Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Knochenmarkabstrichen des Multiplen Myeloms

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Verbesserung des Erfolgs des Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsnachweises bei Knochenmarkabstrichen von Patienten mit multiplem Myelom vor.

Zusammenfassung

Der Nachweis der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine unverzichtbare Methode bei der genetischen Risikostratifizierung beim multiplen Myelom (MM), einem der häufigsten hämatologischen Malignome. Das identifizierende Merkmal von MM sind angesammelte bösartige Plasmazellen im Knochenmark. FISH-Berichte für MM konzentrieren sich hauptsächlich auf gereinigte oder identifizierte klonale Plasmazellen und nicht auf alle kernhaltigen Zellen, indem sie mit Anti-CD138-Magnetkügelchen sortiert oder mit zytoplasmatischer Immunglobulin-Leichtkette κ oder λ markiert werden. Knochenmark-Interphasenkerne werden in der Regel aus frischen Knochenmarkzellen gewonnen. Eine zufriedenstellende Anreicherung von Plasmazellproben erfordert jedoch große Mengen an frischem Heparin-antikoaguliertem Knochenmark, das bei schwieriger Knochenmarkextraktion oder einem trockenen Knochenmarkhahn nicht erhalten werden kann. Hierin etablieren wir eine neuartige Methode, um den Erfolg des FISH-Nachweises auf gefärbten oder ungefärbten Knochenmarkabstrichen zu verbessern. Knochenmarkabstriche sind leichter zu erhalten als antikoagulierte Knochenmarkproben.

Einleitung

Das Multiple Myelom (MM) ist eine maligne Plasmazellerkrankung (PC) mit starker biologischer Heterogenität und großen individuellen Unterschieden in der klinischen Wirksamkeit, mit Überlebenszeiten von Monaten bis Jahrzehnten. Zytogenetische Merkmale sind wichtige prognostische Indikatoren für MM. Das Risikostratifizierungssystem und individualisierte Behandlungen, die auf genetischen Merkmalen basieren, sind zu Themen von intensivem Interesse in der klinischen Forschung zu ^MM1 geworden. Zu den Aberrationen von PCs, die in einem Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungspanel (FISH) aus Knochenmark (BM) getestet wurden, gehören del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) Verstärkung/Verstärkung und 1p (CDKN2C) Deletion.

Die Standard-Metaphasenzytogenetik sollte in die Erstbeurteilung von MM-Patienten einbezogen werden. Obwohl die konventionelle G-Band-Karyotypisierung den Vorteil einer Ganzchromosomenanalyse bietet, führt die geringe Ausbeute dieser Methode zu vielen falsch negativen ^{Ergebnissen2.} Traditionell wurden PCs als weitgehend unfähig zur Spaltung angesehen, da sie die Endprodukte der B-Lymphozyten-Differenzierung sind. Dies macht es schwierig, geteilte Bilder zu erhalten. Eine verbesserte zytogenetische Analyse in MM mit Langzeitkulturen (6 Tage) und die Stimulation von Kulturen durch Zytokine können eine vielversprechende Methode zur Identifizierung zytogenetischer Anomalien bei neu diagnostizierten MM-Patienten ^sein3. Selbst wenn die Kulturzeit auf 6 Tage verlängert wurde, wurden zytogenetische Anomalien bei 30%-50% der MM-Patienten genau ^berichtet4. Darüber hinaus zeichnet sich MM durch komplexe zytogenetische Aberrationen aus, die seine prognostische Heterogenität widerspiegeln. Die Auflösung der traditionellen Chromosomenbanding-Technologie ist jedoch gering, was leicht zu einer verpassten Erkennung von Chromosomenanomalien in MM führen kann.

Interphase FISH, vorzugsweise nach CD138-positiver magnetischer Perlen-basierter PC-Sortierung oder Markierung mit zytoplasmatischer Immunglobulin-Leichtkette κ/λ, ist bei der Analyse von ^MM5,6 unverzichtbar. Für die optimierte Ausbeute an Tumorzellen wird dringend eine CD138-positive ausgewählte Probe empfohlen. Die genaue Quantifizierung zytogenetischer Aberrationen erfordert jedoch mindestens 4 ml antikoaguliertes BM für die PC-Sortierung. Darüber hinaus erhöhen die Kombinationen von entweder CD138-Immunmagnetperlensortierung mit FISH oder zytoplasmatischem κ/λ-Leichtketten-Immunglobulin mit FISH-Test (cIg-FISH) zahlreiche experimentelle Kosten und sind zeitaufwendig.

In der Regel wird das PC-Verhältnis zunächst aus der morphologischen Untersuchung von gefärbten BM-Abstrichen oder BM-Biopsieabschnitten ^beurteilt7,8. BM-Proben von höchster Qualität (erste Markaspiratproben) werden für morphologische Tests verwendet, während diejenigen, die zum FISH- oder anderen Nachweis geschickt werden, oft die sekundären Aspiratproben mit hohen Verdünnungsverhältnissen mit peripherem Blut sind.

Bereits in den 1990er Jahren zeigten mehrere Studien, dass BM-Abstriche direkt für interstitielle FISH-Untersuchungen verwendet werden können, was sich als zuverlässige und wiederholbare Methode erwiesen ^hat9. Eine elegante Studie, die auf Zellmorphologie und Esterasezytochemie in Kombination mit FISH aus peripherem Blut und BM-Abstrichen basierte, bestätigte ihre große klinische Bedeutung für die Aufklärung von Chromosomenanomalien bei Patienten mit granulozytärer und lymphatischer ^Leukämie10.

Hierin stellen wir eine neuartige Methode zur Verfügung, um den Erfolg des Interphasen-FISH-Detektions bei MM-Patienten zu verbessern.

Protokoll

Diese Studie wurde nach den Grundsätzen der Helsinki-Erklärung durchgeführt und von der Ethikkommission des Zhongnan-Krankenhauses der Universität Wuhan (Nr. 2019065) genehmigt. Die Proben wurden von einem MM-Patienten in der Abteilung für Hämatologie des Zhongnan-Krankenhauses der Universität Wuhan (China) entnommen.

1. Vorbereitung der BM-Abstriche

1. Legen Sie die ersten 0,2 ml BM-Lösung auf einen sauberen Einweg-Glasobjektträger.
2. Verteilen Sie die BM-Abstriche auf gleichmäßige Dicke mit scharfen Schwänzen, indem Sie den BM schnell entfernen. Dann natürlich trocknen.
3. Decken Sie die BM-Folien mit 1 ml Wright-Giemsa-Lösung für ca. 10 s bei Raumtemperatur ab.
4. Fügen Sie 1 ml Phosphatpuffer zu den Objektträgern hinzu.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Farbstofflösung nicht austrocknet oder von den Objektträgern abfließt.
5. Mischen Sie die Farbstofflösung vorsichtig und halten Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Spülen Sie die Objektträger mit sauberem Wasser ab und trocknen Sie sie an der Luft bei Raumtemperatur.
7. Verwenden Sie die Vorwärtslichtmikroskopie, um bösartige PCs zu erkennen. Die PCs sollten gut verteilt sein.

2. FISH-Vorverarbeitung der BM-Abstriche

1. Decken Sie den hybridisierten Bereich 10 Minuten lang mit Fixierlösung ab, um die PCs zu verfärben und zu fixieren.
   1. Zur Herstellung einer frischen Fixierlösung mischen Sie Methanol mit Eisessigsäure in einem Volumenverhältnis von 3:1.
2. Spülen Sie den Objektträger mit entionisiertem Wasser (_dH2O) ab und trocknen Sie ihn an der Luft bei Raumtemperatur.
3. Ein Glas mit 2x SSC-Puffer in einem Wasserbad auf 56 °C vorheizen. Verdünnen Sie den Puffer vor Gebrauch frisch auf 20x SSC.
   1. Um 20x SSC herzustellen, mischen Sie 176 g Natriumchlorid und 88 g Natriumcitrat gründlich mit 800 ml _dH2O. Messen Sie den pH-Wert und stellen Sie ihn auf pH 5,3 ± 0,2 ein. Fügen Sie dann _dH2O hinzu, um das endgültige Volumen auf 1 L zu bringen.
4. Waschen Sie den vorbereiteten BM-Abstrich im vorgewärmten 2x SSC-Puffer für 10 min, gefolgt von einem Eintauchen in deionisiertes Wasser bei Raumtemperatur.
5. Dehydrieren Sie den Abstrich in einem Ethanolgradienten (70%, 85% und 100% Ethanol, jeweils für 1 min). Trocknen Sie den Abstrich 10 Minuten lang an der Luft.

3. BM Abstrich FISH und Waschen

HINWEIS: Alle Schritte wurden in einem dunklen Raum durchgeführt, um eine Fluoreszenzlöschung zu verhindern.

1. Fügen Sie das TP53 / Zentromer des Chromosoms 17 (CEP17) Sondenmischung in den Hybridisierungsbereich hinzu und bedecken Sie es mit einem Deckglas. Drücken Sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette, um Luftblasen von unten zu entfernen.
2. Versiegeln Sie alle Seiten des Deckglases mit Gummizement, um eine gute Dichtheit zu gewährleisten.
3. Nach dem Erstarren des Gummizements den Schlitten auf eine automatische FISH-Maschine legen. Denaturierung bei 78 °C für 5 min, gefolgt von Hybridisierung bei 37 °C über Nacht.
4. Nehmen Sie die Folie von der FISH-Maschine auf. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um den Gummizement vorsichtig zu entfernen.
5. Tauchen Sie die Rutsche in 2x SSC bei Raumtemperatur für ca. 1 oder 2 min ein, um den Deckglas abzuwaschen.
6. Waschen Sie den Objektträger in 68 °C vorgewärmtem 0,4x SSC/0,3% NP-40 Puffer in einem Wasserbad für 2 min.
   1. Bereiten Sie 0,4x SSC / 0,3% NP-40-Lösung vor, indem Sie 20 ml 20x SSC (pH 5,3) gründlich mit 950 ml _dH2O mischen. Dann fügen Sie 3 ml NP-40 hinzu und mischen Sie gründlich, bis sie vollständig aufgelöst sind. Messen Sie den pH-Wert und stellen Sie ihn mit NaOH auf 7,0-7,5 ein. Fügen Sie dann _dH2O hinzu, um das endgültige Volumen der Gesamtlösung auf 1 L zu bringen.
7. Waschen Sie die Dias mit 2x SSC in einem 37 °C warmen Wasserbad für 1 min. Im Dunkeln aufrecht aufgestellt, um 10 min gründlich zu trocknen.
8. Geben Sie 10 μL DAPI in den hybridisierten Bereich und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab.

4. FISH-Analyse und Bildgebung

1. Betrachten Sie den hybridisierten Objektträger mit einem geeigneten Filterset auf einem Fluoreszenzmikroskop.
2. Verwenden Sie einen monochromatischen blauen fluorophoren optischen Filter, um die Fluoreszenzintensität des Zellkerns zu beobachten. Nehmen Sie Zellkernbilder unter einem DAPI-Filtersatz auf.
3. Verwenden Sie eine Chromosomenzentromersonde, um zu zeigen, wie viele Chromosomen eine Zelle enthält. Kennzeichnen Sie CEP17 mit grüner Fluoreszenz. Verwenden Sie einen optischen Spektrumfilter für grünes Fluorophor, um den Standort von CEP17 zu beobachten. Nehmen Sie ein CEP17-Signalbild unter dem grünen Filterset auf.
4. Kennzeichnen Sie das TP53-Gen mit oranger Fluoreszenz. Verwenden Sie einen optischen Fluorophorfilter mit Spektrum, um TP53 zu beobachten. Nehmen Sie ein TP53-Signalbild unter diesem Set auf.
5. Führen Sie diese drei Bilder zusammen und untersuchen Sie sie auf numerische Anomalien.
   HINWEIS: In einer normalen Interphasenzelle werden zwei orange und zwei grüne Signale in einem Kern mit blauer Fluoreszenz beobachtet, was auf ein Paar des normalen Chromosoms 17 hinweist (Abbildung 1).

Ergebnisse

In der ersten morphologischen Beurteilung eines neu diagnostizierten MM-Patienten wurde festgestellt, dass 15% der PCs in einem BM-Abstrich größere und dunklere Kerne zusammen mit größeren Mengen an Zytoplasma als normale PCs aufwiesen (Abbildung 2A). Die erste Röhre von Heparin antikoaguliertem BM, die mit der Immunphänotyp-Technik nachgewiesen wurde, zeigte nur 2,3% der monoklonalen aberranten PCs. Die CD138-Immunperlensortierung in Kombination mit FISH oder der cIg-FISH-Technik ist für di...

Diskussion

Die Anwendung von FISH auf die genetische Risikostratifizierung in MM ist von wesentlicher Bedeutung. Der kritische Teil der FISH-Berichte sind nicht alle kernhaltigen Zellen, sondern klonale PCs, die spezifisch gereinigt oder identifiziert wurden, indem sie mit Anti-CD138-Magnetkügelchen sortiert oder markiert wurden. Interphase FISH nach PC-Sortierung oder cIg-FISH erwies sich aufgrund des relativ geringen Anteils an PCs im BM als signifikant bei der Diagnose von MM. Diese Methoden weisen jedoch einige Mängel auf, daru...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
automatische FISH-Maschine	Leica  Corporation	S500-24	FINAL Assy Thermobrite 240V
DAPI	Abbott Molecular Inc.	06J49-001	DAPI Counterstain
FISH-Analysesoftware	IMSTAR  Unternehmen	IMSTAR	FISH Analysesoftware
FISH-Sonde	Abbott Molecular Inc.	05N56-020	Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit
Pipette mit festem Volumen	Eppendorf China Ltd.	M33768H	10  Mikroliter
Fluoreszenzmikroskop	Olympus Corporation	BX53	Vorwärtsfluoreszenzmikroskop
Karyotyp-Analysesoftware	IMSTAR  Unternehmen	IMSTAR	Karyotyp-Analysesoftware
Lichtmikroskop	Olympus  Unternehmen	BX41	Vorwärtslichtmikroskop
NP-40	Abbott Molecular Inc.	07J05-001	NP-40
Färbegestell	aus Kunststoff Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.	RSJ-501	24 Folien
Kunststofffärbung Färbetank	Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.	RSJ-516	24 Rutschen
Gummi Zement	Marabu   GmbH & Co. KG	FixoGum	Gummi-Zement
SSC	Abbott Molecular Inc.	02J10-032	20 mal SSC
Wasserbad	Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.	DK-8D	Wasserbad mit mehreren Temperaturen