Area-based Image Analysis Algorithm zur Quantifizierung von Makrophagen-Fibroblasten-Kokulturen

Summary

Wir stellen eine Methode vor, die einen generalisierbaren flächenbasierten Bildanalyseansatz verwendet, um Zellzahlen zu identifizieren. Die Analyse verschiedener Zellpopulationen nutzte die signifikanten Zellhöhen- und Strukturunterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb eines adaptiven Algorithmus.

Abstract

Die Quantifizierung von Zellen ist für eine Vielzahl von biologischen und biochemischen Studien notwendig. Die konventionelle Bildanalyse von Zellen verwendet typischerweise entweder Fluoreszenzdetektionsansätze wie Immunfluoreszenzfärbung oder Transfektion mit fluoreszierenden Proteinen oder Kantendetektionstechniken, die aufgrund von Rauschen und anderen Nicht-Idealitäten im Bildhintergrund oft fehleranfällig sind.

Wir haben einen neuen Algorithmus entwickelt, der Makrophagen und Fibroblasten, Zellen verschiedener Phänotypen, die oft während der Geweberegeneration kolokalisieren, genau zählen und unterscheiden kann. MATLAB wurde verwendet, um den Algorithmus zu implementieren, der verschiedene Zelltypen basierend auf Höhenunterschieden vom Hintergrund unterscheidet. Ein primärer Algorithmus wurde unter Verwendung einer flächenbasierten Methode entwickelt, um Variationen in der Zellgröße / -struktur und die Bedingungen für die Aussaat mit hoher Dichte zu berücksichtigen.

Nicht-Idealitäten in Zellstrukturen wurden mit einem sekundären, iterativen Algorithmus berücksichtigt, der interne Parameter wie die Zellbedeckung verwendet, die unter Verwendung experimenteller Daten für einen bestimmten Zelltyp berechnet wurde. Schließlich wurde eine Analyse der Kokulturumgebungen mit einem Isolationsalgorithmus durchgeführt, bei dem verschiedene Zelltypen selektiv ausgeschlossen wurden, basierend auf der Bewertung der relativen Höhenunterschiede innerhalb des Bildes. Es wurde festgestellt, dass dieser Ansatz Zellen innerhalb einer Fehlerspanne von 5% für monokultivierte Zellen und innerhalb einer Fehlerspanne von 10% für kokultivierte Zellen genau zählt.

Introduction

Software wird routinemäßig während der Bildanalysetechniken implementiert, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse genau, effizient und unvoreingenommen sind. Bei zellbasierten Assays ist ein häufiges Problem die Fehlidentifizierung von Zellen. Bilder mit falschen Fokus- und Kontrasteinstellungen können zu Zellunschärfe führen, bei der die Grenze einzelner Zellen schwer zu identifizieren ist¹. Das Vorhandensein von Fremdbildmerkmalen wie Poren, Blasen oder anderen unerwünschten Objekten kann die Zählvorgänge behindern, indem es den Zählvorgang verlangsamt und zu einer falschen Identifizierung führt. Darüber hinaus kann das Zählen von Zellen müh....

Protocol

1. Zellkultur und Bilderfassung

1. Kultur RAW264.7 Makrophagen bei 37 °C und 5% CO₂ in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin, 1,5 g/L Natriumbicarbonat und 5 μM β-Mercaptoethanol.
   1. Für die Monokultur-Bildgebung Kultur RAW264.7 Zellen bei einer Dichte von 25.000 Zellen/^cm2 in einem 5 ml Zellkulturkolben mit 1 ml Medium.
2. Kultur NIH/3T3-Zellen bei 37 °C und 5% CO₂ in DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin¹¹.
3. Für die Kokulturbildgebung werden Kultur....

Results

Die Analyse von nicht-bauchigen RAW264.7-Makrophagen wurde in einer Monokulturumgebung bei 25.000 Zellen/cm² durchgeführt. Repräsentative Bilder der Zellkultur wurden aufgenommen und in MATLAB nach der Konvertierung in 8-Bit-Tiff in ImageJ verarbeitet. Algorithmusausgaben während des gesamten Prozesses wurden aufgezeichnet und in Abbildung 2 für das repräsentative Bild dokumentiert. In diesem Bild zählte der Algorithmus 226 Zellen, und diese Bildanzahl wurde durch Vergleich mit ei.......

Discussion

Wir haben ein allgemeines flächenbasiertes Verfahren entwickelt, das Zellen auf der Grundlage der Zellgröße genau und effizient zählt und so eine fleckenfreie Quantifizierung von Zellen auch in Kokultursystemen ermöglicht. Kritische Schritte für dieses Verfahren waren die Implementierung eines relativen Intensitätssystems, mit dem Zellen differenziert werden konnten. Die Verwendung einer relativen Höhenanalyse diente zwei Zwecken: Die Notwendigkeit externer Parameter wurde überflüssig, da die relativen Parameter für den .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 Inverses Mikroskop	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Zellschaber	CellTreat	229310
Dublecco's modifiziertes Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher	Scientific 14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Zellen	ATCC	ATCC CRL - 1658
Penicillin– Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Zellen	ATCC	ATCC TIB - 71
Natriumbicarbonat	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Zellkulturflasche	Corning	CLS3814-24EA