Summary
Burada, fidelerde Phytophthora nicotianae direnci için tütün genotiplerinin etkili ve doğru bir şekilde taranması için bir protokol sunulmaktadır. Bu, hassas ıslahın yanı sıra moleküler mekanizma araştırması için pratik bir yaklaşımdır.
Abstract
Oomycetes Phytophthora nicotianae'nin neden olduğu siyah sap, tütün için yıkıcıdır ve bu patojen birçok solanlı ürün için oldukça patojeniktir. P. nicotianae yüksek sıcaklıklara iyi adapte olmuşlardır; bu nedenle, bu patojen üzerine yapılan araştırmalar, küresel ısınma nedeniyle dünya çapında tarımda önem kazanmaktadır. P. nicotianae'ye dirençli tütün bitkileri çeşitleri, P. nicotianae tarafından kolonize edilen yulaf taneleri ile aşılama ve hastalık semptomlarının izlenmesi ile yaygın olarak taranır. Bununla birlikte, aşılama yoğunluğunu ölçmek zordur, çünkü bu durumda doğru aşılama çok önemlidir. Bu çalışmada tütünün P. nicotianae ile enfeksiyona karşı direncini değerlendirmek için etkili ve güvenilir bir yöntem geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu yöntem, dirençli çeşitleri tanımlamak için başarıyla kullanılmıştır ve aşılama etkinliği gerçek zamanlı PCR ile doğrulanmıştır. Bu çalışmada sunulan direnç değerlendirme yöntemi, hassas ıslahın yanı sıra moleküler mekanizma araştırması için de verimli ve pratiktir.
Introduction
P. nicotianae birçok solanlı ürün için yıkıcıdır. Tütün "siyah sap"1, patates yaprağı ve yumru çürüklüğüne2, domates ve tatlı biber tacı ve kök rot3'e ve Goji yaka ve kök çürüklüğüne4 neden olabilir. P. nicotianae, herhangi bir büyüme aşamasında kökler, gövdeler ve yapraklar da dahil olmak üzere tütün bitkilerinin tüm kısımlarına saldırabilir5. Hastalığın en yaygın semptomu sapın siyah tabanıdır. Kökler başlangıçta suya batırılmış olarak görülür ve daha sonra nekrotik hale gelir ve yapraklar büyük dairesel lezyonlar gösterir5. Bu hastalık, seradaki bir tütün bitkisine ve tarlaya zarar verebilir6. P. nicotianae'yi kontrol etmek için en pratik ve ekonomik yöntem, dirençli çeşitlerin kullanılmasıdır7. Bununla birlikte, tütün germplazma koleksiyonlarından P. nikotine'e dirençli katılımların tanımlanması için etkili bir tarama protokolü gereklidir.
Tütünde P. nikotinae direncini değerlendirmek için çeşitli tanımlama yöntemleri tanımlanmıştır7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Genel olarak, P. nikotinae dirençli tütün genotiplerinin tanımlanmasında üç ana yaklaşım kullanılmıştır. Birincisi, P. nicotianae içeren Petri plakalarında miselinin agar ortamı ile karıştırılmasını içerir. Miselya daha sonra karanlıkta oda sıcaklığında 2 hafta boyunca yetiştirilir. Miseliye 1 L deiyonize su ilave edilir ve 30 s homojenize edilir. İnokulum ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutulur. Bitkinin her iki tarafında iki delik (1 cm çapında ve 4-5 cm derinliğinde) yapılır ve her deliğe 10 mL inokülum dökülür. Delikler daha sonra çevredeki toprakla doldurulur ve hastalık gelişimi 2 hafta boyunca günlük olarak izlenir8,10.
İkinci yöntemde, bitkiler patojen istilasına uğramış kürdanlarla aşılanır. Bu yaklaşım için, bitkiler ekimden yaklaşık 6 hafta sonra kullanılmalı ve minimum 30 cm yüksekliğe sahip olmalıdır. Otoklavlanmış kürdanlar, P. nicotianae miseli içeren kültürlerin yüzeyine yerleştirilir. Kültür yemekleri daha sonra 7 gün boyunca oda sıcaklığında ışık altında saklanır. Daha sonra, bitkileri aşılamak için kolonize kürdan kullanılır. Kürdanlar, dördüncü ve beşinci düğümler arasındaki tütün saplarına yerleştirilir. Bitkiler 5 gün boyunca günlük olarak izlenir9,15. Bu yöntem küçük fideler için geçerli değildir. İnokulum patojen istilasına uğramış kürdan olduğundan, aşılama yoğunluğu tam olarak kontrol edilemez.
En sık kullanılan yaklaşım, aşılama için yulaf tanelerini içerir. Bu durumda, yulaf taneleri 500 mL yulaf ve 300 mL deiyonize suyun 121 ° C'de 3 gün boyunca günde bir kez 1 saat otoklavlanması ile hazırlanır. Daha sonra, patojen-kolonize kültür ortamına yulaf taneleri eklenir. Yemekler parafin film ile kapatılır ve 7-12 gün boyunca ışıkta 25 ° C'de inkübe edilir. Saksı toprağında, her bitkiden 4 cm uzaklıkta dört ayrı 5 cm derinliğinde delik açılır ve her deliğe bir patojen istilasına uğramış yulaf tanesi yerleştirilir. Kuluçka süresi, ilk yer üstü semptomunun ne zaman ortaya çıktığına bağlı olarak belirlenir7,11,12,13,14,15,16. Bu yöntem verimlidir ve büyük ölçekli direnç taraması için uygulanabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın bir sınırlaması, inokulumun patojen tarafından istila edilmiş yulaf taneleri olmasıdır, bu nedenle aşılama yoğunluğu tam olarak kontrol edilemez.
Bununla birlikte, burada sunulan büyüme odası direnci değerlendirmesine uygulanabilir daha doğru bir yöntemdir. Diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, inokülum zoospor süspansiyonudur, bu nedenle aşılama yoğunluğu kontrol edilebilir ve ayarlanabilir. Bu çalışmadaki tütün bitkileri topraksız olarak yetiştirildiğinden, sonuçların gözlemlenmesi daha kolaydır. Dahası, bitki köklerini topraktan örneklemek her zaman köklere zarar verir ve bu da bir dizi fizyolojik tepkiye neden olur17. Bu yöntemde bitkiler topraksız olarak yetiştirildiği için kök hasarına müdahale ortadan kaldırılabilir. Sonuç olarak, bu yöntem moleküler mekanizma araştırması ve hassas ıslah için daha pratiktir. Bu protokolü kullanarak, veriler tipik olarak 5 gün içinde elde edilir ve tek bir deneyde 200'den fazla bitki değerlendirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Malzemeler
- Tütün çeşitleri elde edin.
NOT: Bu deney için "Beinhart1000-1" (Beinhart 1000'in bir seçimi) (BH) ve "Xiaohuangjin1025" (XHJ), Çin Tütün Germplazma Kaynağı'nın Ulusal Orta Vadeli Genbank'ından elde edilmiştir. BH dirençlidir, XHJ ise P. nicotianae enfeksiyonuna duyarlıdır16. Çin Tarım Bilimleri Akademisi Tütün Araştırma Enstitüsü'nde korunan P. nicotianae ırkı 0'ın bir alan izolatı, çalışma boyunca tüm aşılamalar için kullanıldı.
2. P. nicotianae direnç değerlendirmesi için tütün genotiplerinin ekilmesi
- Tütün tohumlarını vermikülit ile karıştırın ve tohumları sterilize edilmiş saksı toprağına yavaşça yayınlayın. Saksıları büyüme odasına yerleştirin. 16 saatlik ışık/8 saatlik karanlık fotoperiyot altında 25 °C'lik sabit bir sıcaklığı koruyun.
- Hidroponik cihazları tepsiler ve köpük tabakalarla hazırlayın. Tohumlar çimlendikten sonra, fideleri saksı toprağından çıkarın, kökleri steril deiyonize suyla hafifçe yıkayın ve hidroponik cihazlara nakledin.
- Cihazları 24 saat boyunca 16 saat ışık/8 saat karanlık fotoperiyot altında 25 °C'de iklim odalarına yerleştirin.
- Hoagland besin çözeltisini önceden hazırlayın (Tablo 1). Fideleri Hoagland besin çözeltisi (bitki başına yaklaşık 125 mL) ile hidroponik cihazlara nakledin.
- Cihazları 2 hafta boyunca 16 saat ışık/8 saat karanlık fotoperiyot altında 25 °C'de bir iklim odasına yerleştirin.
3. P. nicotianae zoospor süspansiyonunun hazırlanması
- Yulaf ezmesi agar ortamı hazırlayın.
- 33 g yulaf ezmesi tartın ve cam eşyalara aktarın ve 1.000 mL steril su ekleyin. Elektromanyetik bir set üstü fırında kaynatın.
- Yulaf ezmesi yapışkan hale geldikten sonra, sıvı çözeltiyi bir parça steril gazlı bezden süzün.
- Sıvı çözeltiyi 1.000 mL dereceli bir silindire dökün ve cildi steril suyla 1.000 mL'ye ayarlayın.
- Sıvı çözeltiyi bir cam reaktif şişesine dökün ve 18 g agar ekleyin. İyice çalkalayın ve karışımı (yulaf ezmesi agar ortamı) 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın. 30 dakika oda sıcaklığında bırakın.
- Her Petri kabına sterilize edilmiş yulaf ezmesi agar ortamının yaklaşık 20 mL'sini dökün. Petri kaplarını misel ekiminden önce iyice soğuması için oda sıcaklığında bırakın.
- Misel ekimi yapın.
- 1 cm çapında zımbalar ve kürdanları 15 dk boyunca 121 °C'de otoklavlayarak önceden hazırlayın.
- Yuvarlak misel paspasları yapmak için P. nicotianae misel agar kültürlerinde delikler açın.
- Misel paspaslarını seçin, misel tarafını yulaf ezmesi agar ortamına yerleştirin ve miselyumu 14 gün boyunca karanlıkta 25 ° C'de inkübe edin.
- P. nicotianae zoospor süspansiyonunu hazırlayın.
- Her misel yetiştiriciliğine (15 mL / çanak) % 0.1 KNO3 çözeltisi ekleyin, ardından sporangium'u indüklemek için 20 dakika boyunca 4 ° C'de kültürleme yapın.
- Zoosporları serbest bırakmak için bulaşıkları 25 dakika boyunca 25 ° C'de tutun.
- Zoospor süspansiyonunu bir beherde toplayın ve bir mikroskop ve hemositometre kullanarak zoospor konsantrasyonunu ölçün.
- Zoospor konsantrasyonunu steril su ile 1 x 104 zoospor/mL'ye ayarlayın.
4. Hastalığa dayanıklı tütün çeşitlerinin belirlenmesi
- Fideleri Hoagland besin çözeltisinden alın ve kökleri karanlıkta 3 saat boyunca 25 ° C'de bir Petri kabında (90 mm) 20 mL P. nicotianae zoospor süspansiyonuna batırarak aşılayın.
- Aşılamadan sonra, tütün fidelerini kökleri batırarak 10 mL steril su ile yeni Petri kaplarına koyun. İki parça filtre kağıdı ile kaplayarak kökleri nemli tutun. Bulaşıkları 16 saat ışık/8 saat koyu fotoperiyotla 25 °C'de tutun.
- 2-3 gün sonra, hastalığın şiddetini gözlemleyin.
- Kontrol işlemi için, tütün fidelerini kökleri batırarak 10 mL steril suyla doğrudan Petri kaplarına koyun ve kökleri iki parça filtre kağıdı ile örtün.
NOT: Her işlemin, deney başına 8 bitki ile üç replikasyonu vardı.
- Kontrol işlemi için, tütün fidelerini kökleri batırarak 10 mL steril suyla doğrudan Petri kaplarına koyun ve kökleri iki parça filtre kağıdı ile örtün.
5. P. nicotianae enfeksiyonunun değerlendirilmesi
- Aşılamadan 4-5 gün sonra hastalığın şiddetini değerlendirin. Çin ulusal standardına18 dayanarak, bireysel bitki hastalığı şiddetini 0'dan 9'a kadar bir ölçekte puanlayın (Tablo 2, Şekil 1).
- Aşağıdaki formülü kullanarak hastalık indeksini hesaplayın18:
Hastalık indeksi =
burada a, b, c, d, e ve f, her hastalık şiddet derecesindeki bitki sayısıdır.
NOT: Hastalığın şiddeti 6 dereceye18 ayrıldı (Tablo 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dirençli BH ve duyarlı XHJ çeşidinin 4 haftalık bitkileri, bu makalede sunulan yöntem kullanılarak P. nicotianae ile sorgulandı. Deney, her biri grup başına 8 bitki içeren üç kopya ile tasarlandı. İki tütün çeşidinin, BH ve XHJ'nin P. nikotinae enfeksiyonu Şekil 2'de sunulmuştur. Aşılamadan sonraki 3 günde, XHJ için, kök lezyonları kök çevresinin yaklaşık yarısını kapladı ve yaprakların yarısı hafifçe soldu; dirençli BH çeşidinde herhangi bir semptom gözlenmedi. Aşılamadan 4 gün sonra, XHJ'de yaprak solgunluğu ve ciddi kök lezyonları meydana gelirken, bu semptomlar BH'de görülmedi.
Aşılamadan 5 gün sonra, bireysel bitki hastalığı şiddeti, "Tütün Hastalıkları ve Böcek Zararlılarının Derecesi ve Araştırma Yöntemi"18 için Çin ulusal standardına dayanarak kaydedildi ve hesaplandı (Tablo 4). BH'nin ortalama hastalık indeksi standarda göre dirençli (R) olarak kabul edilen 6.48 ve XHJ'nin ortalama hastalık indeksi 76.85 idi ve standarda göre duyarlı (S) olarak kabul edildi.
Aşılama etkinliğini doğrulamak için, göreceli patojen biyokütlesi gerçek zamanlı PCR ile ölçüldü (Şekil 3). Bitki ve patojen genomik DNA'sı enfekte BH ve XHJ'den izole edildi ve CTAB protokolü kullanılarak enfeksiyondan 24 saat, 72 saat ve 168 saat sonra toplandı19. Bağıl patojen biyokütlesi, Pn-Fw (5'-CTCCAGAACGTGTACATCCG-3') / Pn-Rev (5'-TAGCGCCCTTCCTCAG-3') primer çiftleri kullanılarak ölçüldü ve P. nicotianae20'nin 40S ribozomal proteini S3A'yı (WS21) ve Nt-Fw (5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3') / Nt-Rev (5'-AAGGGATGCGAGGAGGATGGA-3') tütün referans geni 26S rRNA genini yükseltti. Patojen ve tütün gDNA'sı arasındaki ekspresyon kıvrım değişiklikleri 2-ΔΔCT Ct yöntemi kullanılarak hesaplandı. Gerçek zamanlı PCR'nin sonuçları fenotipik gözlemleri doğruladı.
BH ve XHJ arasındaki bir haç BC4F2 popülasyonundan beş soy ve iki ara direnç çeşidi, K326 ve Yunyan87, zoospor süspansiyon aşılama yöntemi ve yulaf taneleri aşılama yöntemi kullanılarak değerlendirildi (Tablo 5). Zoospor süspansiyon yöntemi küçük fidelerde, yulaf taneleri aşılama yöntemi ise yetişkin bitkilerde uygulanmıştır. BC4F2 popülasyonundan beş soy için, hastalık indeksi zoospor süspansiyon yöntemi için 16.49 ila 77.60 ve yulaf taneleri yöntemi için 10.33 ila 83.08 arasında değişmiştir. İki enfeksiyon yöntemi arasındaki direnç sınıflamaları çoğunlukla birbiriyle tutarlıydı. İki ara direnç çeşidi olan K326 ve Yunyan87 ile yapılan değerlendirme, her iki yöntemde de "dirençli" olduğunu gösterdi. Bu veriler, farklı büyüme dönemlerinde tütün bitkilerinde gerçekleştirilmelerine rağmen, iki aşılama yöntemi arasındaki korelasyonu göstermektedir.
| Orijinal likör | Oran | Orijinal likör hacmi (mL) | Besin elementleri | İçerik (g) |
| OL 1 | 1000× | 500 | mgSO4•7 H2O | 30.81 |
| OL 2 | 1000× | 500 | Ca(NO3)2•4 H2O | 221.39 |
| OL 3 | 1000× | 500 | NaH2PO4•2 H2O | 19.5 |
| OL 4 | 1000× | 500 | NH4NO3 | 75.04 |
| OL 5 | 1000× | 500 | (NH4) 2 adet SO4 | 123.75 |
| OL 6 | 1000× | 500 | CaCl2 | 104.06 |
| OL 7 | 1000× | 500 | FeSO4•7 H2O | 2.78 |
| Na2-EDTA | 3.73 | |||
| OL 8 | 1000× | 500 | K2SO4 | 87.1 |
| OL 9 | 4000× | 1000 | MnCl2•4 H2O | 7.24 |
| H3BO3 Serisi | 11.44 | |||
| ZnSO4•7 H2O | 0.88 | |||
| CuSO4•5 H2O | 0.32 | |||
| (NH4) 6 Mo7O24•2 H2O | 0.36 |
Tablo 1: Hoagland besin çözeltisi.
| Derece | Fenotipin görünümü |
| 0. Sınıf | Tüm bitkide belirti yok |
| 1. Sınıf | Kök lezyonları < 1/3'ü kök çevresi veya yaprakların <1/3'ü solgunluk |
| 3. Sınıf | Kök çevresinin 1/3 ila 1/2'si arasında veya yaprakların 1/3 ila 1/2'si arasında hafif solgun olan kök lezyonları |
| 5. Sınıf | Kök lezyonları kök çevresinin 1/2'sini >, ancak çevrenin etrafında tamamen değil veya yaprakların 1/2 ila 2/3'ü arasında soluyor |
| 7. Sınıf | Tüm kök çevresi etrafındaki kök lezyonları veya yaprakların >2/3'ünün solması |
| 9. Sınıf | Bitkiler ölü görünüyor |
Tablo 2: Siyah sap hastalığı şiddet sıralaması. "Tütün Hastalıkları ve Böcek Zararlılarının Derece ve Araştırma Yöntemi" (GB / T 23222-2008) için Çin ulusal standardına dayanarak, bireysel bitki hastalığı şiddeti 0'dan 9'a kadar bir ölçekte puanlandı.
| Hastalık indeksi | Direncin değerlendirilmesi |
| 0 | Yüksek dirençli veya bağışıklık (I) |
| 0,1 ila 20 | Dayanıklı ( R ) |
| 20,1 ila 40 | Orta derecede dirençli (MR) |
| 40,1 ila 60 | Orta derecede duyarlı (MS) |
| 60,1 ila 80 | Duyarlı (S) |
| 80,1 ila 100 | Yüksek derecede duyarlı (HS) |
Tablo 3: Direncin hastalık indeksine göre değerlendirilmesi. Hastalık şiddeti hastalık indeksine göre 6 sınıfa ayrıldı. 0, yüksek dirençli veya immün (I), 0.1 ila 20 dirençli ( R ), 20.1 ila 40 orta derecede dirençli (MR), 40.1 ila 60 orta derecede duyarlı (MS), 60.1 ila 80 duyarlı (S), 80.1 ila 100 yüksek duyarlı (HS) anlamına gelir.
| Çeşit | Yinelemek | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | Hastalık indeksi | Demek | Direncin değerlendirilmesi | |
| BH | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 4.17 | 6.48 | ||
| 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 0 | 1 | 8.33 | R | |||
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 1 | 6.94 | ||||
| cesaret | 1 | 7 | 5 | 7 | 7 | 9 | 7 | 7 | 7 | 77.78 | 76.85 | ||
| 2 | 9 | 7 | 9 | 7 | 5 | 9 | 7 | 5 | 80.56 | S | |||
| 3 | 7 | 5 | 7 | 9 | 5 | 9 | 5 | 5 | 72.22 | ||||
Tablo 4: BH ve XHJ'de hastalık indeksi ve direnci. BH'nin ortalama hastalık indeksi standarda göre direnç (R) gösteren 6.48 ve XHJ'nin ortalama hastalık indeksi standarda göre duyarlılık (S) gösteren 76.85 idi.
| Genotip | Zoospor süspansiyonu | Yulaf taneleri yöntemi | ||||||
| Deney 1 | Deney 2 | Demek | Sınıflandırma | Deney 1 | Deney 2 | Demek | Sınıflandırma | |
| BH | 4.17 | 8.33 | 6.94 | R | 0 | 0 | 0 | Ben |
| cesaret | 77.78 | 80.56 | 72.22 | S | 84.89 | 90 | 87.45 | HS |
| K326 Serisi | 12.5 | 12.5 | 12.5 | R | 5.39 | 15.67 | 10.53 | R |
| Yunyan87 | 19.45 | 8.33 | 13.89 | R | 4.7 | 28.89 | 16.8 | R |
| C42-4 · | 21.28 | 21.89 | 21.59 | BAY | 7.56 | 13.11 | 10.33 | R |
| C13-4 Serisi | 18.16 | 14.81 | 16.49 | R | 38.89 | 19.66 | 29.27 | BAY |
| C9-5 Serisi | 77.41 | 77.78 | 77.6 | S | 79.83 | 82.86 | 81.34 | HS |
| C46-8 · | 55.56 | 51.11 | 53.34 | MS | 62.91 | 72.65 | 67.78 | S |
| C66-9 · | 79.88 | 74.07 | 76.98 | S | 93.94 | 72.22 | 83.08 | HS |
Tablo 5: Zoospor süspansiyon aşılama yöntemi ve yulaf taneleri aşılama yöntemi ile farklı genotiplerde P. nikotinane enfeksiyonuna yanıt. Zoospor süspansiyon aşılama yöntemi küçük fidelere, yulaf taneleri aşılama yöntemi ise yetişkin bitkilere uygulanmıştır. Bu veriler zoospor süspansiyon aşılama yöntemi ile yulaf taneleri aşılama yöntemi arasındaki korelasyonu göstermektedir. K326 ve Yunyan87 orta direnç seviyelerine sahiptir ve C42-4, C13-4, C9-5, C46-8, C66-9, BH ve XHJ arasındaki bir haç BC4F2 popülasyonundan gelen soylardır. Bitkiler bağışık, dirençli, orta derecede dirençli, orta derecede duyarlı, duyarlı veya yüksek duyarlı olarak sınıflandırıldı.
Şekil 1: Her derecenin belirtisi . (A) Derece 0, tüm bitki semptomsuz. (B) Derece 1, kök lezyonu <1/3'ü kök çevresi veya <1/3 yaprak solgunluğu. (C) Derece 3, kök çevresinin 1/3 ila 1/2'si arasında veya yaprakların 1/3 ila 1/2'si arasında hafif solgun sap lezyonları. (D) Derece 5, kök lezyonları kök çevresinin 1/2'sini >, ancak çevrenin etrafında tamamen değil veya yaprakların 1/2 ila 2/3'ü arasında soluyor. (E) Derece 7, tüm gövde çevresi etrafındaki kök lezyonları veya yaprakların >2/3'ünün solması. (F) 9. sınıf, bitkiler ölü görünür. Kırmızı oklar kök lezyonlarını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İki tütün genotipinde gözlenen varyasyon . (A) Aşılamadan 3 gün sonra dirençli BH çeşidinde tüm bitki semptomu yoktur. (B) Kök lezyonları, aşılamadan 3 gün sonra XHJ'de kök çevresinin yaklaşık 1/2'si ve yaprakların 1/2'si hafifçe solmuş durumdadır. (C) Aşılamadan 4 gün sonra BH'ye dirençli çeşitlilikte tüm bitki semptomu içermez. (D) Kök lezyonları, kök çevresinin 1/2'sini >, ancak çevrenin etrafında tamamen değil ve aşılamadan 4 gün sonra XHJ'de duyarlı çeşitlilikte solan yaprakların 1/2 ila 2/3'ü arasında. Kırmızı oklar kök lezyonlarını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Aşılama sonrası 24 saat, 72 saat ve 168 saatte enfekte BH ve XHJ'de göreceli P. nikotinae biyokütle miktarı. Bu, tütün 26S rRNA geni ile karşılaştırıldığında P. nicotianae WS21 gen amplifikasyonunun oranı olarak hesaplanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekili tütünde P. nicotianae direncini arttırmak için çoklu direnç kaynakları kullanılmıştır. Tek baskın R genleri, Php ve Phl, sırasıyla Nicotiana plumbaginifolia ve Nicotiana longiflora'dan içe geçmiştir10. Puro tütünü çeşidi Beinhart 1000, P. nicotianae13'e karşı bildirilen en yüksek kantitatif direnç seviyesine sahiptir. Çoklu aralıklı haritalama deneyleri, en az altı nicel özellik lokusunun (QTL) bu satırdaki dirence katkıda bulunabileceğini öne sürmüştür13,22. Yukarıda bahsedilen dirençli kaynaklara ek olarak, başka bir uzaylı geni olan Wz'nin de ırk 0 ve ırk 123,24'e karşı yüksek düzeyde direnç sağladığı bulunmuştur. Dirençli çeşitlerin çoklu dirençli kaynakları ve karmaşık genetik arka planı göz önüne alındığında, 1) P. nikotinae dirençli tütün genotiplerinin tanımlanması, 2) ıslaha dirençli çeşitlerin tanımlanması ve 3) bitki-patojen etkileşimlerinin moleküler mekanizma çalışmaları için direnç değerlendirmesi için kesin ve güvenilir bir yöntem gereklidir. P. nikotinae enfeksiyonu şiddetlerini değerlendirmek için kullanılan önceki yöntemler zaman alıcıydı veya aşılama yoğunluklarının kontrol edilmesi zordu. Bu nedenle, P. nicotianae direncinin değerlendirilmesi için yeni bir yöntem belirlemek acildir.
Doğal enfeksiyon süreçlerini taklit etmek yeni yöntemimizdeki kilit noktadır. İlk olarak, P. nicotianae'nin tipik yaşam döngüsü boyunca, zoosporlar bitki hastalıklarını başlatan başlıca enfektif ajanlardır. Zoosporlar bitki yüzeyine ulaştığında, hareketsiz kistler haline gelirler, daha sonra çimlenirler ve mikrop tüpleri oluştururlar. Daha sonra, germ tüplerinin ucunda appressoria üretilir25. Protokolümüzde, doğal enfeksiyon durumunu taklit eden inokülum olarak zoospor süspansiyonu kullanılmıştır. İkincisi, Nicotiana benthamiana yapraklarında, kistler 3 saat 26'da epidermal hücreleri çimlendirdi ve kolonize etti. Arabidopsis köklerinde, tüm ansiklopedili zoosporlar, aşılamadan 6 saat sonra köklere başarıyla nüfuz etti27. Yaklaşımımızda, aşılama işlemi, köklerin karanlıkta 3 saat boyunca bir P. nicotianae zoospor süspansiyonuna daldırılmasını içeriyordu, bu da doğal çevreyi taklit ediyor ve patojenin kolonizasyonunu teşvik ediyor, böylece kararlı ve etkili enfeksiyona yol açıyor.
Tütünde P. nicotianae direncini değerlendirmek için en sık kullanılan yaklaşım olan yulaf taneleri yöntemi, çok sayıda bitkinin aşılanması için etkili ve kolaydır7,11,12,13,14,15,16. Ancak, bazı dezavantajları vardır. Ana dezavantaj, hassas ıslahta uygulamasını sınırlayan kontrolsüz aşılama yoğunluğudur. Yulaf taneleri yöntemi ve mevcut diğer iki yaklaşımla karşılaştırıldığında, bu yeni yaklaşımda, zoospor süspansiyonu inokülum olarak kullanılmaktadır, bu nedenle aşı yoğunluğu kontrol edilebilir ve ayarlanabilir. Bitkiler hidroponik bir ortamda kültürlendiğinden, toprağın müdahalesi ortadan kalkar ve bu da değerlendirme doğruluğunu arttırır. Bununla birlikte, bu yöntem için bir sınırlama vardır, bu da yetişkin bitkilerde kullanılamaz. Öte yandan, yulaf tanesi yöntemi, yetişkin bitkilerin büyük ölçekli direnç taraması için geçerlidir7,13. Bu nedenle, bu yöntem ve yulaf tanesi yöntemi, tütün bitkisinin farklı büyüme dönemlerinde ve farklı durumlarda birbirini tamamlayabilir.
Burada açıklanan protokol, tütünün fide aşamasında P. nicotianae tarafından enfeksiyona karşı direncini değerlendirmek için etkili ve güvenilir bir yöntemdir. Bu protokol üreme ve moleküler mekanizma araştırması için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31571738) ve Çin Tarım Bilimi ve Teknolojisi İnovasyon Programı (ASTIP-TRIC01) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm | 10002917 | Analytical Reagent |
| (NH4)6 Mo7O24•2 H2O | Sinopharm | XW131067681 | Analytical Reagent |
| 1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for Sample Extarction |
| 2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for Sample Extarction |
| Agar | MDBio, Inc | 9002-18-0 | Materials of Culture Medium |
| Analytical Balance | AOHAOSI | AX2202ZH | Equipment |
| Autoclave | Yamatuo | SQ510C | Equipment |
| Autoclave | YAMATUO | SQ510C | Equipment |
| Beaker | Bio Best | DHSB-2L | Materials of Culture Medium |
| Biological Incubator | JINGHONG | SHP-250 | Equipment |
| Ca(NO3)2•4 H2O | Sinopharm | 80029062 | Analytical Reagent |
| CaCl2 | Sinopharm | 10005817 | Analytical Reagent |
| CuSO4•5 H2O | Sinopharm | 10008218 | Analytical Reagent |
| Electromagnetic Oven | Bio Best | DHDCL | Equipment |
| FeSO4•7 H2O | Sinopharm | 10002918 | Analytical Reagent |
| Filter Paper | Bio Best | DHLZ-9CM | Material |
| Fluorescence Ration PCR Instrument | Roche | LightCycler96 | Equipment |
| Gauze | Bio Best | 17071202 | Materials of Culture Medium |
| H3BO3 | Phytotechnology | B210-500G | Analytical Reagent |
| Hemocytometer | Solarbio | 17072801 | Material for disease-resistant identification |
| K2SO4 | Sinopharm | 10017918 | Analytical Reagent |
| KNO3 | Sinopharm | 10017218 | Analytical Reagent |
| KT Foam Sheet | Bio Best | DHKTB | Material for Seedling |
| Low Constant Incubator | Jinghong | SHP-250 | Equipment |
| Measuring Cylinder | Bio Best | DHBLLT-1000ML | Materials of Culture Medium |
| MgSO4•7 H2O | Sinopharm | 10013080 | Analytical Reagent |
| Microscope | ECHO | RVL-100-G | Equipment |
| MnCl2•4 H2O | Sinopharm | G5468154 | Analytical Reagent |
| Na2-EDTA | Sinopharm | G21410-250 | Analytical Reagent |
| NaH2PO4•2 H2O | Sinopharm | 20040717 | Analytical Reagent |
| NH4NO3 | Sinopharm | B64586-100g | Analytical Reagent |
| Oatmeal | Bio Best | DHYMP-1.5KG | Materials of Culture Medium |
| Petri Dish | Bio Best | DHPYM-9CM | Material for disease-resistant identification |
| Pipettor | THERMO | S1 | Equipment |
| Potting | Bio Best | DHYCXHP-12CM | Material for Seedling |
| Potting Soil | Bio Best | DHYMJZ-50L | Seedling Material |
| Punch | Bio Best | DHDKW | Material |
| qRT-PCR Plate | Monad | MQ50401S | qRT-PCR Plate |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit | Accurate Biology | AG11718 | PCR Reagent |
| Toothpick | Bio Best | DHYQ-900 | Material |
| Total RNA Kit II | Omega | R6934-01 | PCR Reagent |
| TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix | Transgen | AH311-02 | PCR Reagent |
| Trays | Bio Best | DHYMTP-90G | Material for Seedling |
| Vermiculite | Bio Best | DHZS | Seedling Material |
| Water Purification System | HEAL FORCE | HSE68-2 | Equipment |
| ZnSO4•7 H2O | Sinopharm | 10024018 | Analytical Reagent |
References
- Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco. Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).
- Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates. Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).
- Amalia, B. R., José, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper. European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).
- Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum. Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).
- Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen. Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).
- Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers. Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).
- Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae. Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).
- Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold. Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).
- Csinos, A. S. Stem and root resistance to tobacco black shank. Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).
- Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold. Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).
- Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).
- Hernández, I., et al. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).
- Vontimitta, V., Lewis, R. S. Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' × 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae. Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).
- Xiao, B., et al. Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301. Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).
- McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000. Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).
- Zhang, Y., et al. Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1. The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).
- Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
- Ren, G., et al. GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , China Standard Press. Beijing. (2008).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).
- Yan, H. Z., Liou, R. F. Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica. Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).
- Chacón, O., Hernández, I., Portieles, R., López, Y., Pujol, M., Borrás-Hidalgo, O. Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease. Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).
- Vijay, V., Ramsey, S. L. Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000. Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).
- McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco. Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).
- Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region. Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).
- Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabières, F., Berre, J. -Y. L., Gourgues, M. Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration. New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).
- Huang, G., et al. An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants. Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).
- Agnès, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -T., Harald, K. The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection. New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).
