Für die Extraktion von Leberglykogen wurde mittels Saccharosedichtegradientenzentrifugation eine optimale Saccharosekonzentration bestimmt. Die Zugabe eines 10-minütigen Siedeschritts zur Hemmung von Glykogen-abbauenden Enzymen erwies sich als vorteilhaft.
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Methodenartikel
Die Extraktion von Leberglykogenmolekülen zur Glykogenstrukturbestimmung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Leberglykogen ist ein hyperverzweigtes Glukosepolymer, das an der Aufrechterhaltung des Blutzuckerspiegels bei Tieren beteiligt ist. Die Eigenschaften von Glykogen werden durch seine Struktur beeinflusst. Daher ist eine geeignete Extraktionsmethode, die repräsentative Glykogenproben isoliert, für die Untersuchung dieses Makromoleküls von entscheidender Bedeutung. Im Vergleich zu anderen Extraktionsmethoden kann eine Methode, die einen Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugationsschritt verwendet, molekulare Schäden minimieren. Basierend auf dieser Methode wird in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung beschrieben, wie die Dichte der während der Zentrifugation verwendeten Saccharoselösung variiert wurde (30 %, 50 %, 72,5 %), um die am besten geeignete Konzentration zur Extraktion von Glykogenpartikeln einer Vielzahl von Größen zu finden und den Verlust kleinerer Partikel zu begrenzen. Ein 10-minütiger Siedeschritt wurde eingeführt, um seine Fähigkeit zu testen, Glykogen abbauende Enzyme zu denaturieren und so Glykogen zu erhalten. Es wurde gezeigt, dass die niedrigste Saccharosekonzentration (30 %) und die Zugabe des Siedeschritts die repräsentativsten Glykogenproben extrahieren.
Einleitung
Glykogen ist ein komplexes, hyperverzweigtes Glukosepolymer, das in Tieren, Pilzen und Bakterien vorkommt1. Bei Säugetieren fungiert das Glykogen der Leber als Blutzuckerpuffer und erhält die Homöostase, während das Muskelglykogen als kurzfristiges Glukosereservoir fungiert, um Energie direkt bereitzustellen2. Die Struktur von Glykogen wird häufig durch drei Ebenen beschrieben (siehe Abbildung 1): 1. Lineare Ketten werden von Glukosemonomeren über (1→4)-α glykosidische Bindungen gebildet, wobei Verzweigungspunkte über (1→6)-α glykosidische Bindungen verbunden sind; 2. stark verzweigte β Part....
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Protokoll
Die zur Optimierung dieses Verfahrens verwendeten Mäuseleber21 stammten von 12 männlichen BKS-DB/Nju-Hintergrundmäusen (7,2 Wochen alt, siehe Materialtabelle). Die Verwendung von Tieren wurde vom Renmin Hospital of Wuhan University Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue No. WDRM 20181113.
1 Tierische Gewebe
- Mäuseleber wiegen (1-1,8 g ganze Leber von jeder Maus).
- Die Mäuseleber schnell in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
2. Herstellung von Puffer und Reagenzien
- Bereiten Sie einen Glykogenisolationspuffer mit 5....
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Ergebnisse
Während das oben beschriebene Verfahren für die optimalste Methode (30 % Saccharose unter Zugabe eines 10-minütigen Siedeschritts) gilt, werden hier Daten für Glykogen bereitgestellt, das über drei Saccharosekonzentrationen (30 %, 50 %, 72,5 %) mit und ohne Siedeschritt extrahiert wurde, wie zuvor beschrieben21. Gemäß dem Protokoll sind die Reinheit, die Rohausbeute und die Glykogenausbeute von trockenem Glykogen, das unter verschiedenen Bedingungen extrahiert wurde, in Tabelle 1 .......
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Diskussion
Frühere Studien haben gezeigt, dass die Struktur von Glykogen wichtig für seine Eigenschaften ist; Zum Beispiel beeinflusst die Molekülgröße die Abbaurate von Glykogen10 und die Verteilung der Kettenlänge seine Löslichkeit26. Um diese Zusammenhänge richtig zu verstehen, ist es wichtig, Glykogen mit einem Verfahren zu extrahieren, das so weit wie möglich eine repräsentative und unbeschädigte Probe isoliert. Traditionelle Extraktionsmethoden verwendeten entweder heiße alkalis.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren danken Herrn Gaosheng Wu und Frau Yunwen Zhu für die technische Unterstützung bei FACE und Herrn Zhenxia Hu und Herrn Dengbin für die technische Unterstützung bei der SEC. MAS wird durch ein Advance Queensland Industry Research Fellowship, die Mater Foundation, Equity Trustees und die L G McCallam Est und George Weaber Trusts unterstützt. Diese Arbeit wurde durch das Priority Academic Program of Jiangsu Higher Education Institutions, ein Stipendium der Natural Science Foundation of China C1304013151101138 und das Jiangsu Innovation and Entrepreneurship Talents Program 2017 unterstützt. Die Abbildungen 1-5 ....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 8-Aminopyren-1,3,6-trisulfonat (APTS) | SIGMA Aldrich | 9341 | 0,1 M Lösung |
| Essigsäure | SIGMA Aldrich | 695092 | 0,1 M, pH 3,5 Lösung |
| Agilent 1260 Infinity SEC System Agilent | , Santa Clara, CA, USA | Größenausschlusschromatographie (SEC) | |
| BKS-DB/Nju Hintergrundmäuse | Nanjing Biomedizinische Forschungseinrichtung der Universität Nanjing | ||
| D-Glucose Assay Kit (GOPOD-Format) | Megazyme | K-GLUC | |
| Ethylenedinitrilotetraessigsäure (EDTA) | SIGMA Aldrich | 431788 | |
| Homogenisator | IKA | T 25 | |
| Salzsäure | SIGMA Aldrich | 2104 | 0,1 M Lösung |
| Salzsäure | SIGMA Aldrich | 2104 | 0,1 M Lösung |
| P/ACE MDQ plus System | Ab Sciex, US | Fluorophor-unterstützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE) | |
| Brechungsindex-Detektor | Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) | Größenausschlusschromatographie (SEC) | |
| Natriumacetat | SIGMA Aldrich | 241245 | 1 M, pH 4,5 Lösung |
| Natriumazid | SIGMA Aldrich | S2002 | |
| Natriumchlorid | SIGMA Aldrich | S9888 | |
| Natriumcyanoborohydrid | SIGMA Aldrich | 156159 | 1 M Lösung |
| Natriumfluorid | SIGMA Aldrich | 201154 | |
| Natriumhydroxid | SIGMA Aldrich | 43617 | 0,1 M Lösung |
| Natriumnitrat | SIGMA Aldrich | NISTRM8569 | |
| Natriumpyrophosphat | SIGMA Aldrich | 221368 | |
| Saccharose | SIGMA Aldrich | V90016 | |
| SUPREMA Vorsäule, 1.000 und 10.000 Säulen | Polymer Standards Services, Mainz, Deutschland | Größenausschlusschromatographie (SEC) | |
| Trizma | SIGMA Aldrich T | 1503 | |
| Ultrazentrifugenröhrchen | Beckman | 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Röhrchen, 11 x 60 mm |
Referenzen
- Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. Life: the science of biology. 12th edn. Freeeman, W. H. , (2020).
- Calder, P. C., Geddes, R. Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle. Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).
- Rybicka, K. K.
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Nachdrucke und Genehmigungen
