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Methodenartikel

Die Extraktion von Leberglykogenmolekülen zur Glykogenstrukturbestimmung

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DOI:

10.3791/63088

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8. Februar 2022

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, 2Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, 3Jiangsu Provincial Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 4Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 5Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 6Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, 7Glycation and Diabetes Group, Mater Research Institute-The University of Queensland, Translational Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Für die Extraktion von Leberglykogen wurde mittels Saccharosedichtegradientenzentrifugation eine optimale Saccharosekonzentration bestimmt. Die Zugabe eines 10-minütigen Siedeschritts zur Hemmung von Glykogen-abbauenden Enzymen erwies sich als vorteilhaft.

Zusammenfassung

Leberglykogen ist ein hyperverzweigtes Glukosepolymer, das an der Aufrechterhaltung des Blutzuckerspiegels bei Tieren beteiligt ist. Die Eigenschaften von Glykogen werden durch seine Struktur beeinflusst. Daher ist eine geeignete Extraktionsmethode, die repräsentative Glykogenproben isoliert, für die Untersuchung dieses Makromoleküls von entscheidender Bedeutung. Im Vergleich zu anderen Extraktionsmethoden kann eine Methode, die einen Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugationsschritt verwendet, molekulare Schäden minimieren. Basierend auf dieser Methode wird in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung beschrieben, wie die Dichte der während der Zentrifugation verwendeten Saccharoselösung variiert wurde (30 %, 50 %, 72,5 %), um die am besten geeignete Konzentration zur Extraktion von Glykogenpartikeln einer Vielzahl von Größen zu finden und den Verlust kleinerer Partikel zu begrenzen. Ein 10-minütiger Siedeschritt wurde eingeführt, um seine Fähigkeit zu testen, Glykogen abbauende Enzyme zu denaturieren und so Glykogen zu erhalten. Es wurde gezeigt, dass die niedrigste Saccharosekonzentration (30 %) und die Zugabe des Siedeschritts die repräsentativsten Glykogenproben extrahieren.

Einleitung

Glykogen ist ein komplexes, hyperverzweigtes Glukosepolymer, das in Tieren, Pilzen und Bakterien vorkommt1. Bei Säugetieren fungiert das Glykogen der Leber als Blutzuckerpuffer und erhält die Homöostase, während das Muskelglykogen als kurzfristiges Glukosereservoir fungiert, um Energie direkt bereitzustellen2. Die Struktur von Glykogen wird häufig durch drei Ebenen beschrieben (siehe Abbildung 1): 1. Lineare Ketten werden von Glukosemonomeren über (1→4)-α glykosidische Bindungen gebildet, wobei Verzweigungspunkte über (1→6)-α glykosidische Bindungen verbunden sind; 2. stark verzweigte β Partikel (~20 nm Durchmesser), die, insbesondere in Geweben wie der Skelettmuskulatur, als unabhängige Glykogenmoleküle wirken 3,4; 3. Größere α Glykogenpartikel (bis zu 300 nm Durchmesser), die aus kleineren β Glykogeneinheiten bestehen, die in der Leber5, im Herzen6 und in einigen Nicht-Säugetierarten7 vorkommen. Leber-α-Partikel von diabetischen Mäusen sind molekular zerbrechlich und neigen dazu, zu β-Partikeln abgebaut zu werden, wenn sie in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst werden, während α Partikel von nicht-diabetischen Kontrollen im Allgemeinen unverändert bleiben. Eine Hypothese ist, dass diese Fragilität den schlechten Blutzuckerhaushalt bei Diabetes verschlimmern kann, wobei die empfindlichen α Partikel möglicherweise zu höheren Anteilen der schneller abbaubaren β Partikel 8,9,10,11 führen.

Herkömmliche Glykogenextraktionsmethoden nutzen die relativ rauen Bedingungen, bei denen das Lebergewebe heißer alkalischer Lösung12 oder sauren Lösungen wie Trichloressigsäure (TCA)13 oder Perchlorsäure (PCA)14 ausgesetzt wird. Diese Methoden sind zwar wirksam bei der Trennung des Glykogens von anderen Bestandteilen des Lebergewebes, bauen aber unweigerlich die Glykogenstruktur bis zu einem gewissen Grad ab15,16. Obwohl diese Methoden für die quantitative Messung des Glykogengehalts geeignet sind, sind sie aufgrund dieser strukturellen Schädigung nicht ideal für Studien, die sich auf die Gewinnung struktureller Informationen über das Glykogen konzentrieren. Seit der Entwicklung dieser Methoden wurde ein milderes Extraktionsverfahren entwickelt, bei dem kalter Tris-Puffer (der nachweislich den Glucosidaseabbau hemmt) mit Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation verwendetwird 17,18,19. Da der pH-Wert auf ~8 eingestellt ist, wird das Glykogen bei dieser Methode nicht der sauren oder alkalischen Hydrolyse ausgesetzt, die bei früheren Verfahren beobachtet wurde.

Die Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation von homogenisiertem Lebergewebe kann Glykogenpartikel vom Großteil des Zellmaterials trennen. Falls erforderlich, kann eine zusätzliche Reinigung durch präparative Größenausschlusschromatographie durchgeführt werden, was zur Sammlung von gereinigtem Glykogen mit angehängten Glykogen-assoziierten Proteinenführt 20. Obwohl diese Methode unter milderen Bedingungen die Struktur des Glykogens eher bewahrt, ist es schwierig zu verhindern, dass ein Teil des Glykogens im Überstand verloren geht, insbesondere bei kleineren Glykogenpartikeln, die weniger dicht sind15. Eine weitere mögliche Ursache für den Glykogenverlust ist, dass die milderen Bedingungen einen gewissen enzymatischen Abbau ermöglichen, was im Vergleich zu härteren Extraktionsmethoden zu niedrigeren Glykogenausbeuten führt. Neuere Forschungen berichteten über die Optimierung der Leber-Glykogen-Extraktionsmethode, um die Struktur von Glykogen21 zu erhalten. Hier wurden verschiedene Saccharosekonzentrationen (30 %, 50 %, 72,5 %) getestet, um festzustellen, ob niedrigere Saccharosekonzentrationen den Verlust kleinerer Glykogenpartikel minimieren. Der Grundgedanke war, dass die geringere Dichte es kleineren, weniger dichten Partikeln ermöglichen würde, die Saccharoseschicht zu durchdringen und sich mit dem Rest des Glykogens im Pellet zu aggregieren.

In dieser Studie wurden die Extraktionsmethoden mit und ohne einen 10-minütigen Siedeschritt verglichen, um zu testen, ob Glykogenabbauenzyme denaturiert werden können, was zur Extraktion von mehr Glykogen führt, das auch frei von teilweisem Abbau ist. Zur Bestimmung der Struktur des extrahierten Glykogens wurden ganze Molekülgrößenverteilungen und die Längenverteilungen der Glykogenkette verwendet, ähnlich einer zuvor veröffentlichten Optimierung der Stärkeextraktion22. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) mit differentiellem Brechungsindex (DRI) wurde verwendet, um die Größenverteilungen von Glykogen zu erhalten, die das Gesamtmolekulargewicht als Funktion der Molekülgröße beschreiben. Die Fluorophor-gestützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE) wurde verwendet, um die Kettenlängenverteilungen zu analysieren, die die relative Anzahl der Glucosidketten jeder bestimmten Größe (oder jedes Polymerisationsgrades) beschreiben. In diesem Artikel wird die Methodik zur Extraktion von Glykogen aus Lebergewebe beschrieben, die auf der vorherigen Optimierungsstudie21 basiert. Die Daten deuten darauf hin, dass die Methode, die am besten geeignet ist, um die Glykogenstruktur zu erhalten, eine Saccharosekonzentration von 30 % mit einem 10-minütigen Siedeschritt ist.

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Protokoll

Die zur Optimierung dieses Verfahrens verwendeten Mäuseleber21 stammten von 12 männlichen BKS-DB/Nju-Hintergrundmäusen (7,2 Wochen alt, siehe Materialtabelle). Die Verwendung von Tieren wurde vom Renmin Hospital of Wuhan University Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue No. WDRM 20181113.

1 Tierische Gewebe

  1. Mäuseleber wiegen (1-1,8 g ganze Leber von jeder Maus).
  2. Die Mäuseleber schnell in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.

2. Herstellung von Puffer und Reagenzien

  1. Bereiten Sie einen Glykogenisolationspuffer mit 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF und 5 mM Natriumpyrophosphat mit deionisiertem Wasser vor und stellen Sie den pH-Wert auf 8 ein.
  2. Bereiten Sie 30%ige (w/w) Saccharoselösung vor (die sich als am optimalsten für Leberglykogen21 erwiesen hat).
  3. Natriumacetatpuffer (1 M, pH 4,5), Essigsäurepuffer (0,1 M, pH 3,5), Natronlauge (0,1 M) und Natriumcyanoborhydrid (1 M) herstellen.
  4. Bereiten Sie 8-Aminopyren-1,3,6-trisulfonat (APTS)-Lösung vor, indem Sie 5 mg APTS zu 50 μl 15%iger Eisessigsäure hinzufügen.
  5. Ammoniumnitratlösung mit 50 mM Ammoniumnitrat mit 0,02 % Natriumazid herstellen.

3. Glykogenextraktion (Abbildung 2)

  1. Das gefrorene Lebergewebe (~1 g) wird in ein 15-ml-Röhrchen mit 6 ml Glykogenisolationspuffer überführt.
  2. Halten Sie es auf Eis und homogenisieren Sie das Lebergewebe mit einem Gewebehomogenisator.
  3. Die Hälfte der Suspension (3 ml) wird in ein neues Röhrchen überführt und 10 Minuten lang gekocht (was sich als optimal für Glykogenstrukturstudien erwiesen hat21). Bewahren Sie die andere Hälfte der Suspension (3 ml) auf Eis auf, um Glykogen zu extrahieren, das assoziierte Proteine enthält, die nicht denaturiert sind.
    HINWEIS: Ungekochte Proben sollten während der Glykogenextraktion immer auf Eis gelegt werden. Wenn Glykogenproteine für die Untersuchung nicht wichtig sind, kann die gesamte Probe dem 10-minütigen Kochschritt unterzogen werden.
  4. Entnehmen Sie ein 8-μl-Aliquot aus jedem Röhrchen, bewahren Sie die Aliquoten auf Eis auf und verwenden Sie sie für die Bestimmung des Glykogengehalts (siehe Abschnitt 4).
  5. Die restliche Suspension wird bei 6.000 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
  6. Die Überstände werden in Ultrazentrifugenröhrchen überführt und bei 3,6 × 10,5g 90 min bei 4 °C zentrifugiert. 
  7. Verwerfen Sie die verbleibenden Überstände und resuspendieren Sie die Pellets in 1,5 ml Glykogenisolationspuffer.
  8. Die Proben werden über 1,5 ml 30%ige Saccharoselösung in 4-ml-Ultrazentrifugenröhrchen geschichtet und bei 3,6 × 105 g für 2 h bei 4 °C zentrifugiert.
  9. Die verbleibenden Überstände werden verworfen und die Pellets in 200 μl deionisiertem Wasser resuspendiert.
  10. Den Suspensionen werden 800 μl absolutes Ethanol zugegeben und gut vermischt, um Glykogen23,24 auszufällen. Lagern Sie die Mischungen mindestens 1 h bei -20 °C, damit sie ausfällen können.
  11. Die Proben werden bei 6.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie die Überstände und resuspendieren Sie die Pellets in 200 μl deionisiertem Wasser.
  12. Wiederholen Sie diesen Ethanolfällungsprozess 3x und resuspendieren Sie das endgültige Glykogenpellet in 200 μl deionisiertem Wasser.
  13. Entnehmen Sie ein Aliquot von 8 μl aus jedem Röhrchen, um den Glykogengehalt zu bestimmen (siehe Abschnitt 4).
  14. Die restlichen Überstände in flüssigem Stickstoff einfrieren und über Nacht gefriertrocknen (gefriergetrocknet). Lagern Sie die trockenen Glykogenproben im Gefrierschrank bei -20 °C.
    HINWEIS: Die trockenen Glykogenproben sollten bei -20 °C stabil sein. Es gibt jedoch keine Daten darüber, wie lange sie ohne strukturelle Veränderungen andauern.

4. Bestimmung des Glykogengehalts (Abbildung 3)

  1. 8 μl der Glykogenüberstände (siehe Abschnitte 3.13 und 3.4), 5 μl Amyloglucosidase (3269 U/ml) und 100 μl Natriumacetatpuffer (1 m, pH 4,5) werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und das Röhrchen bis zur 500-μl-Markierung mit deionisiertem Wasser gefüllt.
  2. Bereiten Sie Kontrollen vor, die deionisiertes Wasser anstelle von Amyloglucosidase verwenden.
  3. Die Proben werden 30 Minuten lang bei 50 °C inkubiert, während die Kontrollen auf Eis bleiben.
  4. Bei 6.000 × g bei 4 °C 10 min zentrifugieren und 300 μl jedes resultierenden Überstandes mit 1 ml Glucosidase-Oxidase/Peroxidase-Reagenz (GOPOD) mischen.
  5. Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve, indem Sie 300 μl denionisiertes Wasser mit 0, 10, 20, 30, 40 und 50 μg D-Glucose mit 1 ml GOPOD-Reagenz mischen.
  6. Die Mischungen bei 50 °C weitere 30 min inkubieren.
  7. Lesen Sie die Absorption (510 nm) jeder Probe mit 96-Well-Platten (150 μl pro Well) mit einem UV-Vis-Spektralphotometer ab.
  8. Subtrahieren Sie die Absorptionen von Kontrollproben (ohne Amyloglucosidase) von den Absorptionen der experimentellen Proben und berechnen Sie dann den Glykogengehalt auf der Grundlage der D-Glukose-Standardkurve.

5. Rohölausbeute, Glykogenausbeute und Reinheitsbestimmung

  1. Für die Rohausbeute wird die gefriergetrocknete Glykogenprobe gewogen und die Ausbeute als Prozentsatz des feuchten Lebergewebes berechnet.
    HINWEIS: Diese Ausbeute sollte angepasst werden, um die Aliquoten zu korrigieren, die in jedem Glykogengehaltsschritt eingenommen werden.
  2. Für die Glykogenreinheit ist der Glykogengehalt in den fertigen Pellets zu bestimmen, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Berechnen Sie die Reinheit als Prozentsatz des ermittelten Glykogengehalts im Verhältnis zur Rohausbeute (siehe Schritt 5.1).
  3. Für die Glykogenausbeute ist der Glykogengehalt der homogenisierten Proben ohne Kochen und vor jeder Zentrifugation zu bestimmen, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Die Glykogenausbeute wird als Prozentsatz des Glykogengehalts in den fertigen Pellets (siehe Schritt 5.2) zu dem im Ausgangshomogenat ermittelten Glykogengehalt berechnet.

6. Analyse der Kettenlängenverteilungen (Abbildung 4)

  1. Wiegen Sie 0,5 mg gefriergetrocknetes Glykogen in 1,5-ml-Röhrchen.
  2. 90 μl deionisiertes Wasser und 1,5 μl Natriumazid (0,04 g/ml) in die Röhrchen geben.
  3. Geben Sie 5 μl Essigsäurepuffer (0,1 m, pH 3,5) und 2 μl Isoamylase-Lösung (180 U/mg) in die Röhrchen, um das Glykogen zu entzweigen.
  4. Die Proben werden bei 37 °C für 3 h inkubiert.
  5. Geben Sie 5 μl Natronlauge (0,1 m) zu den Proben, um den pH-Wert auf 7,0 zu erhöhen.
  6. Die Proben werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht gefriergetrocknet (lyophilisiert).
  7. 2 μl APTS-Lösung (5 mg APTS in 50 μl 15%iger Eisessig) und 2 μl Natriumcyanoborhydrid (1 M) werden zum gefriergetrockneten entzweigten Glykogen gegeben.
  8. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.000 × g für 2 min.
  9. Die Proben werden bei 60 °C für 3 h im Dunkeln inkubiert.
    HINWEIS: Die Tube kann mit Aluminiumfolie abgedeckt werden, um den Inhalt vor Licht zu schützen.
  10. Geben Sie 200 μl deionisiertes Wasser zu den Proben und wirbeln Sie sie, bis sich der gesamte Niederschlag aufgelöst hat.
  11. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.000 × g für 2 min.
  12. Zur Analyse werden Aliquoten von 50 μl in Mikrofläschchen mit fluorophorunterstützter Kohlenhydratelektrophorese (FACE) überführt.
    ANMERKUNG: Die Daten werden als relative Häufigkeit von (entzweigten) Ketten (Nde(X)) für jeden Polymerisationsgrad (DP, Symbol X) angezeigt.

7. Analyse von Molekülgrößenverteilungen (Abbildung 5)

  1. 0,5 mg gefriergetrocknetes Glykogen werden in 50 mM Ammoniumnitrat und 0,02 % Natriumazid bei 1 mg/ml gelöst.
  2. Die Proben werden in einem Thermomischer bei 80 °C für 3 h bei 300 U/min inkubiert.
  3. Injizieren Sie die Proben in ein SEC-System mit einer Vorsäule und 1000 Å und 10.000 Å Säulen bei 80 °C und einer Flussrate von 0,3 ml/min (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie einen Brechungsindexdetektor, um das relative Gewicht der Moleküle bei jedem Elutionsvolumen zu bestimmen.
  4. Unter Verwendung von Pullulan-Standards (PSS) mit molaren Massen im Bereich von 342 bis 1,22 × 106 wird eine universelle SEC-Kalibrierkurve aufgetragen, um die Elutionszeit in R h (hydrodynamischer Radius) umzurechnen. Drücken Sie die Daten des DRI-Detektors (Differential Refractive Index) als SEC-Gewichtsverteilung w (log Rh) als Funktion von Rh aus.

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Ergebnisse

Während das oben beschriebene Verfahren für die optimalste Methode (30 % Saccharose unter Zugabe eines 10-minütigen Siedeschritts) gilt, werden hier Daten für Glykogen bereitgestellt, das über drei Saccharosekonzentrationen (30 %, 50 %, 72,5 %) mit und ohne Siedeschritt extrahiert wurde, wie zuvor beschrieben21. Gemäß dem Protokoll sind die Reinheit, die Rohausbeute und die Glykogenausbeute von trockenem Glykogen, das unter verschiedenen Bedingungen extrahiert wurde, in Tabelle 1 ...

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Diskussion

Frühere Studien haben gezeigt, dass die Struktur von Glykogen wichtig für seine Eigenschaften ist; Zum Beispiel beeinflusst die Molekülgröße die Abbaurate von Glykogen10 und die Verteilung der Kettenlänge seine Löslichkeit26. Um diese Zusammenhänge richtig zu verstehen, ist es wichtig, Glykogen mit einem Verfahren zu extrahieren, das so weit wie möglich eine repräsentative und unbeschädigte Probe isoliert. Traditionelle Extraktionsmethoden verwendeten entweder heiße alkalis...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Herrn Gaosheng Wu und Frau Yunwen Zhu für die technische Unterstützung bei FACE und Herrn Zhenxia Hu und Herrn Dengbin für die technische Unterstützung bei der SEC. MAS wird durch ein Advance Queensland Industry Research Fellowship, die Mater Foundation, Equity Trustees und die L G McCallam Est und George Weaber Trusts unterstützt. Diese Arbeit wurde durch das Priority Academic Program of Jiangsu Higher Education Institutions, ein Stipendium der Natural Science Foundation of China C1304013151101138 und das Jiangsu Innovation and Entrepreneurship Talents Program 2017 unterstützt. Die Abbildungen 1-5 wurden mit BioRender erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
8-Aminopyren-1,3,6-trisulfonat (APTS)SIGMA Aldrich93410,1 M Lösung
EssigsäureSIGMA Aldrich6950920,1 M, pH 3,5 Lösung
Agilent 1260 Infinity SEC System Agilent, Santa Clara, CA, USAGrößenausschlusschromatographie (SEC)
BKS-DB/Nju HintergrundmäuseNanjing Biomedizinische Forschungseinrichtung der Universität Nanjing
D-Glucose Assay Kit (GOPOD-Format)MegazymeK-GLUC
Ethylenedinitrilotetraessigsäure (EDTA)SIGMA Aldrich431788
HomogenisatorIKAT 25
SalzsäureSIGMA Aldrich21040,1 M Lösung
SalzsäureSIGMA Aldrich21040,1 M Lösung
P/ACE MDQ plus SystemAb Sciex, USFluorophor-unterstützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE)
Brechungsindex-DetektorOptilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)Größenausschlusschromatographie (SEC)
NatriumacetatSIGMA Aldrich2412451 M, pH 4,5 Lösung
NatriumazidSIGMA AldrichS2002
NatriumchloridSIGMA AldrichS9888
NatriumcyanoborohydridSIGMA Aldrich1561591 M Lösung
NatriumfluoridSIGMA Aldrich201154
NatriumhydroxidSIGMA Aldrich436170,1 M Lösung
NatriumnitratSIGMA AldrichNISTRM8569
NatriumpyrophosphatSIGMA Aldrich221368
SaccharoseSIGMA AldrichV90016
SUPREMA Vorsäule, 1.000 und 10.000 SäulenPolymer Standards Services, Mainz, DeutschlandGrößenausschlusschromatographie (SEC)
TrizmaSIGMA Aldrich T1503
UltrazentrifugenröhrchenBeckman4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Röhrchen, 11 x 60 mm

Referenzen

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