LC-MS/MS-Analysesoftware gefiltert.

5. Visualisierung von Immunopeptidomics-Daten

ANMERKUNG: Die Qualität der von MS generierten Immunopeptidomik-Daten kann auf verschiedene Weise bewertet werden, wie kürzlich beschrieben22,23. Um die Daten zu visualisieren und ihre Gesamtqualität, Zusammensetzung und MHC-Spezifität zu bewerten, kann das Softwaretool MhcVizPipe (MVP) verwendet werden.

  1. Befolgen Sie alle Anweisungen und die zugehörige Dokumentation, um die MVP-Software zu installieren und auszuführen, die auf der Caron Lab GitHub-Website24 verfügbar ist.
    HINWEIS: MVP bietet eine schnelle und konsolidierte Ansicht der Probenqualität, -zusammensetzung und -spezifität der MHC. MVP parallelisiert die Verwendung etablierter Immunpeptidomik-Algorithmen (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 und GibbsCluster27) und generiert organisierte und leicht verständliche Berichte im HTML-Format (HyperText Markup Language). Die Berichte sind vollständig portabel und können auf jedem Computer mit einem modernen Webbrowser angezeigt werden. Beispiele für HTML-Berichte finden Sie unter Ergänzende Daten 1-4.

Ergebnisse

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Der allgemeine Arbeitsablauf zur Isolierung von MHC-Peptidkomplexen für die Analyse von Immunpeptidomen mittels MS ist in Abbildung 1 dargestellt. Repräsentative Ergebnisse für den Nachweis der Perlenbindungseffizienz des Antikörpers (Abbildung 2) (unter Verwendung des Y3 Anti-H2Kb-Antikörpers) und der Elutionseffizienz der MHC-Peptidkomplexe aus den Kügelchen (Abbildung 3) (unter Verwendung des W6/32 Anti-HLA-ABC-Antikörpers) sind dargestellt. Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierungsassays21 wurden auch angewendet, um die absolute Anzahl von MHC-Klasse-I-Molekülen pro EL4-Zelle (H2Kb und H2Db) und JY-Zelle (HLA-ABC) zu messen, wie in Abbildung 4A dargestellt.

Die intra- und interindividuelle Reproduzierbarkeit der Ergebnisse unter Verwendung des aktuellen Protokolls ist in Abbildung 4B-E dargestellt. Repräsentative Ergebnisse werden für MHC-Klasse-I-Peptide gezeigt, die aus 1 x 108 EL4-Zellen und 1 x 108 JY-Zellen identifiziert wurden. Die Ergebnisse wurden von zwei verschiedenen Labormitgliedern (Benutzer 1 und Benutzer 2) generiert. Für Benutzer 1 betrug die mittlere Anzahl der MHCI-spezifischen Peptide, die aus EL4- und JY-Zellen nachgewiesen wurden, 1341 bzw. 6361; für Benutzer 2, 1933 bzw. 7238 (Abbildung 4B,D). Der durchschnittliche Variationskoeffizient (CV) für die Anzahl der Peptide, die in drei verschiedenen biologischen Replikaten/Experimenten nachgewiesen wurden, variiert zwischen 1,9% und 11% (Abbildung 4B,D). Obwohl die Lebensläufe für die Anzahl der in den drei verschiedenen Experimenten nachgewiesenen Peptide relativ gering waren, variierte die Identität der Peptide erheblich (Abbildung 4C,E). Tatsächlich zeigen repräsentative Venn-Diagramme, dass der Anteil der Peptide, die reproduzierbar über drei biologische Replikate nachgewiesen wurden, zwischen 39% (Benutzer 2, EL4-Zellen) und 63% (Benutzer 1, JY-Zellen) lag (Abbildung 4C, E und ergänzende Tabelle 2).

Heatmaps, die von der MVP-Software generiert werden, zeigen die vorhergesagte MHC-Bindungsstärke der identifizierten Peptide mit den NetMHCpan-Suite-Tools25,26,28. Zwei GibbsCluster-Routineoptionen, die als "Unsupervised GibbsCluster" und "Allele-Specific GibbsCluster" bezeichnet werden, werden ebenfalls von MVP durchgeführt, um MHC-Peptidbindungsmotive zu extrahieren. Beachten Sie, dass MVP Einschränkungen aufweist. Sein primäres Ziel ist es nicht, allelspezifische Motive zu extrahieren und Peptide hochgenau zu kommentieren, sondern eine Vogelperspektive auf die Gesamtqualität, Zusammensetzung und MHC-Spezifität der Proben zu geben.

Für Maus-MHC-Klasse-I-Peptide (H2Db und H2Kb) in EL4-Zellen (Abbildung 5A; obere Panels und ergänzende Daten 1) zeigt eine repräsentative Heatmap, dass 89% aller nachgewiesenen 8-12-mer-Peptide starke Bindemittel (SB: NetMHCpan %Rank <0,5) oder schwache Bindemittel (WB: NetMHCpan %Rank <2) für H2Db- oder H2Kb-Moleküle sind. Sequenzcluster, die aus den 8-12-mer-Peptiden erzeugt werden, stimmen mit den berichteten Logos für H2Db (Asparagin bei P5 und Leucin bei P9) und H2Kb (Phenylalanin bei P5 und Leucin bei P8) überein (Abbildung 5)29. Erwähnenswert ist, dass ein drittes dominantes Motiv (Histidin bei P7 und Leucin bei P9) sowie zusätzliche "artefaktische" Motive mit dem M1-Antikörper beobachtet werden können (Ergänzende Daten 1). Tatsächlich ist bekannt, dass der M1-Antikörper mit dem nicht-klassischen Qa2-Molekül kreuzreagiert, und daher werden Qa2-assoziierte Peptide auch von MS nachgewiesen (Ergänzende Daten 1). Der Einfachheit halber konzentriert sich Abbildung 5 auf die Darstellung der etablierten Peptidbindungsmotive für die beiden klassischen H2b-Allele (d.h. H2Db oder H2Kb), die in EL4-Zellen exprimiert werden.

Für humane HLA-Klasse-I(HLA-ABC)-Peptide in JY-Zellen (Abbildung 5A; untere Panels und ergänzende Daten 2) zeigt eine repräsentative Heatmap, dass 97% aller nachgewiesenen 8-12-mer-Peptide SB oder WB für HLA-A*0201, -B*0702 oder -C*0702 vorhergesagt werden. Peptide wurden geclustert, um Peptidbindungsmotive für HLA-A*0201 und -B*0702 sichtbar zu machen. Das Bindungsmotiv für HLA-C*0702 ist in Abbildung 5A nicht dargestellt, da das C*0702-Allel ein relativ niedriges Expressionsniveau aufweist. Daher wurden zu wenige C*0702-Peptide isoliert und identifiziert, um ein repräsentatives C*0702-Motiv zu erzeugen. Beachten Sie, dass das C*0702-Motiv in anderen Studien 30,31,32 oder auf der NetMHCpan 4.1 Motif Viewer-Website visualisiert werden kann33.

Für humane HLA-Klasse-II-Peptide (HLA-DR) in JY-Zellen (Abbildung 5B; obere Panels und ergänzende Daten S3) zeigt eine repräsentative Heatmap, dass 70% aller nachgewiesenen 9-22-mer-Peptide für HLA-DRB1*0404 und -DRB1*1301 als SB oder WB vorhergesagt werden. Peptidbindungsmotive für diese beiden Allele sind dargestellt (Abbildung 5B). Beachten Sie, dass die hier gezeigten Peptidbindungsmotive möglicherweise nicht vollständig mit den kürzlich gemeldeten Logos für HLA-DRB1*0404 und -DRB1*130134 übereinstimmen. Diese Diskrepanz unterstreicht die derzeitige Unfähigkeit von MVP/NetMHCpan, Peptide präzise zu HLA-Klasse-II-Allelen zu annotieren, die weniger charakterisiert sind, wie HLA-DRB1*0404 und -DRB1*1301, die in JY-Zellen exprimiert werden. Weitere Informationen zu Peptidbindungsmotiven der Klasse II finden sich in anderen Studien34,35 und auf der NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer Website36.

Schließlich zeigt eine repräsentative Heatmap für Maus-MHC-Klasse-II-Peptide (H2-IAD und H2-IEd) in A20-Zellen (Abbildung 5B; untere Panels und ergänzende Daten 4), dass 87% aller nachgewiesenen 9-22-mer-Peptide als SB oder WB für H2-IAD oder H2-IEd vorhergesagt werden. Peptidbindungsmotive für diese beiden Allele stimmen mit den gemeldeten Logos überein37.

Vollständige HTML-Berichte, die von der MVP-Software generiert werden, um die Gesamtqualität und MHC-Spezifität der Proben zu bewerten, sind in den Ergänzenden Daten 1-4 verfügbar.

Workflow-Diagramm für die MHC-Peptidisolierung; LC-MS/MS-Analyse; Immuneinfang; Datenvisualisierung.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des vollständigen Verfahrens zur Isolierung von MHC-Peptiden der Klassen I und II. (A-B)100 Millionen Zellen werden pelletiert und mit 0,5% Chaps-Puffer lysiert. (C) Das Zelllysat wird zentrifugiert, und der Überstand wird zuvor zu CNBr-Sepharoseperlen gegeben, die an den gewünschten Antikörper gekoppelt sind, und (D) 14-18 h bei 4 °C inkubiert. (E) Nach der Immunkapselung werden die Kügelchen in eine Polypropylensäule überführt und gewaschen, und die MHC-Peptidkomplexe werden mit einer 1% igen TFA-Lösung eluiert. (F) Die Peptide werden mit einer C18-Säule entsalzt und eluiert. (G) Anschließend werden Peptide schnell vakuumgetrocknet und mittels Tandem-Massenspektrometrie analysiert. (H) Die Qualität der isolierten MHC-Peptide der Klassen I und II kann anhand der HLA-Subtypen mit der frei verfügbaren MhcVizPipe-Software beurteilt werden. Abbildung erstellt mit BioRender.com (NT22ZL8QSL). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnis der Elektrophorese; Anti-H2Kb-Bindung; Proteingel mit schweren, leichten Ketten; kDa-Marker sichtbar.
Abbildung 2: Coomassie-Gel-Färbung zur Verfolgung der Antikörperbindungseffizienz an Sepharose-CNBr-aktivierte Kügelchen. Aliquots äquivalenter Volumina wurden auf 12% SDS-PAGE-Gel geladen, gefolgt von Coomassie-Blaufärbung: Perlen + Antikörper-Vorkopplung (1), ungebundener Antikörper nach Kopplungsschritt (2), Überstand nach letzter Wäsche nach Kopplung (3) und Mit Antikörper gekoppelte Kügelchen (4). Die Effizienz der Bindung wird durch eine signifikante Abnahme der Signalfärbungsintensität der leichten und schweren Ketten von H2Kb veranschaulicht, wenn Kügelchen kovalent (Lane 4) an die CNBr-Perlen gebunden sind, verglichen mit dem Antikörper vor der Kopplung (Lane 1). Die Figur wurde von bioRxiv38 nachgedruckt und adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Western Blot mit HLA-ABC-Schwerkette (33-44 kDa) unter Verwendung von Anti-HLA-ABC; MHC-Peptid-Komplexe.
Abbildung 3: Western Blotting zur Verfolgung von MHC-Peptidkomplexen nach saurer Elution aus Antikörper-gekoppelten CNBr-aktivierten Kügelchen. Aliquots aus den im Protokoll angegebenen Schritten (1/100 des gesamten gemessenen Volumens) wurden auf ein 12% SDS-PAGE-Gel geladen und auf die Nitrocellulosemembran übertragen: Kügelchen + Lysat nach Immunkapselung und letzter Wäsche (A); Überstand der letzten Wäsche (B) und MHC-Peptidkomplexe, die aus den Kügelchen eluiert wurden (C). Das starke Nachweissignal der MHC-Peptidkomplexe in (C) unter Verwendung von Anti-HLA-ABC-Schwerkettenantikörpern (Abcam, #ab 70328, 1:5000) bestätigte die Isolierung von MHC-Peptidkomplexen nach saurer Elution. Es ist zu beachten, dass es möglich ist, den Anteil der MHC-Peptidkomplexe, die nicht von den Antikörper-gekoppelten Kügelchen eingefangen wurden, durch Sammeln des Durchflusses aus Schritt 3.1.6 zu beurteilen. Ein Aliquot kann dem Western Blot hinzugefügt werden (nicht auf diesem Gel gezeigt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Balkendiagramme und Venn-Diagramme, die die Peptidligandenmengen in der Analyse von Maus- und menschlichen Zellen zeigen.
Abbildung 4: Identifizierung von MHC-Klasse-I-Peptiden aus JY- und EL4-Zellen. (A) Histogramm mit der absoluten Anzahl der H2Db- und H2Kb-Zellmoleküle der Zelloberfläche pro EL4-Zelle und der HLA-ABC-Moleküle pro JY-Zelle. Die Quantifizierung wurde mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts wurden aus drei biologischen Replikaten ermittelt. (B, D) Histogramm mit der mittleren Anzahl und Standardabweichung des Mittelwerts von MHC-Klasse-I-Peptiden, die von zwei unabhängigen Anwendern identifiziert wurden (USER_1 [U1] und USER_2 [U2]). Die mittlere Anzahl und Standardabweichung des Mittelwerts der MHC-Klasse-I-Peptide, die aus EL4-Zellen der Maus (B) und menschlichen JY-Zellen (D) nachgewiesen wurden, werden gezeigt. Variationskoeffizienten (CV) über drei unabhängige biologische Replikate werden angegeben. (C, E) Venn-Diagramme, die die Anzahl der Peptide zeigen, die in EL4 (C) und JY-Zellen (E) reproduzierbar von zwei unabhängigen Anwendern (U1 und U2) über drei unabhängige biologische Replikate nachgewiesen wurden. Abbildung 4A wurde von bioRxiv38 nachgedruckt und angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

MHC-Klasse I/II-Peptidbindungsanalyse, Balkendiagramm und Sequenzlogos, Vergleich der Spezies EL4/JY A20.
Abbildung 5: Visualisierung von Immunopeptidomics-Daten mit dem MVP-Softwaretool. Datenanalyse von Maus und menschlichen (A) MHC Klasse I und (B) MHC Klasse II Peptiden. Repräsentative Bindungsaffinitäts-Heatmaps (linke Felder) und Peptidbindungsmotive (rechte Tafeln) werden dargestellt. Heatmaps-Farben stellen die MHC-Bindungsaffinität dar, die von NetMHCpan 4.1 (%rank) vorhergesagt wird. Starke Bindemittel sind rot (%Rang <0,5), schwache Bindemittel sind blau (%Rang <2) und Nicht-Bindemittel sind gelb (%Rang >2). Der Anteil (%) der 8-12mer Peptide (A) und 9-22mer Peptide (B), die SB oder WB sind, ist in Klammern angegeben. Peptidbindungsmotive wurden von MVP mit der Option "Allel-specific Gibbscluster" generiert. Diese repräsentativen Ergebnisse wurden aus 1 x 108 Zellen und unter Verwendung der folgenden Antikörper und Zelllinien erhalten: M1-Antikörper und EL4-Zellen für MHC-Klasse-I-Peptide der Maus; W6/32-Antikörper und JY-Zellen für humane MHC-Klasse-I-Peptide; M5-Antikörper und A20-Zellen für MHC-Klasse-II-Peptide der Maus; L243-Antikörper und JY-Zellen für humane MHC-Klasse-II-Peptide. In den ergänzenden Daten 1-4 finden Sie Zugriff auf die vollständigen HTML-Berichte, die von der MVP-Software generiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Daten 1-4: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Daten 1: HTML-Bericht, der von der MVP-Software aus Peptiden generiert wurde, die aus 1 x 108EL4-Zellen mit dem M1-Antikörper isoliert wurden. Drei biologische Replikate werden gezeigt. Dieser Bericht bezieht sich auf Abbildung 4 und Abbildung 5 und repräsentative Peptide sind in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt.

Ergänzende Daten 2: HTML-Bericht, der von der MVP-Software aus Peptiden generiert wurde, die aus 1 x 108JY-Zellen mit dem W6/32-Antikörper isoliert wurden. Gezeigt werden drei biologische Replates. Dieser Bericht bezieht sich auf Abbildung 4 und Abbildung 5, und repräsentative Peptide sind in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt.

Ergänzende Daten 3: HTML-Bericht, der von der MVP-Software aus Peptiden generiert wurde, die aus 1 x 108JY-Zellen mit dem L243-Antikörper isoliert wurden. Dieser Bericht bezieht sich auf Abbildung 5, und repräsentative Peptide sind in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt.

Ergänzende Daten 4: HTML-Bericht, der von der MVP-Software aus Peptiden generiert wurde, die aus 1 x 108A20-Zellen mit dem M5-Antikörper isoliert wurden. Dieser Bericht bezieht sich auf Abbildung 5, und repräsentative Peptide sind in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt.

Ergänzende Tabelle 1: Liste der Puffer. Rezepte für alle im Protokoll verwendeten Puffer werden beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Repräsentative Listen von Peptiden, die mit H2Db/Kb, HLA-ABC, HLA-DR und H2-IAd/IEd assoziiert sind. Diese Tabelle enthält die Listen der repräsentativen MHC-Peptide der Klassen I und II, die aus EL4- bzw. A20-Zelllinien der Maus isoliert wurden, und HLA-Klasse I und II aus humanen JY-Zelllinien. Diese Daten wurden auf dem ProteomeXchange (PXD028633) hinterlegt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

DATENVERFÜGBARKEIT:

Die in diesem Manuskript verwendeten Datensätze wurden auf dem ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset) hinterlegt: PXD028633.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwei Mauszelllinien (EL4 und A20), eine humane Zelllinie (JY) und fünf kommerziell erhältliche Antikörper [M1 (Anti-H2Db/Kb), Y3 (Anti-H2Kb), M5 (Anti-H2-IAd/IEd), W6/32 (Anti-HLA-ABC) und L243 (Anti-HLA-DR)] wurden im Rahmen dieses Protokolls getestet und validiert und liefern qualitativ hochwertige Immunopeptidomik-Daten. Andere Anti-HLA-Antikörper sind verfügbar (z.B. Anti-HLA-A2 BB7.2), wurden hier aber nicht getestet. Beachten Sie, dass der W6/32-Antikörper weit verbreitet und der etablierteste Antikörper auf diesem Gebiet ist. Es ermöglicht die Isolierung von Peptiden, die von allen HLA-ABC-Molekülen beim Menschen präsentiert werden, und wurde zuvor von Expertenlabors berichtet, um aus verschiedenen biologischen Quellen wie frischen oder gefrorenen Geweben zu arbeiten8,39, periphere mononukleäre Blutzellen und mononukleäre Knochenmarkzellen40, Biopsien41, Xenotransplantate41,42, Autopsien43 und Plasmaproben44,45.

Die Herstellung von frischen Lösungen, die während des gesamten Protokolls verwendet werden, ist von entscheidender Bedeutung. Insbesondere die Verwendung von frischen sauren Lösungen in Glasflaschen ist entscheidend, um eine nachträgliche Kontamination der von MS analysierten Proben zu vermeiden. Wenn das Protokoll zum ersten Mal und/oder mit einem neuen Antikörper durchgeführt wird, ist es außerdem wichtig zu beurteilen, ob der Antikörper tatsächlich mit einem blauen Coomassie-Gel an die CNBr Sepharose-Perlen gekoppelt ist. Die Waschschritte der Antikörper-gekoppelten Kügelchen nach der Immunkapselung der MHC-Peptidkomplexe sind ebenfalls entscheidend, um eine Kontamination von Nicht-MHC-Peptiden zu vermeiden. Schließlich ist besondere Vorsicht geboten, um die Eluate nach der Elution der MHC-Peptidkomplexe mit 1% TFA und der Elution der Peptide aus der C18-Säule mit ACN28%/0,1% FA nicht zu verwerfen.

Bestehende Protokolle, die in der Literatur verfügbar sind, beschreiben zusätzliche Schritte zur weiteren Reinigung der Peptide am Ende des Isolationsverfahrens, z.B. Peptidfraktionierung durch verschiedene Methoden14,46 oder Ultrafiltration mit 10-30 kDa Filtern13,47. Das aktuelle Protokoll enthält keine Details zu diesen zusätzlichen Schritten und reicht aus, um qualitativ hochwertige Immunopeptidomik-Daten bereitzustellen. Solche Schritte könnten jedoch von Nicht-Experten in Betracht gezogen werden, um das Peptidisolationsverfahren weiter zu optimieren.

Die Art der Perlen und die Art des sauren Elutionspuffers, die verwendet werden, um MHC-Komplexe aus den Kügelchen zu eluieren, können auch für die Fehlersuche modifiziert werden13,14,15,16,17,18,19. In dieser Hinsicht sind Sepharose-CNBr-aktivierte Perlen im Allgemeinen ein guter Ausgangspunkt, da sie relativ kostengünstig sind und Flexibilität in Bezug auf die Bindung an verschiedene Arten von Antikörpern aufweisen. Im aktuellen Protokoll wurde gezeigt, dass Sepharose-CNBr-aktivierte Kügelchen mit fünf verschiedenen kommerziell verfügbaren Antikörpern (d. h. M1, Y3, W6/32, L243 und M5) relativ gut abschneiden. Neben Sepharose CNBr-aktivierten Perlen sind protein A oder G oder A/G Sepharose 4 Fast Flow Perlen auch einfach zu handhaben und können, obwohl sie relativ teurer sind, ähnliche Ergebnisse erzielen. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor ist die Affinität des Antikörpers für Protein A oder G. Darüber hinaus sind Sepharose-Magnetperlen auch sehr einfach zu bedienen, aber relativ teuer. Unabhängig von der Art der von Nicht-Experten ausgewählten Perlen wird empfohlen, Aliquots in kritischen Schritten des Protokolls zu sammeln und blaue Coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gele durchzuführen, um die Bindungseffizienz des Antikörpers an die Perlen zu verfolgen, wie in Abbildung 2 gezeigt.

Ein weiterer wichtiger Faktor, der den Erfolg der MHC-Peptidisolierung beeinflusst, bezieht sich auf die Art des sauren Elutionspuffers, der zur Isolierung der MHC-Peptidkomplexe aus den Kügelchen verwendet wird. Es wurden verschiedene Puffer berichtet, darunter 0,1%, 1% oder 10% TFA, 0,2% FA und 10% Essigsäure. 1% TFA war der Elutionspuffer, der für alle getesteten Antikörper funktionierte. Dieser Schritt könnte auch durch Western Blotting gegen die MHC-Moleküle verfolgt werden, die zum Einfangen von MHC-Peptiden verwendet werden, wie in Abbildung 3 gezeigt.

Alle Puffer, die Acetonitril (ACN) und/oder Trifluoressigsäure (TFA) enthalten, sind aggressiv und können bei Kontakt mit Kunststoff zu einer Kontamination der Probe mit kleinen molekularen und polymeren Substanzen wie Weichmachern führen. Um solche Probleme zu vermeiden, werden alle Lösungen, die ein organisches Lösungsmittel und/oder TFA enthalten, täglich frisch zubereitet und bis zum Gebrauch in einer Glasflasche gelagert. Der Großteil der Schritte wird in Protein LoBind Kunststoffröhrchen durchgeführt. Diese Röhrchen wurden speziell für die Proteomik entwickelt und bestehen aus hochwertigem, neuwertigem Polypropylen, das frei von Bioziden, Weichmachern und Latex ist. Sie werden auch mit optimierten, hochglanzpolierten Formen ohne den Einsatz von Gleitmitteln hergestellt. Diese Vorsichtsmaßnahmen sind wichtig zu berücksichtigen, um die Generierung hochwertiger Immunopeptidomik-Daten zu ermöglichen.

Der Antikörper ist eine wichtige Einschränkung für die Isolierung von MHC-gebundenen Peptiden. Der W6/32-Antikörper ermöglicht die Isolierung von Peptiden, die von allen HLA-ABC-Klasse-I-Molekülen beim Menschen präsentiert werden, und ist der am weitesten verbreitete und etablierte Antikörper auf diesem Gebiet. Eine hochauflösende HLA-Typisierung von nicht charakterisierten menschlichen Zelllinien oder Bioproben ist bei der Anwendung des W6/32-Antikörpers nicht erforderlich, wird aber dennoch für bestimmte Anwendungen empfohlen, um die Dateninterpretation zu erleichtern48. HLA/MHC-Typisierungsinformationen finden Sie auch in öffentlichen Ressourcen für mehrere Zelllinien und Mausmodelle49. Neben dem W6/32-Antikörper sind die vier anderen Antikörper (M1, M5, Y3 und L243), die im Rahmen dieses Protokolls getestet und validiert wurden, alle kommerziell verfügbar. Auf der anderen Seite wurden viele andere Antikörper, die in früheren Immunpeptidomik-Studien berichtet wurden, von der Gemeinschaft nicht weitgehend übernommen und sind nicht kommerziell verfügbar oder durch die Kultur von Hybridom-Zelllinien verfügbar, was relativ teuer ist.

Eine weitere wichtige Einschränkung für die Isolierung von MHC-gebundenen Peptiden ist die Menge an benötigtem Ausgangsmaterial. Die benötigte Menge ist umgekehrt proportional zum Expressionsniveau von MHC-Molekülen auf der Zelloberfläche, das durch Durchflusszytometrie quantifiziert werden kann (Abbildung 4A). Zellen mit hohen Expressionsniveaus von MHC-Molekülen (z. B. dendritische Zellen und hämatopoetische Zellen im Allgemeinen) liefern im Allgemeinen qualitativ hochwertige Immunopeptidomik-Daten. Expertenlabore verwenden bereits 50 Millionen Zellen50, aber 100 Millionen bis 1 Milliarde Zellen werden für Nicht-Experten empfohlen. Die Verwendung von Gewebebiopsieproben (<13 mg)41, Xenograft42,43, Autopsie44 und Plasma45,46 wurde ebenfalls berichtet, bleibt aber für Nicht-Expertenlaboratorien eine Herausforderung. Auch die Gesamtzahl der erwarteten MHC-assoziierten Peptide ist für etablierte Zelllinien gut dokumentiert (hier zwischen ~ 2000 und ~ 10000 Peptiden, abhängig von der verwendeten Zelllinie und dem verwendeten Antikörper), aber die absoluten Mengen an natürlich präsentierten Peptiden, die durch die Technik effizient abgebaut werden, bleiben umstritten. In der Tat schätzten frühere Studien, dass die Effizienz des Isolationsverfahrens peptidabhängig ist und von nur 0,5% bis 2% 51 reichen kann. Weitere Einschränkungen in der Immunpeptidomik sind die Reproduzierbarkeit der Methoden und die Unfähigkeit der NetMHCpan-Suite-Tools, Peptide korrekt zu MHC-Allelen zu annotieren, die weniger charakterisiert sind. In diesem Zusammenhang die Weiterentwicklung und Anwendung relativ neuer datenunabhängiger Erfassungsmethoden der MS7,32,52 sowie neuer Peptidclustering- und MHC-Peptidbindungsvorhersagealgorithmen31,34,53,54 es wird erwartet, dass sie die Reproduzierbarkeit und die Genauigkeit der Peptidannotation in der Immunpeptidomik verbessern. Die Immunpeptidomik steht vor anderen Einschränkungen in Bezug auf den MS-Erwerb und die computergestützte Analyse von MHC-assoziierten Peptiden und wird an anderer Stelle behandelt1,6,55.

Obwohl die Isolierung von HLA-ABC-assoziierten Peptiden aus menschlichen Proben mit dem W6/32-Antikörper gut etabliert ist und von vielen Forschungsgruppen weit verbreitet ist, ist die Isolierung von Maus-MHC-Klasse-I- und II-assoziierten Peptiden relativ weniger etabliert. Daher werden robuste Protokolle für die Isolierung von Maus-MHC-Liganden benötigt. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das für die Isolierung von MHC-Klasse-I-Peptiden und MHC-Klasse-II-Peptiden aus zwei Mauszelllinien C57BL/6 bzw. BALB/c-Ursprungs optimiert ist. Insbesondere ermöglicht das Protokoll die Isolierung von H2Kb- und H2Db-assoziierten Peptiden der Klasse I unter Verwendung des M1-Antikörpers sowie von H2-IAD- und H2-IEd-assoziierten Peptiden der Klasse II unter Verwendung des M5-Antikörpers. Daher sollte die Verbreitung und Anwendung des aktuellen Protokolls die grundlegende und translationale Immunpeptidomik-Forschung in verschiedenen Mausmodellen erleichtern.

Das Protokoll kann verwendet werden, um einen Immunopeptidomics-Workflow zu etablieren und zu standardisieren sowie neue Protokolle zu benchmarken. Zum Beispiel kann es angepasst und weiter optimiert werden, um ein Immunpeptidomik-Screening in verschiedenen biologischen Matrices durchzuführen, die von Blut / Plasma über frisches oder gefrorenes Gewebe bis hin zu FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) reichen. Darüber hinaus wird das Protokoll die reproduzierbare Reproduzierbarkeit des Probenvorbereitungsverfahrens innerhalb und zwischen laborintern in der Immunpeptidomik fördern und wird daher voraussichtlich breite Anwendung in der Grundlagen- und klinischen Forschung finden.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Pierre Thibault, Eric Bonneil, Joël Lanoix, Caroline Côté (Institute for Research in Immunology and Cancer, Université de Montréal) und Anthony Purcell (Monash University) für ihre aufschlussreichen Kommentare. Diese Arbeit wurde durch Mittel des Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), der Cole Foundation, des CHU Sainte-Justine und der Charles-Bruneau Foundations, der Canada Foundation for Innovation, des National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) und der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (#174924) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
A20-ZelllinieATCCTIB-208Maus B Lymphoblast
Acetonitril, LC/MS GradeFisherScientificA955-4
Anti-Human-HLA A, B, C (W6/32) - MHC Klasse IBioXcellBE0079
Anti-Human/Affe HLA-DR (L243) - MHC Klasse IIBioXcellBE0308
Anti-Maus H2 (M1/42.3.9.8) - MHC Klasse IBioXcellBE0077
Anti-Maus H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC Klasse IIBioXcellBE00108
Anti-Maus H2Kb (Y3) - MHC Klasse IBioXcellBE0172
BupH Phosphat gepufferte Kochsalzlösung Packungen (PBS)ThermoFisher28372Beutelinhalt gelöst in einem Endvolumen von 500 mL deionisiertem Wasser (FisherScientific, W64)
CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1- Propansulfonat)EMDMilipore220201-10MG
CNBr-aktivierte SepharoseCytivia# 17-0430-01
EL4-ZelllinieATCCTIB-39Maus T Lymphoblast
epTIPS LoRetention Tips, 1000 µ L/EppendorfFisherScientific02-717-352Bessere Ergebnisse mit Material mit geringer Retention
epTIPS LoRetention Spitzen, 200 & Mikro; L/EppendorfFisherScientific02-717-351Bessere Ergebnisse mit Material mit geringer Retention
Ameisensäure, LC/MS-QualitätFisherScientificA117-50
GlycinFisherScientificRDCG0250500
SalzsäurelösungFisherScientific60-007-11
JY-ZelllinieSigma Aldrich94022533-1VLEBV-immortalisierte B-Zell-Lymphoblastoid-Linie
Methanol, LC/MS-QualitätFisherScientificA456-4
Poly-Prep-Chromatographie-Säulen (Polypropylen-Säule)Bio-Rad731-1550im Protokoll als Polypropylen-Säule bezeichnet
Proteasen-InhibitorThermoFisherA329631 Pellet pro 10 ml Zelllysepuffer
QifikitDakoK007811-8
NatriumbicarbonatAmresco# 0865-1kg
NatriumchloridFisherScientificMSX04201
Festphasen-Extraktionsscheibe, Ultramikrospin-Säule C18Die NestgruppeSEMSS18Veiner Kapazität von 6– 60 & Mikro; g, maximales Volumen von 200 &Mikro; L
Trifluoressigsäure (TFA), LC-MS GradeFisherScientificPI85183
TrisFisherScientificT395-500
Tris-HClFisherScientific#10812846001
Tube LoBind 1,5 mL/EppendorfFisherScientificE925000090Bessere Ergebnisse mit Material mit geringer Retention
Tube LoBind 2 mL/EppendorfFisherScientific13-698-795Bessere Ergebnisse mit Material mit geringer Rückhaltung
Wasser, LC/MS-QualitätFisherScientificW64

Referenzen

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